Name: dual-dye optical mapping of hearts from ryr2r2474s knock-in mice of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia
Uploaded: 2023-12-22T12:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia at JoVE.com

本研究は、中国国家自然科学基金会(81700308からXOに、31871181からML、82270334からXTに)、四川省科学技術支援プログラム(CN)(2021YJ0206からXO、23ZYZYTS0433、2022YFS0607からXT、2022NSFSC1602からTC)、広西師範大学薬用資源化学分子工学国家重点実験室(CMEMR2017-B08からXO)、 MRC(G10031871181からML02647、G1002082、ML)、BHF(PG/14/80/31106、PG/16/67/32340、PG/12/21/29473、PG/11/59/29004 ML)、BHF CRE at Oxford(ML)助成金。

実験には、体重20〜25gの10〜14週齢の雄の野生型マウスまたはRyR2-R2474S/+マウス(C57BL/6バックグラウンド)を使用します。すべての手順は、中国四川省の西南医科大学の動物管理および使用委員会(承認番号:20160930)によって承認されており、機関が運営する国のガイドラインに準拠しています。
1. 事前準備
<ol><li>ストックソリューション<ol><li>ブレビスタ?...

<ol>
	<li>Priori, S. G., Chen, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherited+dysfunction+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++handling+and+arrhythmogenesis.">Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis.</a> Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).</li><li>Goddard, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+consequences+of+the+P2328S+mutation+in+the+ryanodine+receptor+(RyR2)+gene+in+genetically+modified+murine+hearts.">Physiological consequences of the P2328S mutation in the ryanodine receptor (RyR2) gene in genetically modified murine hearts.</a> Acta Physiologica. 194 (2), 123-140 (2008).</li><li>Sabir, I. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternans+in+genetically+modified+langendorff-perfused+murine+hearts+modeling+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Alternans in genetically modified langendorff-perfused murine hearts modeling catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Frontiers in Physiology. 1, 126 (2010).</li><li>Zhang, Y., Matthews, G. D., Lei, M., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+Ca2++homeostasis,+atrial+arrhythmogenesis,+and+sinus+node+dysfunction+in+murine+hearts+modeling+RyR2+modification.">Abnormal Ca2+ homeostasis, atrial arrhythmogenesis, and sinus node dysfunction in murine hearts modeling RyR2 modification.</a> Frontiers in Physiology. 4, 150 (2013).</li><li>Leenhardt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia+in+children.+A+7-year+follow-up+of+21+patients.">Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in children. A 7-year follow-up of 21 patients.</a> Circulation. 91 (5), 1512-1519 (1995).</li><li>Priori, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+cardiac+ryanodine+receptor+gene+(hRyR2)+underlie+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Circulation. 103 (2), 196-200 (2001).</li><li>Wehrens, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FKBP12.6+deficiency+and+defective+calcium+release+channel+(ryanodine+receptor)+function+linked+to+exercise-induced+sudden+cardiac+death.">FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death.</a> Cell. 113 (7), 829-840 (2003).</li><li>Novak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+abnormalities+in+iPSC-derived+cardiomyocytes+generated+from+CPVT1+and+CPVT2+patients+carrying+ryanodine+or+calsequestrin+mutations.">Functional abnormalities in iPSC-derived cardiomyocytes generated from CPVT1 and CPVT2 patients carrying ryanodine or calsequestrin mutations.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 2006-2018 (2015).</li><li>Napolitano, C., Mazzanti, A., Bloise, R., Priori, S. G., Adam, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CACNA1C-related+disorders.">CACNA1C-related disorders.</a> GeneReviews. , (1993).</li><li>Makita, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+calmodulin+mutations+associated+with+congenital+arrhythmia+susceptibility.">Novel calmodulin mutations associated with congenital arrhythmia susceptibility.</a> Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (4), 466-474 (2014).</li><li>Gomez-Hurtado, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+CPVT-associated+calmodulin+mutation+in+CALM3+(CALM3-A103V)+activates+arrhythmogenic+Ca+waves+and+sparks.">Novel CPVT-associated calmodulin mutation in CALM3 (CALM3-A103V) activates arrhythmogenic Ca waves and sparks.</a> Circulation, Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (8), (2016).</li><li>Wleklinski, M. J., Kannankeril, P. J., Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+tissue+mechanisms+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Molecular and tissue mechanisms of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Journal of Physiology. 598 (14), 2817-2834 (2020).</li><li>Neco, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradoxical+effect+of+increased+diastolic+Ca2++release+and+decreased+sinoatrial+node+activity+in+a+mouse+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Paradoxical effect of increased diastolic Ca2+ release and decreased sinoatrial node activity in a mouse model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Circulation. 126 (4), 392-401 (2012).</li><li>Bogdanov, K. Y., Vinogradova, T. M., Lakatta, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinoatrial+nodal+cell+ryanodine+receptor+and+Na(+)-Ca(2+)+exchanger:+molecular+partners+in+pacemaker+regulation.">Sinoatrial nodal cell ryanodine receptor and Na(+)-Ca(2+) exchanger: molecular partners in pacemaker regulation.</a> Circulation Research. 88 (12), 1254-1258 (2001).</li><li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ElectroMap:+High-throughput+open-source+software+for+analysis+and+mapping+of+cardiac+electrophysiology.">ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1389 (2019).</li><li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+of+optical+mapping+data+using+ElectroMap.">High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).