Name: dual-dye optical mapping of hearts from ryr2r2474s knock-in mice of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia
Uploaded: 2023-12-22T12:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia at JoVE.com

Questo studio è supportato dalla National Natural Science Foundation of China (81700308 a XO e 31871181 a ML e da 82270334 a XT), dal Programma di supporto alla scienza e alla tecnologia della provincia di Sichuan (CN) (da 2021YJ0206 a XO, 23ZYZYTS0433 e 2022YFS0607 a XT e da 2022NSFSC1602 a TC) e dal Laboratorio chiave statale per la chimica e l'ingegneria molecolare delle risorse medicinali (Guangxi Normal University) (da CMEMR2017-B08 a XO), MRC (G10031871181 a ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE a Oxford (ML) sovvenzioni.

Per gli esperimenti vengono utilizzati topi maschi di età compresa tra 10 e 14 settimane di età o topi RyR2-R2474S/+ (sfondo C57BL/6) del peso di 20-25 g. Tutte le procedure sono state approvate dal comitato per la cura e l'uso degli animali della Southwest Medical University, Sichuan, Cina (approvazione n.: 20160930) in conformità con le linee guida nazionali in base alle quali opera l'istituto.
1. Preparazione
<ol><li>Soluzioni di magazzino<ol><li>Soluzione mad...

