Name: dual-dye optical mapping of hearts from ryr2r2474s knock-in mice of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia
Uploaded: 2023-12-22T12:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia at JoVE.com

이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (81700308에서 XO로, 31871181에서 ML로, 82270334에서 XT로), 쓰촨성 과학 기술 지원 프로그램 (CN) (2021YJ0206 - XO, 23ZYZYTS0433 및 2022YFS0607 - XT, 2022NSFSC1602 - TC) 및 의약 자원의 화학 및 분자 공학을 위한 국가 핵심 연구소 (광시 사범 대학) (CMEMR2017-B08 - XO)의 지원을 받습니다. MRC(G10031871181 to ML02647, G1002082, ML), BHF(PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE at Oxford(ML) 보조금.

실험에는 10주 내지 14주령의 수컷 야생형 마우스 또는 무게가 20-25g인 RyR2-R2474S/+ 마우스(C57BL/6 배경)가 사용되었다. 모든 절차는 기관이 운영되는 국가 지침에 따라 중국 쓰촨성 사우스웨스트 의과대학의 동물 관리 및 사용 위원회(승인 번호:20160930)의 승인을 받았습니다.
1. 준비
<ol><li>스톡 솔루션<ol><li>블레비스타틴 원액: 100% 디메틸설폭사이드(DMSO) 1mL를 (...

