Name: generation of brown fat-specific knockout mice using a combined cre-loxp, crispr-cas9, and adeno-associated virus single-guide rna system
Uploaded: 2023-03-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Brown Fat-Specific Knockout Mice Using a Combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and Adeno-Associated Virus Single-Guide RNA System at JoVE.com

Dette arbejde blev delvist støttet af US National Institutes of Health (NIH) tilskud R01DK122808, R01DK102898 og R01DK132469 (til Y.-H.T.) samt P30DK036836 (til Joslin Diabetes Center's Diabetes Research Center). T. T. blev støttet af SUNSTAR Research Fellowship (Hiroo Kaneda Scholarship, Sunstar Foundation, Japan) og American Heart Association grant 903968. Y. Z. blev støttet af Charles A. King Trust Fellowship. Vi takker Sean D. Kodani for venligt at korrekturlæse manuskriptet.

Alle dyreforsøg og plejeprocedurer blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee på Joslin Diabetes Center.
1. Screening af effektive sgRNA'er i dyrkede celler
BEMÆRK: For at gøre analysen omkostningseffektiv, før vi pakker sgRNA'erne i AAV-partikler, anbefaler vi at teste forskellige sgRNA'er i dyrkede celler via et lentivirusbaseret system til Cas9 / sgRNA-ekspression (figur 1) og vælge de ...