</li><li>Choi, B. R., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+maps+of+optical+action+potentials+and+calcium+transients+in+guinea-pig+hearts:+mechanisms+underlying+concordant+alternans.">Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans.</a> Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).</li><li>Rybashlykov, D., Brennan, J., Lin, Z., Efimov, I. R., Syunyaev, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-source+low-cost+cardiac+optical+mapping+system.">Open-source low-cost cardiac optical mapping system.</a> PLoS One. 17 (3), 0259174 (2022).</li><li>Lucas-Lopez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+stereochemical+assignment+and+fluorescence+tuning+of+the+small+molecule+tool,+(-)-blebbistatin.">Absolute stereochemical assignment and fluorescence tuning of the small molecule tool, (-)-blebbistatin.</a> European Journal of Organic Chemistry. 2005 (9), 1736-1740 (2005).</li><li>Ponsaerts, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+II+ATPase+inhibitor+blebbistatin+prevents+thrombin-induced+inhibition+of+intercellular+calcium+wave+propagation+in+corneal+endothelial+cells.">The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 49 (11), 4816-4827 (2008).</li><li>Jou, C., Spitzer, K., Tristani-Firouzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+effectively+uncouples+the+excitation-contraction+process+in+zebrafish+embryonic+heart.">Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart.</a> Cellular Physiology &amp; Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).</li><li>Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+uncoupler+blebbistatin+is+associated+with+significant+electrophysiological+effects+in+the+isolated+rabbit+heart.">The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart.</a> Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).</li><li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+of+optical+mapping+data+using+ElectroMap.">High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dataset+of+dual+calcium+and+voltage+optical+mapping+in+healthy+and+hypertrophied+murine+hearts.">A dataset of dual calcium and voltage optical mapping in healthy and hypertrophied murine hearts.</a> Scientific Data. 8 (1), 314 (2021).</li><li>Lei, M., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+arrhythmogenesis:+a+tale+of+two+clocks.">Cardiac arrhythmogenesis: a tale of two clocks.</a> Cardiovascular Research. 116 (14), e205-e209 (2020).</li><li>Mal Baudot, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concomitant+genetic+ablation+of+L-type+Cav1.3+&#945;1D+and+T-type+Cav3.1+&#945;1G+Ca2++channels+disrupts+heart+automaticity.">Concomitant genetic ablation of L-type Cav1.3 &#945;1D and T-type Cav3.1 &#945;1G Ca2+ channels disrupts heart automaticity.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18906 (2020).</li><li>Dai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZO-1+regulates+intercalated+disc+composition+and+atrioventricular+node+conduction.">ZO-1 regulates intercalated disc composition and atrioventricular node conduction.</a> Circulation Research. 127 (2), e28-e43 (2020).</li><li>Glukhov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calsequestrin+2+deletion+causes+sinoatrial+node+dysfunction+and+atrial+arrhythmias+associated+with+altered+sarcoplasmic+reticulum+calcium+cycling+and+degenerative+fibrosis+within+the+mouse+atrial+pacemaker+complex1.">Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex1.</a> European Heart Journal. 36 (11), 686-697 (2015).</li><li>Torrente, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burst+pacemaker+activity+of+the+sinoatrial+node+in+sodium-calcium+exchanger+knockout+mice.">Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (31), 9769-9774 (2015).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+SK2+upregulation+following+angiotensin+II+challenge:+Modulation+by+p21-activated+kinase-1.">Ventricular SK2 upregulation following angiotensin II challenge: Modulation by p21-activated kinase-1.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 164, 110-125 (2022).</li><li>Dong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+dual+calcium-voltage+optical+mapping+in+murine+sinoatrial+preparation+with+optogenetic+pacing.">A protocol for dual calcium-voltage optical mapping in murine sinoatrial preparation with optogenetic pacing.</a> Frontiers in Physiology. 10, 954 (2019).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+transverse+cardiac+slicing+and+optical+mapping+in+murine+heart.">A protocol for transverse cardiac slicing and optical mapping in murine heart.</a> Frontiers in Physiology. 10, 755 (2019).</li><li>Hoeker, G. S., Katra, R. P., Wilson, L. D., Plummer, B. N., Laurita, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+calcium+release+in+tissue+from+the+failing+canine+heart.">Spontaneous calcium release in tissue from the failing canine heart.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1235-H1242 (2009).</li><li>Laurita, K. R., Singal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+action+potentials+and+calcium+transients+simultaneously+from+the+intact+heart.">Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 280 (5), H2053-H2060 (2001).</li><li>Johnson, P. L., Smith, W., Baynham, T. C., Knisley, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Errors+caused+by+combination+of+Di-4+ANEPPS+and+Fluo3/4+for+simultaneous+measurements+of+transmembrane+potentials+and+intracellular+calcium.">Errors caused by combination of Di-4 ANEPPS and Fluo3/4 for simultaneous measurements of transmembrane potentials and intracellular calcium.</a> Annals of Biomedical Engineering. 27 (4), 563-571 (1999).</li></ol>