<ol>
	<li>Priori, S. G., Chen, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherited+dysfunction+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++handling+and+arrhythmogenesis.">Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis.</a> Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).</li><li>Goddard, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+consequences+of+the+P2328S+mutation+in+the+ryanodine+receptor+(RyR2)+gene+in+genetically+modified+murine+hearts.">Physiological consequences of the P2328S mutation in the ryanodine receptor (RyR2) gene in genetically modified murine hearts.</a> Acta Physiologica. 194 (2), 123-140 (2008).</li><li>Sabir, I. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternans+in+genetically+modified+langendorff-perfused+murine+hearts+modeling+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Alternans in genetically modified langendorff-perfused murine hearts modeling catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Frontiers in Physiology. 1, 126 (2010).</li><li>Zhang, Y., Matthews, G. D., Lei, M., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+Ca2++homeostasis,+atrial+arrhythmogenesis,+and+sinus+node+dysfunction+in+murine+hearts+modeling+RyR2+modification.">Abnormal Ca2+ homeostasis, atrial arrhythmogenesis, and sinus node dysfunction in murine hearts modeling RyR2 modification.</a> Frontiers in Physiology. 4, 150 (2013).</li><li>Leenhardt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia+in+children.+A+7-year+follow-up+of+21+patients.">Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in children. A 7-year follow-up of 21 patients.</a> Circulation. 91 (5), 1512-1519 (1995).</li><li>Priori, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+cardiac+ryanodine+receptor+gene+(hRyR2)+underlie+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Circulation. 103 (2), 196-200 (2001).</li><li>Wehrens, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FKBP12.6+deficiency+and+defective+calcium+release+channel+(ryanodine+receptor)+function+linked+to+exercise-induced+sudden+cardiac+death.">FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death.</a> Cell. 113 (7), 829-840 (2003).</li><li>Novak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+abnormalities+in+iPSC-derived+cardiomyocytes+generated+from+CPVT1+and+CPVT2+patients+carrying+ryanodine+or+calsequestrin+mutations.">Functional abnormalities in iPSC-derived cardiomyocytes generated from CPVT1 and CPVT2 patients carrying ryanodine or calsequestrin mutations.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 2006-2018 (2015).</li><li>Napolitano, C., Mazzanti, A., Bloise, R., Priori, S. G., Adam, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CACNA1C-related+disorders.">CACNA1C-related disorders.</a> GeneReviews. , (1993).</li><li>Makita, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+calmodulin+mutations+associated+with+congenital+arrhythmia+susceptibility.">Novel calmodulin mutations associated with congenital arrhythmia susceptibility.</a> Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (4), 466-474 (2014).</li><li>Gomez-Hurtado, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+CPVT-associated+calmodulin+mutation+in+CALM3+(CALM3-A103V)+activates+arrhythmogenic+Ca+waves+and+sparks.">Novel CPVT-associated calmodulin mutation in CALM3 (CALM3-A103V) activates arrhythmogenic Ca waves and sparks.</a> Circulation, Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (8), (2016).</li><li>Wleklinski, M. J., Kannankeril, P. J., Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+tissue+mechanisms+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Molecular and tissue mechanisms of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Journal of Physiology. 598 (14), 2817-2834 (2020).</li><li>Neco, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradoxical+effect+of+increased+diastolic+Ca2++release+and+decreased+sinoatrial+node+activity+in+a+mouse+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Paradoxical effect of increased diastolic Ca2+ release and decreased sinoatrial node activity in a mouse model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Circulation. 126 (4), 392-401 (2012).</li><li>Bogdanov, K. Y., Vinogradova, T. M., Lakatta, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinoatrial+nodal+cell+ryanodine+receptor+and+Na(+)-Ca(2+)+exchanger:+molecular+partners+in+pacemaker+regulation.">Sinoatrial nodal cell ryanodine receptor and Na(+)-Ca(2+) exchanger: molecular partners in pacemaker regulation.</a> Circulation Research. 88 (12), 1254-1258 (2001).</li><li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ElectroMap:+High-throughput+open-source+software+for+analysis+and+mapping+of+cardiac+electrophysiology.">ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1389 (2019).</li><li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+of+optical+mapping+data+using+ElectroMap.">High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).</li><li>Choi, B. R., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+maps+of+optical+action+potentials+and+calcium+transients+in+guinea-pig+hearts:+mechanisms+underlying+concordant+alternans.">Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans.</a> Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).