<ol>
	<li>Kopelman, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+as+a+medical+problem.">Obesity as a medical problem.</a> Nature. 404 (6778), 635-643 (2000).</li><li>Finkelstein, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+severe+obesity+forecasts+through+2030.">Obesity and severe obesity forecasts through 2030.</a> American Journal of Preventive Medicine. 42 (6), 563-570 (2012).</li><li>Craft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+and+Alzheimer's+disease+pathogenesis:+Potential+mechanisms+and+implications+for+treatment.">Insulin resistance and Alzheimer's disease pathogenesis: Potential mechanisms and implications for treatment.</a> Current Alzheimer Research. 4 (2), 147-152 (2007).</li><li>Villarroya, F., Cereijo, R., Villarroya, J., Giralt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue+as+a+secretory+organ.">Brown adipose tissue as a secretory organ.</a> Nature Reviews Endocrinology. 13 (1), 26-35 (2017).</li><li>Scheele, C., Wolfrum, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+crosstalk+in+tissue+plasticity+and+human+metabolism.">Brown adipose crosstalk in tissue plasticity and human metabolism.</a> Endocrine Reviews. 41 (1), 53-65 (2020).</li><li>Becher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue+is+associated+with+cardiometabolic+health.">Brown adipose tissue is associated with cardiometabolic health.</a> Nature Medicine. 27 (1), 58-65 (2021).</li><li>Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+and+beige+fat:+Physiological+roles+beyond+heat+generation.">Brown and beige fat: Physiological roles beyond heat generation.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).</li><li>Scheja, L., Heeren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endocrine+function+of+adipose+tissues+in+health+and+cardiometabolic+disease.">The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease.</a> Nature Reviews Endocrinology. 15 (9), 507-524 (2019).</li><li>Darcy, J., Tseng, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ComBATing+aging-does+increased+brown+adipose+tissue+activity+confer+longevity.">ComBATing aging-does increased brown adipose tissue activity confer longevity.</a> Geroscience. 41 (3), 285-296 (2019).</li><li>da Silva Xavier, G., Hodson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+peripheral+metabolic+disease.">Mouse models of peripheral metabolic disease.</a> Best Practice &amp; Research Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 32 (3), 299-315 (2018).</li><li>Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Cre-LoxP+system:+General+principles+to+determine+tissue-specific+roles+of+target+genes.">Mouse Cre-LoxP system: General principles to determine tissue-specific roles of target genes.</a> Laboratory Animal Research. 34 (4), 147-159 (2018).</li><li>Wang, D., Zhang, F., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+therapeutic+genome+editing:+Strategies+and+in+vivo+delivery+by+AAV+vectors.">CRISPR-based therapeutic genome editing: Strategies and in vivo delivery by AAV vectors.</a> Cell. 181 (1), 136-150 (2020).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Dow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+in+vivo+genome+editing+with+CRISPR-Cas9.">Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 33 (4), 390-394 (2015).</li><li>Bates, R., Huang, W., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue:+An+emerging+target+for+adeno-associated+viral+vectors.">Adipose tissue: An emerging target for adeno-associated viral vectors.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 19, 236-249 (2020).</li><li>Sugimoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue-derived+MaR2+contributes+to+cold-induced+resolution+of+inflammation.">Brown adipose tissue-derived MaR2 contributes to cold-induced resolution of inflammation.</a> Nature Metabolism. 4 (6), 775-790 (2022).</li><li>Leiria, L. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=12-lipoxygenase+regulates+cold+adaptation+and+glucose+metabolism+by+producing+the+omega-3+lipid+12-HEPE+from+brown+fat.">12-lipoxygenase regulates cold adaptation and glucose metabolism by producing the omega-3 lipid 12-HEPE from brown fat.</a> Cell Metabolism. 30 (4), 768-783 (2019).</li><li>Shamsi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF6+and+FGF9+regulate+UCP1+expression+independent+of+brown+adipogenesis.">FGF6 and FGF9 regulate UCP1 expression independent of brown adipogenesis.</a> Nature Communications. 11, 1421 (2020).</li><li>Romanelli, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAd-CRISPR:+Inducible+gene+knockout+in+interscapular+brown+adipose+tissue+of+adult+mice.">BAd-CRISPR: Inducible gene knockout in interscapular brown adipose tissue of adult mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 297 (6), 101402 (2021).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+sgRNA+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+CRISPR-Cas9.">Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).</li><li>Sanson, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+libraries+for+CRISPR-Cas9+genetic+screens+with+multiple+modalities.">Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities.</a> Nature Communications. 9, 5416 (2018).</li><li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPOR:+Intuitive+guide+selection+for+CRISPR/Cas9+genome+editing+experiments+and+screens.">CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).</li><li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR.">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).</li><li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening.">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).</li><li>Tseng, Y. H., Kriauciunas, K. M., Kokkotou, E., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+insulin+receptor+substrates+in+brown+adipocyte+differentiation.">Differential roles of insulin receptor substrates in brown adipocyte differentiation.</a> Molecular and Cellular Biology. 24 (5), 1918-1929 (2004).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+Sample+preparation+to+detection.">Western blotting: Sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).</li><li>Jarrett, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+genome+editing+with+CRISPR/Cas9+generates+and+corrects+a+metabolic+disease.">Somatic genome editing with CRISPR/Cas9 generates and corrects a metabolic disease.</a> Scientific Reports. 7, 44624 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+RNA-targeting+CRISPR/Cas13d+technology+outperforms+shRNA+in+identifying+functional+circRNAs.">Optimized RNA-targeting CRISPR/Cas13d technology outperforms shRNA in identifying functional circRNAs.</a> Genome Biology. 22 (1), 41 (2021).</li><li>Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+purification,+and+quality+control+for+adeno-associated+virus-based+vectors.">Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).</li><li>Jimenez, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+adeno-associated+viral+vector-mediated+genetic+engineering+of+white+and+brown+adipose+tissue+in+adult+mice.">In vivo adeno-associated viral vector-mediated genetic engineering of white and brown adipose tissue in adult mice.</a> Diabetes. 62 (12), 4012-4022 (2013).</li><li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling.">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li><li>Huang, W., Queen, N. J., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rAAV-mediated+gene+delivery+to+adipose+tissue.">rAAV-mediated gene delivery to adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 1950, 389-405 (2019).</li><li>Xue, K., Wu, D., Qiu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+and+efficient+gene+knockout+and+overexpression+in+mouse+interscapular+brown+adipocytes+in+vivo.">Specific and efficient gene knockout and overexpression in mouse interscapular brown adipocytes in vivo.</a> STAR Protocols. 3 (4), 101895 (2022).</li></ol>

De eksisterende offentliggjorte metoder til AAV-medieret genlevering til interscapular BAT indeholder ikke detaljerede billeder og videoer, der beskriver de kirurgiske teknikker og tilgang til direkte AAV-injektion i BAT. I de fleste af de offentliggjorte metoder33,34 injiceres AAV i fedtvævet omkring den interscapulære BAT i stedet for selve BAT. Derfor er der flere vigtige trin i denne protokol, der bestemmer undersøgelsens succes. Disse omfatter design af s...