<ol>
	<li>Priori, S. G., Chen, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherited+dysfunction+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++handling+and+arrhythmogenesis.">Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis.</a> Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).</li><li>Goddard, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+consequences+of+the+P2328S+mutation+in+the+ryanodine+receptor+(RyR2)+gene+in+genetically+modified+murine+hearts.">Physiological consequences of the P2328S mutation in the ryanodine receptor (RyR2) gene in genetically modified murine hearts.</a> Acta Physiologica. 194 (2), 123-140 (2008).</li><li>Sabir, I. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternans+in+genetically+modified+langendorff-perfused+murine+hearts+modeling+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Alternans in genetically modified langendorff-perfused murine hearts modeling catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Frontiers in Physiology. 1, 126 (2010).</li><li>Zhang, Y., Matthews, G. D., Lei, M., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+Ca2++homeostasis,+atrial+arrhythmogenesis,+and+sinus+node+dysfunction+in+murine+hearts+modeling+RyR2+modification.">Abnormal Ca2+ homeostasis, atrial arrhythmogenesis, and sinus node dysfunction in murine hearts modeling RyR2 modification.</a> Frontiers in Physiology. 4, 150 (2013).</li><li>Leenhardt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia+in+children.+A+7-year+follow-up+of+21+patients.">Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in children. A 7-year follow-up of 21 patients.</a> Circulation. 91 (5), 1512-1519 (1995).</li><li>Priori, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+cardiac+ryanodine+receptor+gene+(hRyR2)+underlie+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Circulation. 103 (2), 196-200 (2001).</li><li>Wehrens, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FKBP12.6+deficiency+and+defective+calcium+release+channel+(ryanodine+receptor)+function+linked+to+exercise-induced+sudden+cardiac+death.">FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death.</a> Cell. 113 (7), 829-840 (2003).</li><li>Novak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+abnormalities+in+iPSC-derived+cardiomyocytes+generated+from+CPVT1+and+CPVT2+patients+carrying+ryanodine+or+calsequestrin+mutations.">Functional abnormalities in iPSC-derived cardiomyocytes generated from CPVT1 and CPVT2 patients carrying ryanodine or calsequestrin mutations.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 2006-2018 (2015).</li><li>Napolitano, C., Mazzanti, A., Bloise, R., Priori, S. G., Adam, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CACNA1C-related+disorders.">CACNA1C-related disorders.</a> GeneReviews. , (1993).</li><li>Makita, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+calmodulin+mutations+associated+with+congenital+arrhythmia+susceptibility.">Novel calmodulin mutations associated with congenital arrhythmia susceptibility.</a> Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (4), 466-474 (2014).</li><li>Gomez-Hurtado, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+CPVT-associated+calmodulin+mutation+in+CALM3+(CALM3-A103V)+activates+arrhythmogenic+Ca+waves+and+sparks.">Novel CPVT-associated calmodulin mutation in CALM3 (CALM3-A103V) activates arrhythmogenic Ca waves and sparks.</a> Circulation, Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (8), (2016).</li><li>Wleklinski, M. J., Kannankeril, P. J., Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+tissue+mechanisms+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Molecular and tissue mechanisms of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Journal of Physiology. 598 (14), 2817-2834 (2020).</li><li>Neco, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradoxical+effect+of+increased+diastolic+Ca2++release+and+decreased+sinoatrial+node+activity+in+a+mouse+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Paradoxical effect of increased diastolic Ca2+ release and decreased sinoatrial node activity in a mouse model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Circulation. 126 (4), 392-401 (2012).</li><li>Bogdanov, K. Y., Vinogradova, T. M., Lakatta, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinoatrial+nodal+cell+ryanodine+receptor+and+Na(+)-Ca(2+)+exchanger:+molecular+partners+in+pacemaker+regulation.">Sinoatrial nodal cell ryanodine receptor and Na(+)-Ca(2+) exchanger: molecular partners in pacemaker regulation.</a> Circulation Research. 88 (12), 1254-1258 (2001).</li><li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ElectroMap:+High-throughput+open-source+software+for+analysis+and+mapping+of+cardiac+electrophysiology.">ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1389 (2019).</li><li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+of+optical+mapping+data+using+ElectroMap.">High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).</li><li>Choi, B. R., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+maps+of+optical+action+potentials+and+calcium+transients+in+guinea-pig+hearts:+mechanisms+underlying+concordant+alternans.">Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans.</a> Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).