Name: dual-dye optical mapping of hearts from ryr2r2474s knock-in mice of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia
Uploaded: 2023-12-22T12:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia at JoVE.com

Denne studien støttes av National Natural Science Foundation of China (81700308 til XO og 31871181 til ML, og 82270334 til XT), Sichuan Province Science and Technology Support Program (CN) (2021YJ0206 til XO, 23ZYZYTS0433 og 2022YFS0607 til XT, og 2022NSFSC1602 til TC) og State Key Laboratory for kjemi og molekylærteknikk av medisinske ressurser (Guangxi Normal University) (CMEMR2017-B08 til XO), MRC (G10031871181 til ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE ved Oxford (ML) tilskudd.

Hannmus 10 til 14 uker gamle villtypemus eller RyR2-R2474S/+ mus (C57BL/6 bakgrunn) som veier 20-25 g brukes til forsøkene. Alle prosedyrer er godkjent av dyrepleie- og brukskomiteen ved Southwest Medical University, Sichuan, Kina (godkjenning nr. 20160930) i samsvar med de nasjonale retningslinjene som institusjonen opererer under.
1. Forberedelse
<ol><li>Lagerløsninger<ol><li>Blebbistatin stamløsning: Tilsett 1 ml 100 % dimetylsulfoksid (DMSO) i originalkolben ...