Fedme stiger betydeligt på verdensplan, hvilket fører til et bredt spektrum af metaboliske sygdomme 1,2,3. Fedtvævet er nøglen til disse patologier. De to funktionelt forskellige typer fedtvæv, der findes, er hvidt fedtvæv (WAT), som lagrer overskydende kalorier, og brunt fedtvæv (BAT) og dets relaterede beige / brite fedt, som spreder energi til termogenese. Mens BAT er blevet anerkendt for sin energiafledende funktion, har den også endokrine funktioner via produktionen af bioaktive molekyler, der regulerer stofskiftet i distale organer 4,5. Talrige undersøgelser hos gnavere har vist, at forøgelse af mængden eller aktiviteten af brunt eller beige fedt fører til øget energiforbrug og forbedret insulinfølsomhed. Hos mennesker har mennesker med påviselig BAT en signifikant lavere forekomst af kardiometaboliske sygdomme6. BAT har således fremragende terapeutisk potentiale for fedmerelaterede metaboliske følgevirkninger 7,8,9.
For at undersøge fysiologien og patofysiologien af BAT's udvikling og funktion og for at belyse de molekylære mekanismer, der er involveret i disse processer, er den BAT-specifikke transgene musemodel en metode til valg10. Cre-LoxP-rekombinationssystemet er det mest almindeligt anvendte middel til at producere betingede knockout-mus ved at redigere musegenomet. Dette system har muliggjort modifikation (overekspression eller knockout) af gener af interesse på en vævs-/cellespecifik måde11. Det kan også bruges til at mærke en bestemt celletype ved at udtrykke et selektivt fluorescerende reportergen.
For nylig er Cre-LoxP-systemtilgangen blevet videreudviklet ved at kombinere CRISPR-Cas9-teknologien og adeno-associeret virus (AAV) single-guide RNA (sgRNA) system12. CRISPR-Cas9-systemet er et specifikt og effektivt genredigeringsværktøj til at ændre, regulere eller målrette præcise regioner af genomet13. CRISPR-Cas9-baseret genomredigering muliggør hurtig genetisk manipulation af genomiske loci, fordi det ikke kræver homolog rekombination med en genmålretningsvektor. Kombinerede Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- og AAV-sgRNA-teknikker gør det muligt for forskere at forstå genfunktioner mere præcist ved at tillade undersøgelse af rollen af gener af interesse på ønskede tidspunkter i væv / celler. Derudover reducerer disse kombinerede teknikker den tid og kræfter, der kræves for at generere transgene mus og tillader tidsmæssig kontrol af CRISPR-Cas9-aktivitet til inducerbar genomredigering i mus, hvis der anvendes en inducerbar Cre-linje14.
AAV-vektorer er sikre og effektive in vivo-genleveringssystemer. AAV'er rettet mod fedtvæv har imidlertid haltet bagefter applikationer i andre væv, såsom hjerne, hjerte, lever og muskel15. På grund af den relativt lave transduktionseffektivitet og tropisme med naturligt forekommende serotypevektorer er AAV-guidet genlevering til fedtvæv stadig udfordrende15. I løbet af de sidste 5 år har vi og andre med succes etableret effektive og minimalt invasive måder at levere AAV-guidede gener i fedtvæv og skabt musemodeller, der giver os mulighed for at få en forståelse af de gener, der er involveret i reguleringen af BAT-funktion16,17,18,19. For eksempel ved at bruge AAV8 til at levere sgRNA rettet mod Alox12, som koder for 12-lipoxygenase (12-LOX), i BAT hos Ucp1-Cre/Cas9-musene, har vi opdaget, at aktiveret BAT producerer 12-LOX-metabolitter, nemlig 12-hydroxy-eicosapentaensyre (12-HEPE) og 13R, 14S-dihydroxydocosahexaensyre (maresin 2), for at regulere glukosemetabolismen og løse fedme-associeret inflammation, henholdsvis16, 17. Her leverer vi en trin-for-trin protokol om de tekniske procedurer, især operationen til direkte mikroinjektion af AAV-sgRNA i BAT-lapperne, for at generere BAT-specifikke knockout-mus ved hjælp af det kombinerede Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- og AAV-sgRNA-system.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM serum-free medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-LT1 Transfection Reagent</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>MIR 2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lentiCRISPR v2 vector&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>89060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G envelope plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2 packaging plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Cell Lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT-1 cells</td>
			<td>Developed in Tseng lab</td>
			<td>PMID: 14966273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Organisms/Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 knockin mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>24857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ucp1-CRE mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>24670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Banamine</td>
			<td>Patterson</td>
			<td>07-859-1323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Model 710 RN Syringe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/Bx</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>1273504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/Bx</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>1294522</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of brown fat-specific knockout mice using a combined cre-loxp, crispr-cas9, and adeno-associated virus single-guide rna system