</li><li>Rybashlykov, D., Brennan, J., Lin, Z., Efimov, I. R., Syunyaev, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-source+low-cost+cardiac+optical+mapping+system.">Open-source low-cost cardiac optical mapping system.</a> PLoS One. 17 (3), 0259174 (2022).</li><li>Lucas-Lopez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+stereochemical+assignment+and+fluorescence+tuning+of+the+small+molecule+tool,+(-)-blebbistatin.">Absolute stereochemical assignment and fluorescence tuning of the small molecule tool, (-)-blebbistatin.</a> European Journal of Organic Chemistry. 2005 (9), 1736-1740 (2005).</li><li>Ponsaerts, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+II+ATPase+inhibitor+blebbistatin+prevents+thrombin-induced+inhibition+of+intercellular+calcium+wave+propagation+in+corneal+endothelial+cells.">The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 49 (11), 4816-4827 (2008).</li><li>Jou, C., Spitzer, K., Tristani-Firouzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+effectively+uncouples+the+excitation-contraction+process+in+zebrafish+embryonic+heart.">Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart.</a> Cellular Physiology &amp; Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).</li><li>Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+uncoupler+blebbistatin+is+associated+with+significant+electrophysiological+effects+in+the+isolated+rabbit+heart.">The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart.</a> Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).</li><li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+of+optical+mapping+data+using+ElectroMap.">High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dataset+of+dual+calcium+and+voltage+optical+mapping+in+healthy+and+hypertrophied+murine+hearts.">A dataset of dual calcium and voltage optical mapping in healthy and hypertrophied murine hearts.</a> Scientific Data. 8 (1), 314 (2021).</li><li>Lei, M., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+arrhythmogenesis:+a+tale+of+two+clocks.">Cardiac arrhythmogenesis: a tale of two clocks.</a> Cardiovascular Research. 116 (14), e205-e209 (2020).</li><li>Mal Baudot, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concomitant+genetic+ablation+of+L-type+Cav1.3+&#945;1D+and+T-type+Cav3.1+&#945;1G+Ca2++channels+disrupts+heart+automaticity.">Concomitant genetic ablation of L-type Cav1.3 &#945;1D and T-type Cav3.1 &#945;1G Ca2+ channels disrupts heart automaticity.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18906 (2020).</li><li>Dai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZO-1+regulates+intercalated+disc+composition+and+atrioventricular+node+conduction.">ZO-1 regulates intercalated disc composition and atrioventricular node conduction.</a> Circulation Research. 127 (2), e28-e43 (2020).</li><li>Glukhov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calsequestrin+2+deletion+causes+sinoatrial+node+dysfunction+and+atrial+arrhythmias+associated+with+altered+sarcoplasmic+reticulum+calcium+cycling+and+degenerative+fibrosis+within+the+mouse+atrial+pacemaker+complex1.">Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex1.</a> European Heart Journal. 36 (11), 686-697 (2015).</li><li>Torrente, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burst+pacemaker+activity+of+the+sinoatrial+node+in+sodium-calcium+exchanger+knockout+mice.">Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (31), 9769-9774 (2015).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+SK2+upregulation+following+angiotensin+II+challenge:+Modulation+by+p21-activated+kinase-1.">Ventricular SK2 upregulation following angiotensin II challenge: Modulation by p21-activated kinase-1.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 164, 110-125 (2022).</li><li>Dong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+dual+calcium-voltage+optical+mapping+in+murine+sinoatrial+preparation+with+optogenetic+pacing.">A protocol for dual calcium-voltage optical mapping in murine sinoatrial preparation with optogenetic pacing.</a> Frontiers in Physiology. 10, 954 (2019).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+transverse+cardiac+slicing+and+optical+mapping+in+murine+heart.">A protocol for transverse cardiac slicing and optical mapping in murine heart.</a> Frontiers in Physiology. 10, 755 (2019).</li><li>Hoeker, G. S., Katra, R. P., Wilson, L. D., Plummer, B. N., Laurita, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+calcium+release+in+tissue+from+the+failing+canine+heart.">Spontaneous calcium release in tissue from the failing canine heart.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1235-H1242 (2009).</li><li>Laurita, K. R., Singal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+action+potentials+and+calcium+transients+simultaneously+from+the+intact+heart.">Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 280 (5), H2053-H2060 (2001).</li><li>Johnson, P. L., Smith, W., Baynham, T. C., Knisley, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Errors+caused+by+combination+of+Di-4+ANEPPS+and+Fluo3/4+for+simultaneous+measurements+of+transmembrane+potentials+and+intracellular+calcium.">Errors caused by combination of Di-4 ANEPPS and Fluo3/4 for simultaneous measurements of transmembrane potentials and intracellular calcium.</a> Annals of Biomedical Engineering. 27 (4), 563-571 (1999).</li></ol>