</li><li>Rybashlykov, D., Brennan, J., Lin, Z., Efimov, I. R., Syunyaev, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-source+low-cost+cardiac+optical+mapping+system.">Open-source low-cost cardiac optical mapping system.</a> PLoS One. 17 (3), 0259174 (2022).</li><li>Lucas-Lopez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+stereochemical+assignment+and+fluorescence+tuning+of+the+small+molecule+tool,+(-)-blebbistatin.">Absolute stereochemical assignment and fluorescence tuning of the small molecule tool, (-)-blebbistatin.</a> European Journal of Organic Chemistry. 2005 (9), 1736-1740 (2005).</li><li>Ponsaerts, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+II+ATPase+inhibitor+blebbistatin+prevents+thrombin-induced+inhibition+of+intercellular+calcium+wave+propagation+in+corneal+endothelial+cells.">The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 49 (11), 4816-4827 (2008).</li><li>Jou, C., Spitzer, K., Tristani-Firouzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+effectively+uncouples+the+excitation-contraction+process+in+zebrafish+embryonic+heart.">Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart.</a> Cellular Physiology &amp; Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).</li><li>Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+uncoupler+blebbistatin+is+associated+with+significant+electrophysiological+effects+in+the+isolated+rabbit+heart.">The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart.</a> Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).</li><li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+of+optical+mapping+data+using+ElectroMap.">High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dataset+of+dual+calcium+and+voltage+optical+mapping+in+healthy+and+hypertrophied+murine+hearts.">A dataset of dual calcium and voltage optical mapping in healthy and hypertrophied murine hearts.</a> Scientific Data. 8 (1), 314 (2021).</li><li>Lei, M., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+arrhythmogenesis:+a+tale+of+two+clocks.">Cardiac arrhythmogenesis: a tale of two clocks.</a> Cardiovascular Research. 116 (14), e205-e209 (2020).</li><li>Mal Baudot, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concomitant+genetic+ablation+of+L-type+Cav1.3+&#945;1D+and+T-type+Cav3.1+&#945;1G+Ca2++channels+disrupts+heart+automaticity.">Concomitant genetic ablation of L-type Cav1.3 &#945;1D and T-type Cav3.1 &#945;1G Ca2+ channels disrupts heart automaticity.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18906 (2020).</li><li>Dai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZO-1+regulates+intercalated+disc+composition+and+atrioventricular+node+conduction.">ZO-1 regulates intercalated disc composition and atrioventricular node conduction.</a> Circulation Research. 127 (2), e28-e43 (2020).</li><li>Glukhov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calsequestrin+2+deletion+causes+sinoatrial+node+dysfunction+and+atrial+arrhythmias+associated+with+altered+sarcoplasmic+reticulum+calcium+cycling+and+degenerative+fibrosis+within+the+mouse+atrial+pacemaker+complex1.">Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex1.</a> European Heart Journal. 36 (11), 686-697 (2015).</li><li>Torrente, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burst+pacemaker+activity+of+the+sinoatrial+node+in+sodium-calcium+exchanger+knockout+mice.">Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (31), 9769-9774 (2015).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+SK2+upregulation+following+angiotensin+II+challenge:+Modulation+by+p21-activated+kinase-1.">Ventricular SK2 upregulation following angiotensin II challenge: Modulation by p21-activated kinase-1.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 164, 110-125 (2022).</li><li>Dong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+dual+calcium-voltage+optical+mapping+in+murine+sinoatrial+preparation+with+optogenetic+pacing.">A protocol for dual calcium-voltage optical mapping in murine sinoatrial preparation with optogenetic pacing.</a> Frontiers in Physiology. 10, 954 (2019).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+transverse+cardiac+slicing+and+optical+mapping+in+murine+heart.">A protocol for transverse cardiac slicing and optical mapping in murine heart.</a> Frontiers in Physiology. 10, 755 (2019).</li><li>Hoeker, G. S., Katra, R. P., Wilson, L. D., Plummer, B. N., Laurita, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+calcium+release+in+tissue+from+the+failing+canine+heart.">Spontaneous calcium release in tissue from the failing canine heart.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1235-H1242 (2009).</li><li>Laurita, K. R., Singal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+action+potentials+and+calcium+transients+simultaneously+from+the+intact+heart.">Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 280 (5), H2053-H2060 (2001).</li><li>Johnson, P. L., Smith, W., Baynham, T. C., Knisley, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Errors+caused+by+combination+of+Di-4+ANEPPS+and+Fluo3/4+for+simultaneous+measurements+of+transmembrane+potentials+and+intracellular+calcium.">Errors caused by combination of Di-4 ANEPPS and Fluo3/4 for simultaneous measurements of transmembrane potentials and intracellular calcium.</a> Annals of Biomedical Engineering. 27 (4), 563-571 (1999).</li></ol>