Brunt fedtvæv (BAT) er et fedtdepot specialiseret i energiafledning, der også kan tjene som et endokrin organ via udskillelsen af bioaktive molekyler. Oprettelsen af BAT-specifikke knockout-mus er en af de mest populære tilgange til at forstå bidraget fra et gen af interesse til BAT-medieret energiregulering. Den konventionelle genmålretningsstrategi, der bruger Cre-LoxP-systemet, har været den vigtigste tilgang til at generere vævsspecifikke knockout-mus. Denne tilgang er imidlertid tidskrævende og kedelig. Her beskriver vi en protokol til hurtig og effektiv knockout af et gen af interesse for BAT ved hjælp af et kombineret Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 og adeno-associeret virus (AAV) single-guide RNA (sgRNA) system. Den interscapulære BAT er placeret i det dybe lag mellem musklerne. BAT skal således eksponeres for at injicere AAV præcist og direkte i BAT inden for synsfeltet. Passende kirurgisk håndtering er afgørende for at forhindre skade på de sympatiske nerver og kar, såsom Sultzers vene, der forbinder til BAT. For at minimere vævsskade er der et kritisk behov for at forstå den tredimensionelle anatomiske placering af BAT og de kirurgiske færdigheder, der kræves i de tekniske trin. Denne protokol fremhæver de vigtigste tekniske procedurer, herunder design af sgRNA'er rettet mod genet af interesse, forberedelse af AAV-sgRNA-partikler og kirurgi til direkte mikroinjektion af AAV i begge BAT-lobes til generering af BAT-specifikke knockout-mus, som bredt kan anvendes til at studere de biologiske funktioner af gener i BAT.

Gennem ovennævnte procedurer er den præcise levering af AAV-sgRNA til BAT afgørende for protokollens succes. For at maksimere effekten af AAV-sgRNA og minimere vævsskaden under operationen er det vigtigt at forstå den tredimensionelle (3D) anatomiske placering af BAT. Som vist i figur 3E er det svært at identificere den præcise placering af BAT uden at eksponere vævet. Overdreven BAT-eksponering kan dog beskadige vævet (figur 3H, I); pr...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Brown Fat-Specific Knockout Mice Using a Combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and Adeno-Associated Virus Single-Guide RNA System at JoVE.com

Generation of Brown Fat-Specific Knockout Mice Using a Combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and Adeno-Associated Virus Single-Guide RNA System

I denne protokol beskriver vi de tekniske procedurer til generering af brune fedtvæv (BAT)-specifikke knockout-mus, der udnytter et kombineret Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- og adeno-associeret virus (AAV) single-guide RNA (sgRNA) system. De beskrevne trin omfatter design af sgRNA'erne, fremstilling af AAV-sgRNA-partiklerne og mikroinjektion af AAV i BAT-loberne.