Sulla base della nostra esperienza, le chiavi per una mappatura ottica a doppio colorante di successo di un cuore di topo includono una soluzione e un cuore ben preparati, il caricamento del colorante, il raggiungimento del miglior rapporto segnale/rumore e la riduzione dell'artefatto da movimento.
Preparazione della soluzione La soluzione di Krebs è essenziale per il successo di un esperimento sul cuore. Le soluzioni madre di MgCl 2 e CaCl2 (1 mol/L)...

Tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica (CPVT) si manifesta con episodi di tachicardia ventricolare polimorfica (PVT) a seguito di attività fisica, stress o provocazione di catecolamine, che possono degenerare in fibrillazione ventricolare potenzialmente fatale 1,2,3,4 . Recenti evidenze a seguito del suo primo rapporto come sindrome clinica nel 1995 implicavano mutazioni in sette geni, tutti coinvolti nel rilascio di Ca 2+ del reticolo sarcoplasmatico (SR) in questa condizione: il più frequentemente riportato RYR2 che codifica per il recettore 2 della rianodina (RyR2) dei canali di rilascio di Ca2+ 5,6, FKBP12.67, CASQ2 che codifica per la calsequestrina cardiaca8, TRDN che codificano per la proteina SR giunzionale triadina 9, e CALM19, CALM2 10 e CALM3 codificano in modo identico per calmodulina11,12. Questi pattern genotipici attribuiscono gli eventi aritmici al rilascio patologico non regolato del deposito di SR Ca2+12.
Il rilascio spontaneo di Ca 2+ da SR può essere rilevato come scintille di Ca 2+ o onde di Ca 2+, che attivano lo scambiatore Na+/Ca 2+ (NCX). Lo scambiatore di un Ca2+ per tre Na+ genera una corrente verso l'interno, che accelera la depolarizzazione diastolica e porta la tensione di membrana alla soglia del potenziale d'azione (AP). Nei topi knock-in di RyR2, l'aumento dell'attività di RyR2R4496C nel nodo senoatriale (SAN) porta a una diminuzione imprevista dell'automaticità di SAN da parte di Ca 2+-dipendente della deplezione di ICa,L e SR Ca2+ durante la diastole, identificando alterazioni fisiopatologiche subcellulari che contribuiscono alla disfunzione SAN nei pazienti con CPVT 13,14. L'insorgenza delle relative onde citosoliche di Ca 2+ dei cardiomiociti è più probabile a seguito di aumenti del [Ca2+] citosolico di fondo a seguito della sensibilizzazione a RyR da parte delle catecolamine, incluso l'isoproterenolo (ISO).
Cambiamenti cinetici dettagliati nella segnalazione di Ca 2+ a seguito del rilascio di Ca2+ mediato da RyR2 in risposta all'attivazione del potenziale d'azione (AP) che potrebbe essere la causa delle aritmie ventricolari osservate nei modelli cardiaci intatti di CPVT rimangono da determinare per l'intera gamma di genotipi RyR2 riportati12. Questo articolo presenta la configurazione della strumentazione e la procedura sperimentale per la mappatura ad alto rendimento dei segnali Ca2+ e dei potenziali transmembrana (Vm) in cuori murini wild-type (WT) ed eterozigoti RyR2-R2474S/+, combinati con la stimolazione elettrica programmata prima e dopo la sfida con isoproterenolo. Questo protocollo fornisce un metodo per lo studio meccanicistico della malattia CPVT in cuori di topo isolati.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m syringe filter</td>
			<td>Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To filter solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Pasteur pipette</td>
			<td>Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China</td>
			<td>00900026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>B. Braun Medical Inc.</td>
			<td>YZB/GER-5474-2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L PCR tube</td>
			<td>Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China</td>
			<td>F611541-0010</td>
			<td>Aliquote the stock solutions&#160; to avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td>Store Tyrode&#39;s solution at 4 &#176;C for follow-up heart isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>585/40 nm filter</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Filter for calcium signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>630 nm long-pass filter</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>G15604AJ</td>
			<td>Filter for voltage signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avertin (2,2,2-tribromoethanol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom</td>
			<td>T48402-100G</td>
			<td>To minimize suffering and pain reflex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States</td>
			<td>SLBV5564</td>
			<td>Excitation-contraction uncoupler to&#160; eliminate motion artifact during mapping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>SLBK1794V</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-made thermostatic bath</td>
			<td>MappingLab, United Kingdom</td>
			<td>TBC-2.1</td>
			<td>To keep temperature of perfusion solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>(RNBT7442)</td>
			<td>Solvent for dyes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China</td>
			<td>YAF030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ElectroMap software</td>
			<td>University of Birmingham</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Quantification of electrical parameters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States</td>
			<td>A18G150001</td>
			<td>Acquire images for optical signals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET525/36 sputter coated filter</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>319106</td>
			<td>Excitation filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>SLBT4811V</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium</td>
			<td>Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China</td>
			<td>(H51021209)</td>
			<td>To prevent blood clots in the coronary artery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Iris forceps</td>
			<td>Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China</td>
			<td>YAA010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States</td>
			<td>HY-B0468/CS-2582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>SLBS5003</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MacroLED</td>
			<td>Cairn Research, Faversham, United Kingdom</td>
			<td>7355/7356</td>
			<td>The excitation light of fluorescence probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MacroLED light source</td>
			<td>Cairn Research, Faversham, United Kingdom</td>
			<td>7352</td>
			<td>Control the LEDs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors</td>
			<td>Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China</td>
			<td>YBC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Optical signals sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>BCBS6841V</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICRO3-1401</td>
			<td>Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom</td>
			<td>M5337</td>
			<td>Connect the electrical stimulator and Spike2 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyoPacer EP field stimulator</td>
			<td>Ion Optix Co, Milton, MA, United States</td>
			<td>S006152</td>
			<td>Electric stimulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>SLBS2340V</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>BCBW9042</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>SLBX3605</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroLog System</td>
			<td>Digitimer</td>
			<td>NL905-229</td>
			<td>For ECG amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmapScope5</td>
			<td>MappingLab, United Kingdom</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Calcium alternans and arrhythmia analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic scissors</td>
			<td>Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China</td>
			<td>T4-3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptoSplit</td>
			<td>Cairn Research, Faversham, United Kingdom</td>
			<td>6970</td>
			<td>Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm&#160; simultaneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristalic pump</td>
			<td>Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,</td>
			<td>BT100-2J</td>
			<td>To pump the solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>TCD010060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F127</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, United States</td>
			<td>1899021</td>
			<td>To enhance the loading with Rhod2AM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RH237</td>
			<td>Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States</td>
			<td>1971387</td>
			<td>Voltage-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod-2 AM</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, United States</td>
			<td>1890519</td>
			<td>Calcium indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel tube</td>
			<td>Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,</td>
			<td>96402-16</td>
			<td>Connect with the peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture</td>
			<td>Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China</td>
			<td>20172650032</td>
			<td>To fix the aorta</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spike2</td>
			<td>Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To record and analyze ECG data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulation electrode</td>
			<td>MappingLab, United Kingdom</td>
			<td>SE1600-35-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T510lpxr</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>312461</td>
			<td>For light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T565lpxr</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>321343</td>
			<td>For light source</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual-dye optical mapping of hearts from ryr2r2474s knock-in mice of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia

La tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica (CPVT) si manifesta con episodi di tachicardia ventricolare polimorfa a seguito di attività fisica, stress o provocazione di catecolamine, che possono deteriorarsi in fibrillazione ventricolare potenzialmente fatale. Il cuore di topo è una specie molto diffusa per la modellazione di malattie aritmiche cardiache ereditarie, tra cui la CPVT. La mappatura ottica simultanea del potenziale transmembrana (Vm) e dei transienti di calcio (CaT) da cuori di topo perfusi con Langendorff ha il potenziale per chiarire i meccanismi alla base dell'aritmogenesi. Rispetto all'indagine a livello cellulare, la tecnica di mappatura ottica può testare alcuni parametri elettrofisiologici, come la determinazione dell'attivazione, la velocità di conduzione, la durata del potenziale d'azione e la durata del CaT. Questo articolo presenta la configurazione della strumentazione e la procedura sperimentale per la mappatura ottica ad alto rendimento di CaT e Vm in cuori murini wild-type ed eterozigoti RyR2-R2474S/+, combinati con la stimolazione elettrica programmata prima e durante la sfida con isoproterenolo. Questo approccio ha dimostrato un metodo fattibile e affidabile per lo studio meccanicistico della malattia CPVT in una preparazione cardiaca di topo ex vivo.

La mappatura ottica è stata un approccio popolare nello studio delle aritmie cardiache complesse nell'ultimo decennio. La configurazione di mappatura ottica è costituita da una telecamera EMCCD, che fornisce una frequenza di campionamento fino a 1.000 Hz e una risoluzione spaziale di 74 x 74 μm per ogni pixel. Consente un rapporto segnale-rumore piuttosto elevato durante il campionamento del segnale (Figura 1). Una volta che il cuore perfuso di Langendorff raggiunge uno stato stabile e il...

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Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia

Questo protocollo introduce la mappatura ottica a doppio colorante di cuori di topo ottenuti da animali wild-type e knock-in affetti da tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica, comprese le misurazioni elettrofisiologiche del voltaggio transmembrana e dei transitori intracellulari di Ca2+ con un'elevata risoluzione temporale e spaziale.

Mappatura ottica a doppio colorante di cuori da topi knock-in RyR2R2474S di tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica

The pro-arrhythmic cardiac disorder catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) manifests as polymorphic ventricular tachycardia episodes ...