우리의 경험에 비추어 볼 때, 쥐 심장의 성공적인 이중 염료 광학 매핑의 핵심은 잘 준비된 솔루션과 심장, 염료 로딩, 최상의 신호 대 잡음비 달성 및 모션 아티팩트 감소입니다.
용액의 준비 크렙스 용액은 성공적인 심장 실험에 필수적입니다. MgCl 2및 CaCl 2 원액 (1 mol / L)은 수분 흡수를 고려하여 미리 준비되고 다른 모?...

유전성 심장 질환 카테콜아민성 다형성 심실 빈맥(CPVT)은 신체 활동, 스트레스 또는 카테콜아민 챌린지 후 다형성 심실 빈맥(PVT) 에피소드로 나타나며, 잠재적으로 치명적인 심실세동으로 악화될 수 있습니다 1,2,3,4 . 1995년 임상 증후군으로 처음 보고된 이후 최근의 증거는 7개의 유전자에 돌연변이가 있음을 시사했으며, 모두 이 상태에서 근질 망상(SR) 저장 Ca 2+ 방출에 관여했습니다: 가장 빈번하게 보고된 RYR2 인코딩 리아노딘 수용체 2(RyR2)의 Ca2+ 방출 채널5,6, FKBP12.67, CASQ2 인코딩 심장 calsequestrin8, TRDN 접합 SR 단백질 트리아딘9 및 CALM1 9, CALM2 10 및 CALM3 칼모듈린11,12를 동일하게 인코딩하는 인코딩. 이러한 유전형 패턴은 부정맥 사건을 SR 저장소 Ca2+12의 조절되지 않은 병리학적 방출에 기인합니다.
SR로부터의 자발적인 Ca 2+ 방출은 Ca 2+ 스파크 또는 Ca 2+ 파동으로 감지될 수 있으며, 이는 Na+/Ca 2+ 교환기(NCX)를 활성화합니다. 3 Na+에 대한 1 Ca의교환기 2 +는 내부 전류를 생성하여 이완기 탈분극을 가속화하고 멤브레인 전압을 활동 전위 (AP)의 임계 값으로 구동합니다. RyR2 knock-in 마우스에서, 동방 결절(SAN)에서 RyR2R4496C의 증가된 활성은 이완기 동안 I, Ca, L 및 SR Ca 2+ 고갈의 Ca2+ 의존적 감소에 의해 SAN 자동성의 예상치 못한 감소를 초래하여, CPVT 환자에서 SAN 기능 장애에 기여하는 세포 내 병태생리학적 변화를 확인한다13,14. 관련 심근세포 세포질 Ca 2+ 파의 발생은 이소프로테레놀(ISO)을 포함한 카테콜아민에 의한 RyR 감작 후 배경 세포질[Ca2+]의 증가에 따라 발생할 가능성이 더 높습니다.
온전한 심장 CPVT 모델에서 관찰된 심실 부정맥의 원인이 될 수 있는 활동 전위(AP) 활성화에 대한 반응으로 RyR2 매개 Ca 2+ 방출에 따른 Ca2+ 신호의 자세한 역학적 변화는 보고된 RyR2 유전자형12의 전체 범위에 대해 결정되어야 합니다. 이 논문은 이소프로테레놀 챌린지 전후에 프로그래밍된 전기 페이싱과 결합된 쥐 야생형(WT) 및 이형접합 RyR2-R2474S/+ 심장에서 Ca2+ 신호 및 막관통 전위(V, m)의 고처리량 매핑을 위한 기기 설정 및 실험 절차를 제시합니다. 이 프로토콜은 분리된 마우스 심장에서 CPVT 질병의 기계론적 연구를 위한 방법을 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m syringe filter</td>
			<td>Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To filter solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Pasteur pipette</td>
			<td>Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China</td>
			<td>00900026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>B. Braun Medical Inc.</td>
			<td>YZB/GER-5474-2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L PCR tube</td>
			<td>Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China</td>
			<td>F611541-0010</td>
			<td>Aliquote the stock solutions&#160; to avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td>Store Tyrode&#39;s solution at 4 &#176;C for follow-up heart isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>585/40 nm filter</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Filter for calcium signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>630 nm long-pass filter</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>G15604AJ</td>
			<td>Filter for voltage signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avertin (2,2,2-tribromoethanol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom</td>
			<td>T48402-100G</td>
			<td>To minimize suffering and pain reflex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States</td>
			<td>SLBV5564</td>
			<td>Excitation-contraction uncoupler to&#160; eliminate motion artifact during mapping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>SLBK1794V</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-made thermostatic bath</td>
			<td>MappingLab, United Kingdom</td>
			<td>TBC-2.1</td>
			<td>To keep temperature of perfusion solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>(RNBT7442)</td>
			<td>Solvent for dyes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China</td>
			<td>YAF030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ElectroMap software</td>
			<td>University of Birmingham</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Quantification of electrical parameters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States</td>
			<td>A18G150001</td>
			<td>Acquire images for optical signals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET525/36 sputter coated filter</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>319106</td>
			<td>Excitation filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>SLBT4811V</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium</td>
			<td>Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China</td>
			<td>(H51021209)</td>
			<td>To prevent blood clots in the coronary artery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Iris forceps</td>
			<td>Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China</td>
			<td>YAA010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States</td>
			<td>HY-B0468/CS-2582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>SLBS5003</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MacroLED</td>
			<td>Cairn Research, Faversham, United Kingdom</td>
			<td>7355/7356</td>
			<td>The excitation light of fluorescence probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MacroLED light source</td>
			<td>Cairn Research, Faversham, United Kingdom</td>
			<td>7352</td>
			<td>Control the LEDs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors</td>
			<td>Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China</td>
			<td>YBC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Optical signals sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>BCBS6841V</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICRO3-1401</td>
			<td>Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom</td>
			<td>M5337</td>
			<td>Connect the electrical stimulator and Spike2 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyoPacer EP field stimulator</td>
			<td>Ion Optix Co, Milton, MA, United States</td>
			<td>S006152</td>
			<td>Electric stimulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>SLBS2340V</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>BCBW9042</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>SLBX3605</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroLog System</td>
			<td>Digitimer</td>
			<td>NL905-229</td>
			<td>For ECG amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmapScope5</td>
			<td>MappingLab, United Kingdom</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Calcium alternans and arrhythmia analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic scissors</td>
			<td>Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China</td>
			<td>T4-3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptoSplit</td>
			<td>Cairn Research, Faversham, United Kingdom</td>
			<td>6970</td>
			<td>Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm&#160; simultaneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristalic pump</td>
			<td>Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,</td>
			<td>BT100-2J</td>
			<td>To pump the solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>TCD010060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F127</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, United States</td>
			<td>1899021</td>
			<td>To enhance the loading with Rhod2AM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RH237</td>
			<td>Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States</td>
			<td>1971387</td>
			<td>Voltage-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod-2 AM</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, United States</td>
			<td>1890519</td>
			<td>Calcium indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel tube</td>
			<td>Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,</td>
			<td>96402-16</td>
			<td>Connect with the peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture</td>
			<td>Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China</td>
			<td>20172650032</td>
			<td>To fix the aorta</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spike2</td>
			<td>Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To record and analyze ECG data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulation electrode</td>
			<td>MappingLab, United Kingdom</td>
			<td>SE1600-35-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T510lpxr</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>312461</td>
			<td>For light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T565lpxr</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>321343</td>
			<td>For light source</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual-dye optical mapping of hearts from ryr2r2474s knock-in mice of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia

부정맥성 심장 질환인 카테콜아민성 다형성 심실 빈맥(CPVT)은 신체 활동, 스트레스 또는 카테콜아민 챌린지 후 다형성 심실 빈맥 에피소드로 나타나며, 잠재적으로 치명적인 심실 세동으로 악화될 수 있습니다. 마우스 심장은 CPVT를 포함한 유전성 심장 부정맥 질환을 모델링하는 데 널리 사용되는 종입니다. Langendorff 관류된 쥐 심장의 막관통 전위(Vm)와 칼슘 과도성(CaT)의 동시 광학 매핑은 부정맥 발생의 기전을 밝힐 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 세포 수준 조사와 비교하여 광학 매핑 기술은 활성화, 전도 속도, 활동 전위 지속 시간 및 CaT 지속 시간 결정과 같은 일부 전기 생리학적 매개변수를 테스트할 수 있습니다. 이 논문은 이소프로테레놀 챌린지 전과 도중에 프로그래밍된 전기 페이싱과 결합된 쥐 야생형 및 이형접합 RyR2-R2474S/+ 심장에서 CaT 및 Vm의 고처리량 광학 매핑을 위한 기기 설정 및 실험 절차를 제시합니다. 이 접근법은 생체 외 마우스 심장 제제에서 CPVT 질환을 기계적으로 연구하기 위한 실현 가능하고 신뢰할 수 있는 방법을 입증했습니다.

광학 매핑은 지난 10년 동안 복잡한 심장 부정맥을 연구하는 데 널리 사용되는 접근 방식이었습니다. 광학 매핑 설정은 EMCCD 카메라로 구성되며 각 픽셀에 대해 최대 1,000Hz의 샘플링 속도와 74 x 74μm의 공간 분해능을 제공합니다. 이를 통해 신호 샘플링 중에 다소 높은 신호 잡음비를 구현할 수 있습니다(그림 1). 랑겐도르프 관류된 심장이 안정된 상태에 도달하고 염료 로딩이 ...

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Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia

이 프로토콜은 높은 시간 및 공간 분해능으로 막관통 전압 및 세포 내 Ca2+ 과도 현상의 전기 생리학적 측정을 포함하여 카테콜아민성 다형성 심실 빈맥의 영향을 받는 야생형 및 녹인 동물에서 얻은 마우스 심장의 이중 염료 광학 매핑을 소개합니다.

Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia의 RyR2R2474S Knock-In 마우스의 심장에 대한 이중 염료 광학 매핑

The pro-arrhythmic cardiac disorder catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) manifests as polymorphic ventricular tachycardia episodes ...