私たちの経験から、マウスの心臓の二重色素光学マッピングを成功させるための鍵は、十分に準備された溶液と心臓、色素のローディング、最高のS/N比の達成、およびモーションアーチファクトの低減です。
溶液の調製 クレブス溶液は、心臓実験を成功させるために不可欠です。MgCl 2 と CaCl2 の原液 (1 mol/L) は、Mg 2+ と Ca2+ が CO3<su...

遺伝性心疾患カテコールアミン作動性多形性心室頻拍 (CPVT) は、身体活動、ストレス、またはカテコールアミンの挑戦に続く多形性心室頻拍 (PVT) エピソードとして現れ、致命的な心室細動に悪化する可能性があります 1,2,3,4 .1995年に臨床症候群として最初に報告された最近の証拠は、この状態での筋小胞体(SR)ストアCa2+放出に関与する7つの遺伝子の変異に関与しています:最も頻繁に報告されているCa 2+放出チャネル5,6、FKBP12.67、心臓カルセクエトリン8をコードするCASQ2、TRDNのリアノジン受容体2(RyR2)をコードするRYR2接合部SRタンパク質トリアジン9をコードし、CALM1 9、CALM2 10、およびCALM3をコードするカルモジュリン11,12をコードする。 これらの遺伝子型パターンは、不整脈事象をSR貯蔵Ca2+12の無秩序な病理学的放出に起因させる。
SRからの自発的なCa2+放出は、Ca2+スパークまたはCa2+波として検出され、Na+/Ca2+交換体(NCX)を活性化します。1つのCa2+を3つのNa+に交換すると、内向きの電流が発生し、拡張期の脱分極が加速し、膜電圧が活動電位(AP)の閾値まで上昇します。RyR2ノックインマウスでは、洞房リンパ節(SAN)におけるRyR2R4496Cの活性の増加により、拡張期のCa、LおよびSR Ca2+の枯渇のCa2+依存性の減少によるSANの自動性の予期せぬ低下が起こり、CPVT患者のSAN機能障害に寄与する細胞内病態生理学的変化が特定されました13,14。関連する心筋細胞細胞質Ca2+波の発生は、イソプロテレノール(ISO)を含むカテコールアミンによるRyR感作後のバックグラウンド細胞質[Ca2+]の増加に続いてより可能性が高くなります。
無傷の心臓CPVTモデルで観察された心室性不整脈の原因である可能性のある活動電位(AP)活性化に応答したRyR2を介したCa2+放出後のCa2+シグナル伝達の詳細な動態変化は、報告されたRyR2遺伝子型の全範囲について決定されるべきです12。この論文では、マウス野生型(WT)およびヘテロ接合体RyR2-R2474S/+心臓におけるCa2+シグナルと膜貫通電位(Vm)のハイスループットマッピングのための装置セットアップと実験手順を、イソプロテレノールチャレンジの前後のプログラムされた電気的ペーシングと組み合わせて紹介します。このプロトコルは隔離されたマウス中心のCPVTの病気のメカニズムの調査に方法を提供する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m syringe filter</td>
			<td>Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To filter solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Pasteur pipette</td>
			<td>Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China</td>
			<td>00900026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>B. Braun Medical Inc.</td>
			<td>YZB/GER-5474-2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L PCR tube</td>
			<td>Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China</td>
			<td>F611541-0010</td>
			<td>Aliquote the stock solutions&#160; to avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td>Store Tyrode&#39;s solution at 4 &#176;C for follow-up heart isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>585/40 nm filter</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Filter for calcium signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>630 nm long-pass filter</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>G15604AJ</td>
			<td>Filter for voltage signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avertin (2,2,2-tribromoethanol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom</td>
			<td>T48402-100G</td>
			<td>To minimize suffering and pain reflex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States</td>
			<td>SLBV5564</td>
			<td>Excitation-contraction uncoupler to&#160; eliminate motion artifact during mapping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>SLBK1794V</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-made thermostatic bath</td>
			<td>MappingLab, United Kingdom</td>
			<td>TBC-2.1</td>
			<td>To keep temperature of perfusion solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>(RNBT7442)</td>
			<td>Solvent for dyes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China</td>
			<td>YAF030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ElectroMap software</td>
			<td>University of Birmingham</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Quantification of electrical parameters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States</td>
			<td>A18G150001</td>
			<td>Acquire images for optical signals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET525/36 sputter coated filter</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>319106</td>
			<td>Excitation filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>SLBT4811V</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium</td>
			<td>Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China</td>
			<td>(H51021209)</td>
			<td>To prevent blood clots in the coronary artery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Iris forceps</td>