<ol>
	<li>Priori, S. G., Chen, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherited+dysfunction+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++handling+and+arrhythmogenesis.">Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis.</a> Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).</li><li>Goddard, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+consequences+of+the+P2328S+mutation+in+the+ryanodine+receptor+(RyR2)+gene+in+genetically+modified+murine+hearts.">Physiological consequences of the P2328S mutation in the ryanodine receptor (RyR2) gene in genetically modified murine hearts.</a> Acta Physiologica. 194 (2), 123-140 (2008).</li><li>Sabir, I. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternans+in+genetically+modified+langendorff-perfused+murine+hearts+modeling+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Alternans in genetically modified langendorff-perfused murine hearts modeling catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Frontiers in Physiology. 1, 126 (2010).</li><li>Zhang, Y., Matthews, G. D., Lei, M., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+Ca2++homeostasis,+atrial+arrhythmogenesis,+and+sinus+node+dysfunction+in+murine+hearts+modeling+RyR2+modification.">Abnormal Ca2+ homeostasis, atrial arrhythmogenesis, and sinus node dysfunction in murine hearts modeling RyR2 modification.</a> Frontiers in Physiology. 4, 150 (2013).</li><li>Leenhardt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia+in+children.+A+7-year+follow-up+of+21+patients.">Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in children. A 7-year follow-up of 21 patients.</a> Circulation. 91 (5), 1512-1519 (1995).</li><li>Priori, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+cardiac+ryanodine+receptor+gene+(hRyR2)+underlie+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Circulation. 103 (2), 196-200 (2001).</li><li>Wehrens, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FKBP12.6+deficiency+and+defective+calcium+release+channel+(ryanodine+receptor)+function+linked+to+exercise-induced+sudden+cardiac+death.">FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death.</a> Cell. 113 (7), 829-840 (2003).</li><li>Novak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+abnormalities+in+iPSC-derived+cardiomyocytes+generated+from+CPVT1+and+CPVT2+patients+carrying+ryanodine+or+calsequestrin+mutations.">Functional abnormalities in iPSC-derived cardiomyocytes generated from CPVT1 and CPVT2 patients carrying ryanodine or calsequestrin mutations.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 2006-2018 (2015).</li><li>Napolitano, C., Mazzanti, A., Bloise, R., Priori, S. G., Adam, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CACNA1C-related+disorders.">CACNA1C-related disorders.</a> GeneReviews. , (1993).</li><li>Makita, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+calmodulin+mutations+associated+with+congenital+arrhythmia+susceptibility.">Novel calmodulin mutations associated with congenital arrhythmia susceptibility.</a> Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (4), 466-474 (2014).</li><li>Gomez-Hurtado, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+CPVT-associated+calmodulin+mutation+in+CALM3+(CALM3-A103V)+activates+arrhythmogenic+Ca+waves+and+sparks.">Novel CPVT-associated calmodulin mutation in CALM3 (CALM3-A103V) activates arrhythmogenic Ca waves and sparks.</a> Circulation, Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (8), (2016).</li><li>Wleklinski, M. J., Kannankeril, P. J., Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+tissue+mechanisms+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Molecular and tissue mechanisms of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Journal of Physiology. 598 (14), 2817-2834 (2020).</li><li>Neco, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradoxical+effect+of+increased+diastolic+Ca2++release+and+decreased+sinoatrial+node+activity+in+a+mouse+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Paradoxical effect of increased diastolic Ca2+ release and decreased sinoatrial node activity in a mouse model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Circulation. 126 (4), 392-401 (2012).</li><li>Bogdanov, K. Y., Vinogradova, T. M., Lakatta, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinoatrial+nodal+cell+ryanodine+receptor+and+Na(+)-Ca(2+)+exchanger:+molecular+partners+in+pacemaker+regulation.">Sinoatrial nodal cell ryanodine receptor and Na(+)-Ca(2+) exchanger: molecular partners in pacemaker regulation.</a> Circulation Research. 88 (12), 1254-1258 (2001).</li><li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ElectroMap:+High-throughput+open-source+software+for+analysis+and+mapping+of+cardiac+electrophysiology.">ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1389 (2019).</li><li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+of+optical+mapping+data+using+ElectroMap.">High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).</li><li>Choi, B. R., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+maps+of+optical+action+potentials+and+calcium+transients+in+guinea-pig+hearts:+mechanisms+underlying+concordant+alternans.">Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans.</a> Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).