Questo metodo ci aiuterà a rivelare le proprietà e i meccanismi elettrofisiologici degli strisci di arresto ventricolare associati a malattie come la tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica. Utilizzando questa tecnica, possiamo ottenere il potenziale di membrana e i segnali intercellulari del calcio simultaneamente nell'ambito di vari protocolli di stimolazione elettrica programmata, il che è particolarmente adatto per esplorare i meccanismi e le dinamiche alla base della malattia aritmica cardiaca come la CPVT. Per eseguire con successo questo esperimento, assicurati di avere un cuore ben perfuso, un corretto caricamento del colorante, il disaccoppiamento eccitazione-contrazione e un'attenta impostazione della fotocamera.Per iniziare, impostare il sistema di mappatura ottica e accendere la fotocamera per una temperatura di campionamento stabile a meno 50 gradi Celsius. Mettere il cuore di topo raccolto nella soluzione fredda di CREB per rallentare il metabolismo e proteggere il cuore. Rimuovere il tessuto circostante dell'aorta.Usa un ago cannulante su misura per incannularlo e fissalo con una sutura di seta 4-0. Ora perfondere il cuore con il sistema Langendorff a una velocità costante da 3,5 a 4,0 millilitri al minuto. Inserire un tubicino di plastica nel ventricolo sinistro per rilasciare la congestione di soluzione nella camera per evitare un precarico eccessivo e fissare il tubo di plastica nell'ago cannulante.Quindi inserire due cavi nel perfuso nella vasca da bagno e accendere le alimentazioni per la scatola dell'amplificatore dell'elettrocardiogramma e il controller della stimolazione elettrica. Successivamente, avviare l'elettrocardiogramma o il software ECG di riferimento e monitorare continuamente l'ECG. Eseguire i passaggi successivi al buio quando il cuore raggiunge una condizione di stato stabile.Perfondere costantemente la miscela di soluzione di blebbistatina CREBs nel cuore per 10 minuti per disaccoppiare la contrazione dall'eccitazione ed evitare artefatti di contrazione durante le riprese. Quindi, usando una torcia rossa, esamina il cuore per confermare la completa cessazione delle contrazioni. Perfondere il cuore con la soluzione di lavoro Rhod-2 AM per 15 minuti nel sistema di perfusione Langendorff dopo aver disaccoppiato la contrazione dell'eccitazione.Mantenere l'apporto di ossigeno durante il caricamento intracellulare del colorante di calcio. Per evitare la formazione di bolle dal pluronico F-127, inserire una trappola per bolle nel sistema di perfusione. Diluire 10 microlitri di soluzione madre RH 237 in 50 millilitri di perfuso e caricare per 10 minuti.Dopo aver completato il doppio caricamento del colorante, scatta una sequenza di foto. Verificare che i segnali di tensione e calcio siano adeguati per l'analisi. Accendere i due LED per le luci di eccitazione e regolarne l'intensità su un intervallo appropriato.Posiziona il cuore sotto il dispositivo di rilevamento, assicurandoti che sia ben illuminato dai due LED che regolano il diametro del punto luminoso a due centimetri. Impostare la distanza di lavoro tra l'obiettivo e il cuore a 10 centimetri per ottenere la frequenza di campionamento e la risoluzione spaziale desiderate. Aprire il software di campionamento del segnale per controllare contemporaneamente la telecamera e acquisire i segnali di tensione e calcio.Avviare lo stimolatore di campo MyoPacer e impostare il modello di stimolazione sulla logica del transistor a transistor con due millisecondi di durata del ritmo per impulso. Impostare l'intensità iniziale a 0,3 volt. Posizionare una coppia di elettrodi di platino attaccati all'epicardio dell'apice del ventricolo sinistro.Applicare 30 stimoli consecutivi S1 a 10 hertz per testare la soglia di tensione diastolica del cuore utilizzando il software di registrazione ECG. Aumentare gradualmente l'ampiezza della tensione fino a ottenere l'acquisizione uno-a-uno. Implementare il protocollo S1-S1 per misurare il calcio o le alternative del potenziale d'azione e le proprietà di restituzione.Regolare il cuore consecutivamente partendo da una durata del ciclo di base di 100 millisecondi. Diminuire la durata del ciclo di 10 millisecondi in ogni sequenza successiva fino a raggiungere i 50 millisecondi. Avviare contemporaneamente la mappatura ottica prima della