			<td>Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China</td>
			<td>YAA010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States</td>
			<td>HY-B0468/CS-2582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>SLBS5003</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MacroLED</td>
			<td>Cairn Research, Faversham, United Kingdom</td>
			<td>7355/7356</td>
			<td>The excitation light of fluorescence probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MacroLED light source</td>
			<td>Cairn Research, Faversham, United Kingdom</td>
			<td>7352</td>
			<td>Control the LEDs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors</td>
			<td>Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China</td>
			<td>YBC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Optical signals sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>BCBS6841V</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICRO3-1401</td>
			<td>Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom</td>
			<td>M5337</td>
			<td>Connect the electrical stimulator and Spike2 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyoPacer EP field stimulator</td>
			<td>Ion Optix Co, Milton, MA, United States</td>
			<td>S006152</td>
			<td>Electric stimulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>SLBS2340V</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>BCBW9042</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>SLBX3605</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroLog System</td>
			<td>Digitimer</td>
			<td>NL905-229</td>
			<td>For ECG amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmapScope5</td>
			<td>MappingLab, United Kingdom</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Calcium alternans and arrhythmia analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic scissors</td>
			<td>Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China</td>
			<td>T4-3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptoSplit</td>
			<td>Cairn Research, Faversham, United Kingdom</td>
			<td>6970</td>
			<td>Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm&#160; simultaneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristalic pump</td>
			<td>Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,</td>
			<td>BT100-2J</td>
			<td>To pump the solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>TCD010060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F127</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, United States</td>
			<td>1899021</td>
			<td>To enhance the loading with Rhod2AM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RH237</td>
			<td>Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States</td>
			<td>1971387</td>
			<td>Voltage-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod-2 AM</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, United States</td>
			<td>1890519</td>
			<td>Calcium indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel tube</td>
			<td>Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,</td>
			<td>96402-16</td>
			<td>Connect with the peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture</td>
			<td>Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China</td>
			<td>20172650032</td>
			<td>To fix the aorta</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spike2</td>
			<td>Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To record and analyze ECG data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulation electrode</td>
			<td>MappingLab, United Kingdom</td>
			<td>SE1600-35-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T510lpxr</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>312461</td>
			<td>For light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T565lpxr</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>321343</td>
			<td>For light source</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual-dye optical mapping of hearts from ryr2r2474s knock-in mice of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia

不整脈誘発性心疾患であるカテコールアミン作動性多形性心室頻拍(CPVT)は、身体活動、ストレス、またはカテコールアミンチャレンジ後の多形性心室頻拍エピソードとして現れ、致命的な心室細動に悪化する可能性があります。マウスの心臓は、CPVTを含む遺伝性不整脈疾患のモデル化に広く用いられている種です。ランゲンドルフ灌流マウス心臓の膜貫通電位(Vm)とカルシウム過渡現象(CaT)の同時光学マッピングは、不整脈発生のメカニズムを解明する可能性を秘めています。細胞レベルの調査と比較して、光学マッピング技術は、活性化、伝導速度、活動電位持続時間、CaT持続時間の決定など、いくつかの電気生理学的パラメータをテストできます。この論文では、マウス野生型およびヘテロ接合体RyR2-R2474S/+心臓におけるCaTおよびVmのハイスループット光学マッピングのための装置セットアップと実験手順を、イソプロテレノールチャレンジの前および最中にプログラムされた電気ペーシングと組み合わせて紹介します。このアプローチは、ex vivoマウスの心臓調製物におけるCPVT疾患を機構的に研究するための実行可能で信頼性の高い方法を実証しました。

光学マッピングは、過去10年間、複雑な不整脈を研究する上で一般的なアプローチでした。光学マッピングのセットアップはEMCCDカメラで構成されており、各ピクセルで最大1,000Hzのサンプリングレートと74 x 74 μmの空間分解能を提供します。これにより、信号サンプリング時にかなり高い信号対雑音比が可能になります(図1)。ランゲンドルフ灌流された心臓が安定した状...

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Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia

このプロトコルは、高い時間的および空間的分解能の膜貫通電圧および細胞内Ca2+ トランジェントの電気生理学的測定を含む、カテコールアミン作動性多形心室頻拍の影響を受けた野生型およびノックイン動物から得られるマウス心臓の二重染料光学マッピングを導入します。

カテコールアミン作動性多形性心室頻拍の RyR2R2474S ノックインマウスの心臓の二重色素光学マッピング

The pro-arrhythmic cardiac disorder catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) manifests as polymorphic ventricular tachycardia episodes ...