</li><li>Rybashlykov, D., Brennan, J., Lin, Z., Efimov, I. R., Syunyaev, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-source+low-cost+cardiac+optical+mapping+system.">Open-source low-cost cardiac optical mapping system.</a> PLoS One. 17 (3), 0259174 (2022).</li><li>Lucas-Lopez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+stereochemical+assignment+and+fluorescence+tuning+of+the+small+molecule+tool,+(-)-blebbistatin.">Absolute stereochemical assignment and fluorescence tuning of the small molecule tool, (-)-blebbistatin.</a> European Journal of Organic Chemistry. 2005 (9), 1736-1740 (2005).</li><li>Ponsaerts, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+II+ATPase+inhibitor+blebbistatin+prevents+thrombin-induced+inhibition+of+intercellular+calcium+wave+propagation+in+corneal+endothelial+cells.">The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 49 (11), 4816-4827 (2008).</li><li>Jou, C., Spitzer, K., Tristani-Firouzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+effectively+uncouples+the+excitation-contraction+process+in+zebrafish+embryonic+heart.">Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart.</a> Cellular Physiology &amp; Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).</li><li>Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+uncoupler+blebbistatin+is+associated+with+significant+electrophysiological+effects+in+the+isolated+rabbit+heart.">The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart.</a> Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).</li><li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+of+optical+mapping+data+using+ElectroMap.">High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dataset+of+dual+calcium+and+voltage+optical+mapping+in+healthy+and+hypertrophied+murine+hearts.">A dataset of dual calcium and voltage optical mapping in healthy and hypertrophied murine hearts.</a> Scientific Data. 8 (1), 314 (2021).</li><li>Lei, M., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+arrhythmogenesis:+a+tale+of+two+clocks.">Cardiac arrhythmogenesis: a tale of two clocks.</a> Cardiovascular Research. 116 (14), e205-e209 (2020).</li><li>Mal Baudot, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concomitant+genetic+ablation+of+L-type+Cav1.3+&#945;1D+and+T-type+Cav3.1+&#945;1G+Ca2++channels+disrupts+heart+automaticity.">Concomitant genetic ablation of L-type Cav1.3 &#945;1D and T-type Cav3.1 &#945;1G Ca2+ channels disrupts heart automaticity.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18906 (2020).</li><li>Dai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZO-1+regulates+intercalated+disc+composition+and+atrioventricular+node+conduction.">ZO-1 regulates intercalated disc composition and atrioventricular node conduction.</a> Circulation Research. 127 (2), e28-e43 (2020).</li><li>Glukhov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calsequestrin+2+deletion+causes+sinoatrial+node+dysfunction+and+atrial+arrhythmias+associated+with+altered+sarcoplasmic+reticulum+calcium+cycling+and+degenerative+fibrosis+within+the+mouse+atrial+pacemaker+complex1.">Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex1.</a> European Heart Journal. 36 (11), 686-697 (2015).</li><li>Torrente, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burst+pacemaker+activity+of+the+sinoatrial+node+in+sodium-calcium+exchanger+knockout+mice.">Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (31), 9769-9774 (2015).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+SK2+upregulation+following+angiotensin+II+challenge:+Modulation+by+p21-activated+kinase-1.">Ventricular SK2 upregulation following angiotensin II challenge: Modulation by p21-activated kinase-1.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 164, 110-125 (2022).</li><li>Dong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+dual+calcium-voltage+optical+mapping+in+murine+sinoatrial+preparation+with+optogenetic+pacing.">A protocol for dual calcium-voltage optical mapping in murine sinoatrial preparation with optogenetic pacing.</a> Frontiers in Physiology. 10, 954 (2019).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+transverse+cardiac+slicing+and+optical+mapping+in+murine+heart.">A protocol for transverse cardiac slicing and optical mapping in murine heart.</a> Frontiers in Physiology. 10, 755 (2019).</li><li>Hoeker, G. S., Katra, R. P., Wilson, L. D., Plummer, B. N., Laurita, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+calcium+release+in+tissue+from+the+failing+canine+heart.">Spontaneous calcium release in tissue from the failing canine heart.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1235-H1242 (2009).</li><li>Laurita, K. R., Singal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+action+potentials+and+calcium+transients+simultaneously+from+the+intact+heart.">Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 280 (5), H2053-H2060 (2001).</li><li>Johnson, P. L., Smith, W., Baynham, T. C., Knisley, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Errors+caused+by+combination+of+Di-4+ANEPPS+and+Fluo3/4+for+simultaneous+measurements+of+transmembrane+potentials+and+intracellular+calcium.">Errors caused by combination of Di-4 ANEPPS and Fluo3/4 for simultaneous measurements of transmembrane potentials and intracellular calcium.</a> Annals of Biomedical Engineering. 27 (4), 563-571 (1999).</li></ol>