stimolazione.Per misurare il periodo refrattario effettivo ventricolare utilizzando il protocollo di stimolo S1-S2, iniziare con una durata del ciclo di stimolazione S1-S1 di 100 millisecondi. Accoppiare S2 a 60 millisecondi e diminuire con un decremento a passi di due millisecondi fino a quando S2 non riesce a catturare il complesso QRS ectopico. Per l'induzione dell'aritmia, somministrare una stimolazione perpetua a 50 hertz ed eseguire lo stesso episodio di stimolazione dopo aver atteso un intervallo di due secondi di riposo.Monitorare attentamente le registrazioni dell'elettrocardiogramma durante il periodo di stimolazione continua ad alta frequenza per iniziare prontamente le registrazioni simultanee di mappatura ottica quando viene generata un'onda aritmica interessante. Procedere all'acquisizione di immagini utilizzando la fotocamera del dispositivo ad accoppiamento di carica a moltiplicazione di elettroni. Nel software di acquisizione delle immagini, premere Seleziona cartella e caricare le immagini per avviare il processo di analisi semiautomatica dei dati video massivi.Immettere i parametri di campionamento corretti per l'analisi. Impostare manualmente la soglia dell'immagine e selezionare l'area di interesse. Applicare un filtro spaziale gaussiano di tre x tre pixel, un filtro Savitzky-Golay e una correzione della linea di base con cappello a cilindro.Quindi premere Elabora immagini per rimuovere la linea di base e calcolare i parametri elettrofisiologici come APD-80 e CATD-50. Impostare il tempo di inizio della durata del potenziale d'azione al picco e il punto terminale all'80% di ripolarizzazione per il calcolo dell'APD-80. Allo stesso modo, definisci il tempo di inizio della durata transitoria del calcio come il picco con il punto terminale che è l'80%rilassamento.Vengono mostrate le tracce tipiche nelle mappe di calore di APD-80 e CATD-80. L'isoproterenolo accorcia l'APD-80 e la tachicardia ventricolare polimorfa wild type e catecolaminergica o i topi CPVT, ma non è stata riscontrata alcuna differenza dopo la sfida con isoproterenolo. I topi CATD-80 e CPVT erano più lunghi rispetto al tipo selvatico dopo la sfida con isoproterenolo, mentre non c'era alcun significato prima del trattamento.Secondo i segnali di tensione, i cuori wild type e CPVT possedevano la stessa capacità di conduzione attraverso l'epicardio al basale e dopo l'intervento con isoproterenolo. Le mappe termiche hanno dimostrato che i topi CPVT hanno la stessa capacità di conduzione dei topi wild-type prima e dopo la sfida con isoproterenolo. L'analisi delle alternative di ampiezza del calcio ha mostrato che i segnali di calcio nei cuori wild-type sono rimasti stabili al basale durante la stimolazione consecutiva S1-S1 a 14,29 e 16,67 hertz, mentre i cuori CPVT hanno mostrato alternative dipendenti dalla frequenza.Dopo la sfida con isoproterenolo, i cuori CPVT hanno mostrato alternative dipendenti dalla frequenza e segnale di calcio durante la stimolazione S1-S1, mentre i cuori wild-type non sono stati influenzati. L'analisi dell'aritmia tachiforme ha suggerito che sia i cuori wild type che quelli CPVT mostrano una conduzione normale durante la stimolazione a raffica a 50 hertz al basale. Dopo la profusione con isoproterenolo, i cuori CPVT hanno mostrato rotori ad alta frequenza dopo una stimolazione a raffica a 50 hertz, mentre i cuori wild-type hanno mantenuto una conduzione normale.Seguendo questa procedura, i tipi di adogen e i topi wild-type vengono utilizzati per illustrare le proprietà elettrofisiologiche e funzionali in questi modelli o nell'invenzione di farmaci. La mappatura ottica è uno strumento potente per lo studio delle aritmie cardiache, tuttavia non può essere utilizzata clinicamente a causa della limitazione del colorante fluorescente sotto il disaccoppiamento della contrazione di eccitazione. Con lo sviluppo di fluorescenti propri per diverse molecole bersaglio nell'ambito dello sviluppo della tecnologia di calcolo ad alta rivoluzione, la tecnica di mappatura ottica cardiaca è destinata a raggiungere solo applicazioni.

Research

JoVE Journal

Biology

Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia

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Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

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