이 방법은 카테콜아민성 다형성 심실 빈맥과 같은 질병과 관련된 심실 정지 도말의 전기 생리학적 특성과 메커니즘을 밝히는 데 도움이 될 것입니다. 이 기술을 사용하면 CPVT와 같은 심장 부정맥 질환의 기본 메커니즘과 역학을 탐구하는 데 특히 적합한 다양한 프로그래밍된 전기 페이싱 프로토콜에서 막 전위와 세포 간 칼슘 신호를 동시에 얻을 수 있습니다. 이 실험을 성공적으로 수행하려면 심장이 잘 관류되고, 염료가 적절하게 로딩되고, 여기-수축 분리가 이루어지고, 카메라가 세심하게 설정되어야 합니다.시작하려면 광학 매핑 시스템을 설정하고 영하 50도에서 안정적인 샘플링 온도를 위해 카메라를 켜십시오. 채취한 쥐의 심장을 차가운 CREB 용액에 넣어 신진대사를 늦추고 심장을 보호합니다. 대동맥의 주변 조직을 제거합니다.맞춤형 캐뉼레이션 바늘을 사용하여 캐뉼레이션하고 4-0 실크 봉합사로 고정합니다. 이제 분당 3.5-4.0밀리리터의 일정한 속도로 랑겐도르프 시스템으로 심장을 관류하십시오. 작은 플라스틱 튜브를 좌심실에 삽입하여 챔버의 용액 혼잡을 풀어 과부하를 방지하고 플라스틱 튜브를 캐뉼레이션 바늘에 고정합니다.그런 다음 두 개의 리드를 수조의 관류액에 넣고 심전도 증폭기 상자와 전기 자극 컨트롤러의 전원을 켭니다. 그런 다음 참조된 심전도 또는 ECG 소프트웨어를 시작하고 ECG를 지속적으로 모니터링합니다. 심장이 안정된 상태에 도달하면 어둠 속에서 후속 단계를 수행하십시오.블레비스타틴 CREBs 용액 혼합물을 10분 동안 심장에 지속적으로 관류하여 흥분으로 인한 수축을 분리하고 촬영 중 수축 인공물을 방지합니다. 그런 다음 빨간색 손전등을 사용하여 심장을 검사하여 수축이 완전히 멈췄는지 확인합니다. 여기 수축을 분리한 후 Langendorff 관류 시스템에서 15분 동안 Rhod-2 AM 작업 용액으로 심장을 관류합니다.세포 내 칼슘 염료 로딩 중에 산소 공급을 유지합니다. 플루로닉 F-127로 인한 기포 형성을 방지하려면 관류 시스템에 기포 트랩을 삽입하십시오. 10 마이크로 리터의 RH 237 원액을 50 밀리리터의 관류수에 희석하고 10 분 동안로드합니다.이중 염료 로딩이 완료되면 일련의 사진을 캡처합니다. 전압 및 칼슘 신호가 분석에 적합한지 확인합니다. 여기 조명을 위해 두 개의 LED를 켜고 강도를 적절한 범위로 조정합니다.심장을 감지 장치 아래에 놓고 광점 직경을 2cm로 조정하는 두 개의 LED로 심장이 잘 비추어지도록 합니다. 렌즈와 심장 사이의 작동 거리를 10cm로 설정하여 원하는 샘플링 속도와 공간 해상도를 얻을 수 있습니다. 신호 샘플링 소프트웨어를 열어 카메라를 동시에 제어하고 전압 및 칼슘 신호를 캡처할 수 있습니다.MyoPacer Field Stimulator를 시작하고 페이싱 패턴을 펄스당 2밀리초의 페이싱 지속 시간으로 트랜지스터 트랜지스터 로직으로 설정합니다. 초기 강도를 0.3볼트로 설정합니다. 좌심실 정점의 심외막에 부착된 한 쌍의 백금 전극을 배치합니다.ECG 기록 소프트웨어를 사용하여 심장의 이완기 전압 임계값을 테스트하기 위해 30회 연속 10Hz S1 자극을 적용합니다. 일대일 캡처가 이루어질 때까지 전압 진폭을 점차적으로 증가시킵니다. S1-S1 프로토콜을 구현하여 칼슘 또는 활동 전위 대체 물질 및 복원 특성을 측정합니다.100밀리초의 기본 주기 길이에서 시작하여 연속적으로 심장 페이스를 조절합니다. 주기 길이가 50밀리초에 도달할 때까지 각 후속 시퀀스에서 10밀리초씩 줄입니다. 자극 전에 광학 매핑을 동시에 시작합니다.S1-S2 자극 프로토콜을 사용하여 심실 유효 불응 기간을 측정하려면 100밀리초의 S1-S1 페이싱 주기 길이로 시작합니다. S2를 60밀리초에 결합하고 S2가 이소성 QRS 복합파를 포착하지 못할 때까지 2밀리초 스텝 감소로 감소시킵니다. 부정맥 유도를 위해 영구적인 50Hz 버스트 페이싱을 투여하고 2초 휴식 간격을 기다린 후 동일한 페이싱 에피소드를 수행합니다.지속적인 고주파 페이싱 기간 동안 심전도 기록을 주의 깊게 모니터링하여 흥미로운 부정맥이 생성될 때 즉시 동시 광학 매핑 기록을 시작합니다. 전자 곱셈 전하 결합 장치 카메라를 사용하여 이미지 캡처를 진행합니다. 이미지 수집 소프트웨어에서 폴더 선택을 누르고 이미지를 로드하여 반자동 대용량 비디오 데이터 분석 프로세스를 시작합니다.