Basert på vår erfaring inkluderer nøklene til en vellykket dobbelfarget optisk kartlegging av et musehjerte en godt forberedt løsning og hjerte-, fargestoffbelastning, oppnå det beste signal-støy-forholdet og redusere bevegelsesartefakten.
Fremstilling av oppløsning Krebs løsning er viktig for et vellykket hjerteeksperiment. MgCl2 ogCaCl2 stamløsninger (1 mol / L) fremstilles på forhånd med tanke på vannabsorpsjon og tilsettes til Krebs-lø...

Arvelig hjertesykdom katekolaminerg polymorf ventrikkeltakykardi (CPVT) manifesterer seg som polymorf ventrikulær takykardi (PVT) episoder etter fysisk aktivitet, stress eller katekolaminutfordring, som kan forverres til potensielt dødelig ventrikkelflimmer 1,2,3,4 . Nyere bevis etter sin første rapport som et klinisk syndrom i 1995 impliserte mutasjoner i syv gener, alle involvert i sarkoplasmatisk retikulær (SR) lagre Ca 2 + utgivelse i denne tilstanden: den hyppigst rapporterte RYR2 koding ryanodin reseptor 2 (RyR2) av Ca2 + utgivelseskanaler5,6, FKBP12.67, CASQ2 koding hjerte calsequestrin8, TRDN koding av det kryssende SR-proteinet triadin 9, og CALM1 9, CALM2 10 og CALM3 identisk kodende calmodulin11,12. Disse genotypiske mønstrene tilskriver de arytmiske hendelsene den uregulerte patologiske frigjøringen av SR-lager Ca2+12.
Spontan Ca 2+-frigjøring fra SR kan detekteres som Ca 2+ gnister eller Ca 2+ bølger, som aktiverer Na+/Ca 2+ veksleren (NCX). Veksleren til en Ca2 + for tre Na + genererer en innadgående strøm, noe som øker den diastoliske depolariseringen og driver membranspenningen til terskelen for handlingspotensial (AP). I RyR2-innslagsmus fører den økte aktiviteten til RyR2R4496C i sinoatrialknuten (SAN) til en uventet reduksjon i SAN-automatikk ved Ca 2+-avhengig reduksjon av I Ca,L og SR Ca2+-uttømming under diastol, identifisering av subcellulære patofysiologiske endringer som bidrar til SAN-dysfunksjon hos CPVT-pasienter 13,14. Forekomst av de relaterte kardiomyocytt-cytosoliske Ca 2+-bølgene er mer sannsynlig etter økning i bakgrunnscytosolisk [Ca2+] etter RyR-sensibilisering av katekolamin, inkludert isoproterenol (ISO), utfordring.
Detaljerte kinetiske endringer i Ca 2+-signalering etter RyR2-mediert Ca2+-frigjøring som respons på aktivering av aksjonspotensial (AP) som kan være årsaken til de observerte ventrikulære arytmiene i intakte hjerte-CPVT-modeller, gjenstår å bestemme for hele spekteret av rapporterte RyR2-genotyper12. Denne artikkelen presenterer instrumenteringsoppsett og eksperimentell prosedyre for kartlegging av høy gjennomstrømning av Ca2+ signaler og transmembrane potensialer (Vm) i murine wild-type (WT) og heterozygot RyR2-R2474S/+ hjerter, kombinert med programmert elektrisk pacing før og etter isoproterenol utfordring. Denne protokollen gir en metode for den mekanistiske studien av CPVT-sykdom i isolerte musehjerter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m syringe filter</td>
			<td>Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To filter solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Pasteur pipette</td>
			<td>Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China</td>
			<td>00900026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>B. Braun Medical Inc.</td>
			<td>YZB/GER-5474-2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L PCR tube</td>
			<td>Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China</td>
			<td>F611541-0010</td>
			<td>Aliquote the stock solutions&#160; to avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td>Store Tyrode&#39;s solution at 4 &#176;C for follow-up heart isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>585/40 nm filter</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Filter for calcium signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>630 nm long-pass filter</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>G15604AJ</td>
			<td>Filter for voltage signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avertin (2,2,2-tribromoethanol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom</td>
			<td>T48402-100G</td>
			<td>To minimize suffering and pain reflex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States</td>
			<td>SLBV5564</td>
			<td>Excitation-contraction uncoupler to&#160; eliminate motion artifact during mapping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>SLBK1794V</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-made thermostatic bath</td>
			<td>MappingLab, United Kingdom</td>
			<td>TBC-2.1</td>
			<td>To keep temperature of perfusion solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>(RNBT7442)</td>
			<td>Solvent for dyes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China</td>
			<td>YAF030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ElectroMap software</td>
			<td>University of Birmingham</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Quantification of electrical parameters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States</td>
			<td>A18G150001</td>
			<td>Acquire images for optical signals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET525/36 sputter coated filter</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>319106</td>
			<td>Excitation filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>SLBT4811V</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium</td>
			<td>Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China</td>
			<td>(H51021209)</td>
			<td>To prevent blood clots in the coronary artery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Iris forceps</td>
			<td>Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China</td>
			<td>YAA010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States</td>
			<td>HY-B0468/CS-2582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>SLBS5003</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MacroLED</td>
			<td>Cairn Research, Faversham, United Kingdom</td>
			<td>7355/7356</td>
			<td>The excitation light of fluorescence probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MacroLED light source</td>
			<td>Cairn Research, Faversham, United Kingdom</td>
			<td>7352</td>
			<td>Control the LEDs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors</td>
			<td>Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China</td>
			<td>YBC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Optical signals sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>BCBS6841V</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICRO3-1401</td>
			<td>Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom</td>
			<td>M5337</td>
			<td>Connect the electrical stimulator and Spike2 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyoPacer EP field stimulator</td>
			<td>Ion Optix Co, Milton, MA, United States</td>
			<td>S006152</td>
			<td>Electric stimulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>SLBS2340V</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>BCBW9042</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>SLBX3605</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroLog System</td>
			<td>Digitimer</td>
			<td>NL905-229</td>
			<td>For ECG amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmapScope5</td>
			<td>MappingLab, United Kingdom</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Calcium alternans and arrhythmia analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic scissors</td>
			<td>Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China</td>
			<td>T4-3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptoSplit</td>
			<td>Cairn Research, Faversham, United Kingdom</td>
			<td>6970</td>
			<td>Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm&#160; simultaneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristalic pump</td>
			<td>Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,</td>
			<td>BT100-2J</td>
			<td>To pump the solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>TCD010060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F127</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, United States</td>
			<td>1899021</td>
			<td>To enhance the loading with Rhod2AM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RH237</td>
			<td>Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States</td>
			<td>1971387</td>
			<td>Voltage-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod-2 AM</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, United States</td>
			<td>1890519</td>
			<td>Calcium indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel tube</td>
			<td>Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,</td>
			<td>96402-16</td>
			<td>Connect with the peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture</td>
			<td>Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China</td>
			<td>20172650032</td>
			<td>To fix the aorta</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spike2</td>
			<td>Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To record and analyze ECG data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulation electrode</td>
			<td>MappingLab, United Kingdom</td>
			<td>SE1600-35-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T510lpxr</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>312461</td>
			<td>For light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T565lpxr</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>321343</td>
			<td>For light source</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual-dye optical mapping of hearts from ryr2r2474s knock-in mice of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia

Den proarytmiske hjerteforstyrrelsen katekolaminerg polymorf ventrikkeltakykardi (CPVT) manifesterer seg som polymorfe ventrikulære takykardiepisoder etter fysisk aktivitet, stress eller katekolaminutfordring, som kan forverres til potensielt dødelig ventrikkelflimmer. Musehjertet er en utbredt art for modellering av arvelige hjertearytmiske sykdommer, inkludert CPVT. Samtidig optisk kartlegging av transmembranpotensiale (Vm) og kalsiumtransienter (CaT) fra Langendorff-perfuserte musehjerter har potensial til å belyse mekanismer som ligger til grunn for arytmogenesen. Sammenlignet med undersøkelsen på cellenivå kan den optiske kartleggingsteknikken teste noen elektrofysiologiske parametere, for eksempel bestemmelse av aktivering, ledningshastighet, aksjonspotensiell varighet og CaT-varighet. Denne artikkelen presenterer instrumenteringsoppsett og eksperimentell prosedyre for optisk kartlegging av CaT og Vm i villtype og heterozygot RyR2-R2474S/+ hjerter, kombinert med programmert elektrisk pacing før og under isoproterenolutfordringen. Denne tilnærmingen har vist en gjennomførbar og pålitelig metode for mekanistisk å studere CPVT-sykdom i en ex vivo musehjertepreparasjon.

Optisk kartlegging har vært en populær tilnærming til å studere komplekse hjertearytmier det siste tiåret. Det optiske kartleggingsoppsettet består av et EMCCD-kamera, som gir en samplingsfrekvens på opptil 1000 Hz og en romlig oppløsning på 74 x 74 μm for hver piksel. Det muliggjør et ganske høyt signal-støyforhold under signalsampling (figur 1). Når det Langendorff-perfuserte hjertet når en stabil tilstand og fargestoffbelastningen er ferdig, plasseres hjertet i det homooter...

Watch this Scientific Journal Video about Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia at JoVE.com

Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia

Denne protokollen introduserer dual-dye optisk kartlegging av musehjerter oppnådd fra villtype og knock-in dyr påvirket av katekolaminerg polymorf ventrikulær takykardi, inkludert elektrofysiologiske målinger av transmembranspenning og intracellulære Ca2+ transienter med høy temporal og romlig oppløsning.

Dual-Dye optisk kartlegging av hjerter fra RyR2R2474S Knock-In mus av katekolaminerg polymorf ventrikulær takykardi

The pro-arrhythmic cardiac disorder catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) manifests as polymorphic ventricular tachycardia episodes ...