この方法は、カテコールアミン作動性多形性心室頻拍などの疾患に関連する心室停止塗抹標本の電気生理学的特性とメカニズムを明らかにするのに役立ちます。この技術を用いることで、様々なプログラムされた電気ペーシングプロトコルで膜電位と細胞間カルシウムシグナルを同時に得ることができ、CPVTなどの不整脈疾患の根底にあるメカニズムや動態を探るのに特に適しています。この実験を成功させるには、心臓の灌流が良好であること、適切な色素のローディング、励起収縮のアンカップリング、および慎重なカメラ設定が必要です。まず、光学マッピングシステムをセットアップし、カメラの電源を入れて、摂氏マイナス50度の安定したサンプリング温度を実現します。採取したマウスの心臓を冷たいCREB溶液に入れて、代謝を遅らせ、心臓を保護します。大動脈の周囲の組織を取り除きます。カスタムメイドのカニューレ針を使用してカニューレを挿入し、4-0シルク縫合糸で固定します。次に、毎分3.5〜4.0ミリリットルの一定速度でランゲンドルフシステムを使用して心臓を灌流します。小さなプラスチックチューブを左心室に挿入してチャンバー内の溶液のうっ血を解放し、過負荷を回避し、プラスチックチューブをカニューレ挿入針に固定します。次に、2本のリード線をバスの灌流液に入れ、心電図増幅器ボックスと電気刺激コントローラーの電源をオンにします。次に、参照される心電図またはECGソフトウェアを起動し、ECGを継続的に監視します。心臓が安定した状態に達したら、暗闇の中で次のステップを実行します。ブレビスタチンCREBs溶液混合物を心臓に10分間絶えず灌流して、収縮と興奮を切り離し、撮影中の収縮アーチファクトを回避します。次に、赤い懐中電灯を使用して心臓を調べ、収縮が完全に停止することを確認します。励起収縮を切り離した後、ランゲンドルフ灌流システムでRhod-2 AM作業溶液で心臓を15分間灌流します。細胞内カルシウム色素のローディング中に酸素供給を維持します。プルロニックF-127による気泡形成を防ぐために、気泡トラップを灌流システムに挿入します。10マイクロリットルのRH 237ストック溶液を50ミリリットルの灌流液に希釈し、10分間ロードします。デュアル染料のローディングが完了したら、一連の写真をキャプチャします。電圧信号とカルシウム信号が解析に適していることを確認してください。励起光用の2つのLEDを点灯させ、その強度を適切な範囲に調整します。心臓を検出装置の下に置き、光点の直径を2センチメートルに調整する2つのLEDによって心臓が十分に照らされていることを確認します。レンズと心臓の間の作動距離を10センチメートルに設定して、目的のサンプリングレートと空間分解能を実現します。信号サンプリングソフトウェアを開き、カメラの制御と電圧信号とカルシウム信号のキャプチャを同時に行います。MyoPacer Field Stimulator を起動し、ペーシングパターンをトランジスタトランジスタロジックに設定し、パルスごとに 2 ミリ秒のペーシング期間を設定します。初期強度を 0.3 ボルトに設定します。左心室の心外膜に取り付けられた一対の白金電極を配置します。10ヘルツのS1刺激を30回連続して適用し、ECG記録ソフトウェアを使用して心臓の拡張期電圧しきい値をテストします。1対1のキャプチャが得られるまで、電圧振幅を徐々に増やします。S1-S1プロトコルを実装して、カルシウムまたは活動電位の代替物と反発特性を測定します。100ミリ秒の基本サイクル長から順番に心臓のペースを刻みます。サイクル長が 50 ミリ秒に達するまで、後続の各シーケンスで 10 ミリ秒ずつ減らします。刺激の前に同時に光学マッピングを開始します。S1-S2刺激プロトコルを使用して心室有効耐火期間を測定するには、S1-S1ペーシングサイクル長を100ミリ秒から開始します。S2を60ミリ秒で結合し、S2が異所性QRS複合体を捕捉できなくなるまで、2ミリ秒刻みで減少させます。不整脈誘発の場合は、50ヘルツバーストペーシングを永続的に投与し、2秒間の休息間隔を待った後、同じペーシングエピソードを実行します。連続的な高周波ペーシング期間中の心電図記録を注意深く監視し、興味深い不整脈波が発生したときに同時に光マッピング記録を速やかに開始します。電子増倍電荷結合素子カメラを使用して画像を撮影します。画像取得ソフトウェアで、フォルダ選択を押し、画像を読み込むと、半自動の大量ビデオデータ解析プロセスが開始されます。