분석을 위해 올바른 표본 추출 매개 변수를 입력합니다. 이미지 임계값을 수동으로 설정하고 관심 영역을 선택합니다. 3x3 픽셀의 가우스 공간 필터, 사비츠키-골레이 필터, 모자 기준선 보정을 적용합니다.그런 다음 이미지 처리를 눌러 베이스라인을 제거하고 APD-80 및 CATD-50과 같은 전기생리학적 파라미터를 계산합니다. APD-80을 계산하기 위해 피크와 터미널 포인트에서 활동 전위 지속 시간의 시작 시간을 80% 재분극으로 설정합니다. 마찬가지로 칼슘 과도 지속 시간의 시작 시간을 터미널 포인트가 80% 이완인 피크로 정의합니다.APD-80 및 CATD-80의 히트 맵에 있는 일반적인 트레이스가 표시됩니다. 이소프로테레놀은 APD-80과 야생형 및 카테콜아민성 다형성 심실 빈맥 또는 CPVT 마우스를 단축시키지만 이소프로테레놀 챌린지 후 차이는 발견되지 않았습니다. CATD-80 및 CPVT 마우스는 이소프로테레놀 챌린지 후 야생형보다 더 길었지만 처리 전에는 유의성이 없었습니다.전압 신호에 따르면, 야생형 심장과 CPVT 심장은 기준선과 이소프로테레놀 중재 후 심외막을 가로질러 동일한 전도 능력을 가졌습니다. 히트 맵은 CPVT 마우스가 이소프로테레놀 챌린지 전후에 야생형 마우스와 동일한 전도 능력을 가지고 있음을 보여주었습니다. 칼슘 진폭 대체 분석은 야생형 심장의 칼슘 신호가 14.29 및 16.67 헤르츠에서 연속적인 S1-S1 페이싱 동안 기준선에서 안정적으로 유지된 반면, CPVT 심장은 주파수 의존적 대체를 보였다는 것을 보여주었습니다.이소프로테레놀 챌린지 후, CPVT 심장은 S1-S1 페이싱 동안 주파수 의존적 대체 및 칼슘 신호를 나타낸 반면, 야생형 심장은 영향을 받지 않았습니다. 빈틈없는 부정맥 분석은 야생형 심장과 CPVT 심장 모두 기준선에서 50헤르츠 버스트 페이싱 동안 정상적인 전도를 나타낸다는 것을 시사했습니다. 이소프로테레놀을 투여한 후 CPVT 심장은 50헤르츠 버스트 페이싱 후 고주파 로터를 보인 반면, 야생형 심장은 정상적인 전도를 유지했습니다.이 절차에 따라, 아도겐형 및 야생형 마우스는 이러한 모델 또는 의약품의 발명에서 전기생리학적 및 기능적 특성을 설명하기 위해 사용됩니다. 광학 매핑은 심장 부정맥 연구를 위한 강력한 도구이지만 여기 수축 분리 하에서 형광 염료의 제한으로 인해 임상적으로 사용할 수 없습니다. 고혁명 계산 기술의 발전에 따라 다양한 표적 분자에 적합한 형광등이 개발됨에 따라 심장 광학 매핑 기술은 응용 분야만 달성할 수밖에 없습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia

Proper Care and Cleaning of the Microscope

현미경의 올바른 관리 및 청소

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

연구

생물학

Major Components of the Light Microscope

라이트 현미경의 주요 구성 요소

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

단계 대비 및 차등 간섭 대비 (DIC) 현미경

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Langendorff - perfused 랫 하트의 광학 매핑

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

작은 하트의 세미 - 자동 광학 도면 분석

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

배아 심실 내피 세포의 분리

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

배양 된 HL-1 심방 근육 세포 단층의 전압 및 칼슘 듀얼 채널 광학 매핑

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

인트라 근질 그물 자리 칼슘의 광학 매핑<sup&gt; 2 +</sup&gt;와 랑겐 돌프 - 관류 토끼 심장에 막 횡단 잠재력

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...