Denne metoden vil hjelpe oss med å avsløre de elektrofysiologiske egenskapene og mekanismene for ventrikulær arrestutstryk forbundet med sykdommer som katekolaminerg polymorf ventrikulær takykardi. Ved hjelp av denne teknikken kan vi oppnå membranpotensialet og intercellulære kalsiumsignaler samtidig under forskjellige programmerte elektriske pacingprotokoller, noe som er spesielt egnet for å utforske de underliggende mekanismene og dynamikken til hjertearytmisk sykdom som CPVT. For å utføre dette eksperimentet vellykket, sørg for å ha et godt perfusert hjerte, riktig fargestoffbelastning, eksitasjon-sammentrekning frakobling og nøye kamerainnstillinger.For å begynne, sett opp det optiske kartleggingssystemet og slå på kameraet for stabil prøvetakingstemperatur på minus 50 grader Celsius. Plasser det høstede musehjertet i den kalde CREB-løsningen for å redusere stoffskiftet og beskytte hjertet. Fjern det omkringliggende vevet i aorta.Bruk en skreddersydd kanylerende nål til å kanylere den, og fest den med en 4-0 silkeutur. Nå perfuserer hjertet med Langendorff-systemet med en konstant hastighet på 3,5 til 4,0 milliliter per minutt. Sett inn et lite plastrør i venstre ventrikkel for å frigjøre overbelastning av løsningen i kammeret for å unngå overbelastning og fikse plastrøret i kanyleringsnålen.Legg deretter to ledninger i perfusatet i badekaret og slå på kreftene til elektrokardiogramforsterkerboksen og den elektriske stimuleringskontrolleren. Deretter starter du det refererte elektrokardiogrammet eller EKG-programvaren og overvåker EKG kontinuerlig. Utfør de påfølgende trinnene i mørket når hjertet når en stabil tilstand.Perfus blebbistatin CREBs løsningsblanding konstant inn i hjertet i 10 minutter for å koble sammentrekning fra eksitasjon og unngå sammentrekningsartefakter under filmingen. Bruk deretter en rød lommelykt, undersøk hjertet for å bekrefte fullstendig opphør av sammentrekninger. Perfus hjertet med Rhod-2 AM arbeidsløsning i 15 minutter i Langendorff perfusjonssystem etter frakobling av eksitasjonskontraksjon.Opprettholde oksygenforsyning under intracellulær kalsiumfargestoffbelastning. For å forhindre bobledannelse fra pluronisk F-127, sett inn en boblefelle i perfusjonssystemet. Fortynn 10 mikroliter RH 237 stamoppløsning i 50 ml perfusat og legg i 10 minutter.Når du har fullført dual dye-lastingen, ta en sekvens med bilder. Bekreft at spennings- og kalsiumsignaler er tilstrekkelige for analyse. Slå på de to lysdiodene for eksitasjonslys og juster intensiteten til riktig rekkevidde.Plasser hjertet under deteksjonsenheten, og sørg for at det er godt opplyst av de to lysdiodene som justerer lyspunktdiameteren til to centimeter. Sett arbeidsavstanden mellom linsen og hjertet på 10 centimeter for å oppnå ønsket samplingsfrekvens og romlig oppløsning. Åpne programvaren for signalprøvetaking for samtidig å styre kameraet og fange spennings- og kalsiumsignaler.Start MyoPacer Field Stimulator og sett pacingmønsteret til transistortransistorlogikk med to millisekunders tempovarighet per puls. Sett startintensiteten til 0,3 volt. Plasser et par platinaelektroder festet til epikardial av venstre ventrikkel apex.Påfør 30 påfølgende 10 hertz S1-stimuli for å teste hjertets diastoliske spenningsterskel ved hjelp av EKG-opptaksprogramvaren. Øk spenningsamplituden gradvis til en-til-en-opptak oppnås. Implementere S1-S1-protokollen for å måle kalsium eller aksjonspotensial og restitusjonsegenskaper.Tempo hjertet fortløpende starter på en grunnleggende syklus lengde på 100 millisekunder. Reduser sykluslengden med 10 millisekunder i hver påfølgende sekvens til den når 50 millisekunder. Start samtidig optisk kartlegging før stimulering.For å måle den effektive refraktære ventrikkelperioden ved hjelp av stimulusprotokollen S1-S2, start