解析の正しいサンプリングパラメータを入力します。画像のしきい値を手動で設定し、関心領域を選択します。3 x 3 ピクセルのガウス空間フィルター、Savitzky-Golay フィルター、シルクハットベースライン補正を適用します。次に、[画像の処理]を押してベースラインを削除し、APD-80やCATD-50などの電気生理学的パラメータを計算します。APD-80を計算するために、ピークでの活動電位時間の開始時間と80%の再分極での終点を設定します。同様に、カルシウム過渡期間の開始時間をピークとして定義し、終点を 80% 緩和します。APD-80 と CATD-80 のヒートマップの典型的なトレースを示します。イソプロテレノールは、APD-80および野生型およびカテコールアミン作動性多形性心室頻拍またはCPVTマウスを短縮しますが、イソプロテレノールチャレンジ後に差は見られませんでした。CATD-80およびCPVTマウスは、イソプロテレノールチャレンジ後、野生型よりも期間が長かったが、治療前は有意性がなかった。電圧信号によると、野生型とCPVTの心臓は、ベースライン時とイソプロテレノール介入後に心外膜を横切る同じ伝導能力を持っていました。ヒートマップは、CPVTマウスがイソプロテレノールチャレンジの前後で野生型マウスと同じ伝導能を持つことを示しました。カルシウム振幅代替分析では、野生型心臓のカルシウムシグナルは、14.29ヘルツと16.67ヘルツで連続したS1-S1ペーシング中にベースラインで安定していたが、CPVT心臓は周波数依存的な代替を示した。イソプロテレノールチャレンジ後、CPVT心臓はS1-S1ペーシング中に周波数依存性交互およびカルシウムシグナルを示したが、野生型心臓は影響を受けなかった。頻変性不整脈解析では、野生型とCPVTの両方の心臓が、ベースラインでの50ヘルツバーストペーシング中に正常な伝導を示すことが示唆されました。イソプロテレノールを多量に投与した後、CPVT心臓は50ヘルツバーストペーシング後に高周波ローターを示しましたが、野生型心臓は正常な伝導を維持しました。この手順に続いて、アドゲン型および野生型マウスを用いて、これらのモデルまたは医薬品の発明における電気生理学的および機能的特性を例示する。光学マッピングは、不整脈を研究するための強力なツールですが、励起収縮の結合解除下での蛍光色素の制限により、臨床的に使用することはできません。高回転計算技術の開発による異なる標的分子に適した蛍光の開発により、心臓光学マッピング技術はアプリケーションのみを達成するためにバインドされています。

Research

JoVE Journal

Biology

Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia

Proper Care and Cleaning of the Microscope

顕微鏡の適切な手入れとクリーニング

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Major Components of the Light Microscope

光学顕微鏡の主要なコンポーネント

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

位相コントラストおよび微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

ランゲンドルフ灌流ラット心臓の光学的マッピング

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

スモールハーツの半自動光ビート解析

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

胚心室内皮細胞の単離

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

培養HL-1心房筋細胞単層の電圧とカルシウムデュアルチャネル光学マッピング

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

イントラ小胞体のCaの光学マッピング<sup&gt; 2+</sup&gt;とランゲンドルフ灌流ウサギの心臓における膜電位

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...