Generering af brune fedtspecifikke knockout-mus ved hjælp af et kombineret Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- og adeno-associeret virus-single-guide-RNA-system

Brown adipose tissue (BAT) is an adipose depot specialized in energy dissipation that can also serve as an endocrine organ via the secretion of bioactive ...

Denne protokol genererer brune fedtspecifikke knockout-mus ved hjælp af et Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 og adeno-associeret virus single-guide RNA-system. Det omfatter en kirurgisk teknik til sikkert at administrere AAV i det brune fedt. Den største fordel ved denne teknik er, at den hurtigt kan generere vævsspecifikke knockouts uden at skulle opdrætte mus selektivt.Tilgangen til fremstilling af vævsspecifik knockout eller knockdowns kan tilpasses andre væv, hvis den kirurgiske procedure til injektion af AAV ændres baseret på målorganet. Til at begynde med skal du administrere smertestillende subkutant til den bedøvede UCP1 Cre Cas9-mus for at minimere og forhindre postoperativ smerte og nød. Barber derefter pelsen på dens interscapular område ved hjælp af en barbermaskine, og steriliser det kirurgiske område med mindst tre skiftende runder af en jodbaseret eller chlorhexidinbaseret skrubbe efterfulgt af 70% ethanol.Brug en skalpel til at lave et to centimeter snit i huden over det brune fedtvæv mellem skulderbladene for at udsætte det interscapulære fedt. Efter at have lavet et enkelt snit, skær fedtvævet på grænsen mellem det distale område af fedtvæv og muskler. Brug derefter den kirurgiske saks i den dominerende hånd, skræl fedtvævet af stump og lodret for at udsætte det brune fedtvæv, mens du klemmer fedtvævet, herunder det brune fedtvæv, med den ikke-dominerende hånd.Brug Sulzers vene som et vartegn for at angive den præcise brune fedtvævsplacering. Derefter injiceres 20 mikroliter adeno-associeret virus eller AAV langsomt i hver lap af de to brune fedtvæv ved hjælp af en skarp 32 gauge nål forbundet til en 100 mikroliter Hamilton sprøjte. Bekræft vellykket injektion indikeret ved ingen lækager fra det injicerede sted under AAV-administrationen.Efter at have sikret homeostase, skal du placere det udsatte fedtvæv tilbage i deres normale position for at suturere kanten af fedtvæv og muskler ved hjælp af en 5-0 absorberbar monofilamenttråd. Sutur til sidst den åbne hud med 5-0 coatede VICRYL ufarvede flettede tråde. Den nøjagtige placering af det brune fedtvæv kan ikke identificeres uden at udsætte det, men overskydende eksponeringsskade på vævet.De potentielle fejl, der kan have ført til mislykkede injektioner, omfattede injektion af AAV-opløsningen i det forkerte område, nåleindtrængning gennem vævet og vævsballondannelse på grund af et for stort volumen af AAV-opløsningen. Den præcise levering af AAV single guide RNA til det brune fedtvæv var afgørende for protokollens succes. Nøglen til succes, mens du udsætter det brune fedtvæv, er kirurgisk sakseteknik, herunder saksens retning og dybde og placeringen af Hamilton-sprøjten.Denne teknik har et belastningsgenererende vævsspecifikt knockout-dyr for at forstå de molekylære regulatorer af brunt fedtrelateret energimetabolisme.

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

Substrat Generation for endonukleaser af CRISPR / Cas Systems

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

Generation af genomiske deletioner i pattedyrcellelinjer via CRISPR / Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

En kvantitativ Dot skamplet Assay for AAV titrering og dets anvendelse til funktionel vurdering af Adeno-associeret Virus forsamling-aktivering proteiner

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Kombinerede nukleotid og Protein ekstraktioner i Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Forberedelse og injektion af embryoner af Culex-myg til generering af Null-mutationer ved hjælp af CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

Genomteknik af primære humane B-celler ved hjælp af CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

Procesudvikling til produktion og rensning af Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector ved hjælp af Baculovirus-Insect Cell Culture System

Adeno-associated viruses (AAV) are promising vectors for gene therapy applications. Here, the AAV2 vector is produced by co-culture of Spodoptera ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...