med en S1-S1 pacingsykluslengde på 100 millisekunder. Par S2 på 60 millisekunder og reduser med en trinnreduksjon på to millisekunder til S2 ikke klarer å fange ektopisk QRS-kompleks. For arytmiinduksjon, administrer evigvarende 50 hertz burst pacing og utfør samme pacing episode etter å ha ventet på et to sekunders hvileintervall.Overvåk nøye elektrokardiogramopptakene i løpet av den kontinuerlige høyfrekvente tempoperioden for raskt å starte samtidige optiske kartleggingsopptak når en interessant arytmisk bølge genereres. Fortsett å ta bilder ved hjelp av elektronmultiplikasjonsladningskoblet enhetskamera. I bildeinnsamlingsprogramvaren trykker du på Velg mappe og laster inn bilder for å starte den halvautomatiske massive videodataanalyseprosessen.Skriv inn de riktige prøvetakingsparametrene for analysen. Angi bildeterskelen manuelt, og velg interesseområdet. Bruk et gaussisk romfilter på tre ganger tre piksler, et Savitzky-Golay-filter og en baseline-korrigering med topphatten.Trykk deretter på Prosessbilder for å fjerne grunnlinjen og beregne elektrofysiologiske parametere som APD-80 og CATD-50. Sett initieringstiden for handlingspotensialets varighet på toppen og terminalpunktet til 80 % repolarisering for beregning av APD-80. På samme måte definerer du starttidspunktet for kalsiumforbigående varighet som toppen, med terminalpunktet 80 % avslapning.Typiske spor i varmekart over APD-80 og CATD-80 er vist. Isoproterenol forkorter APD-80 og villtype og katekolaminerg polymorf ventrikkeltakykardi eller CPVT-mus, men ingen forskjell ble funnet etter isoproterenolutfordring. CATD-80- og CPVT-mus var lengre enn hos vill type etter isoproterenolutfordringen, mens det ikke var noen signifikans før behandling.I henhold til spenningssignalene hadde villtype og CPVT-hjerter samme ledningsevne over epikardiet ved baseline og etter isoproterenolintervensjon. Varmekart viste at CPVT-mus har samme ledningsevne som villtypemusene før og etter isoproterenolutfordringen. Kalsiumamplitude alternativanalyse viste at kalsiumsignalene i villtype hjerter holdt seg stabile ved baseline under påfølgende S1-S1-pacing ved 14,29 og 16,67 hertz, mens CPVT-hjertene viste frekvensavhengige alternativer.Etter isoproterenolutfordringen viste CPVT-hjerter frekvensavhengige veksler og kalsiumsignal under S1-S1-pacing, mens villtype hjerter ikke ble påvirket. Tachy arytmianalyse antydet at både villtype og CPVT-hjerter utviser normal ledning under 50 hertz burst pacing ved baseline. Etter overflod med isoproterenol viste CPVT-hjerter høyfrekvente rotorer etter 50 hertz burst-pacing, mens villtypehjerter opprettholdt normal ledning.Etter denne prosedyren brukes adogentyper og villtypemus for å illustrere de elektrofysiologiske og funksjonelle egenskapene i disse modellene eller i oppfinnelsen av legemidler. Optisk kartlegging er et kraftig verktøy for studier av hjertearytmier, men det kan ikke brukes klinisk på grunn av begrensning i fluorescerende fargestoff under eksitasjonskontraksjonens frakobling. Med utviklingen av fluorescerende riktig for forskjellige målmolekyler under utvikling av høyrevolusjonsberegningsteknologi, er hjerteoptisk kartleggingsteknikk bundet til å oppnå bare applikasjoner.

Research

JoVE Journal

Biology

Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Isolering av embryonale Ventrikulære endotelceller

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Spenning og Kalsium Dual Channel Optisk Kartlegging av Cultured HL-en atrial myocyte med ett lag

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optisk Kartlegging av Intra-sarkoplasmatisk retikulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Og transmembranpotensiale i Langendorff-perfusert Rabbit Hjerte

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...