Name: generation of brown fat-specific knockout mice using a combined cre-loxp, crispr-cas9, and adeno-associated virus single-guide rna system
Uploaded: 2023-03-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Brown Fat-Specific Knockout Mice Using a Combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and Adeno-Associated Virus Single-Guide RNA System at JoVE.com

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות של ארה"ב (NIH) R01DK122808, R01DK102898 ו-R01DK132469 (ל-Y.-H.T.), כמו גם P30DK036836 (למרכז לחקר הסוכרת של מרכז ג'וסלין). T. T. נתמך על ידי מלגת המחקר SUNSTAR (מלגת Hiroo Kaneda, קרן Sunstar, יפן) ומענק איגוד הלב האמריקאי 903968. י.ז. נתמך על ידי מלגת קרן צ'ארלס א. קינג. אנו מודים לשון ד. קודאני על ההגהה האדיבה של כתב היד.

כל הניסויים והליכי הטיפול בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במרכז ג'וסלין לסוכרת.
1. סינון sgRNA יעיל בתאים בתרבית
הערה: כדי להפוך את הבדיקה לחסכונית, לפני אריזת ה-sgRNA לחלקיקי AAV, אנו ממליצים לבדוק sgRNA שונים בתאים בתרבית באמ?...

<ol>
	<li>Kopelman, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+as+a+medical+problem.">Obesity as a medical problem.</a> Nature. 404 (6778), 635-643 (2000).</li><li>Finkelstein, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+severe+obesity+forecasts+through+2030.">Obesity and severe obesity forecasts through 2030.</a> American Journal of Preventive Medicine. 42 (6), 563-570 (2012).</li><li>Craft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+and+Alzheimer's+disease+pathogenesis:+Potential+mechanisms+and+implications+for+treatment.">Insulin resistance and Alzheimer's disease pathogenesis: Potential mechanisms and implications for treatment.</a> Current Alzheimer Research. 4 (2), 147-152 (2007).</li><li>Villarroya, F., Cereijo, R., Villarroya, J., Giralt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue+as+a+secretory+organ.">Brown adipose tissue as a secretory organ.</a> Nature Reviews Endocrinology. 13 (1), 26-35 (2017).</li><li>Scheele, C., Wolfrum, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+crosstalk+in+tissue+plasticity+and+human+metabolism.">Brown adipose crosstalk in tissue plasticity and human metabolism.</a> Endocrine Reviews. 41 (1), 53-65 (2020).</li><li>Becher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue+is+associated+with+cardiometabolic+health.">Brown adipose tissue is associated with cardiometabolic health.</a> Nature Medicine. 27 (1), 58-65 (2021).</li><li>Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+and+beige+fat:+Physiological+roles+beyond+heat+generation.">Brown and beige fat: Physiological roles beyond heat generation.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).</li><li>Scheja, L., Heeren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endocrine+function+of+adipose+tissues+in+health+and+cardiometabolic+disease.">The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease.</a> Nature Reviews Endocrinology. 15 (9), 507-524 (2019).</li><li>Darcy, J., Tseng, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ComBATing+aging-does+increased+brown+adipose+tissue+activity+confer+longevity.">ComBATing aging-does increased brown adipose tissue activity confer longevity.</a> Geroscience. 41 (3), 285-296 (2019).</li><li>da Silva Xavier, G., Hodson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+peripheral+metabolic+disease.">Mouse models of peripheral metabolic disease.</a> Best Practice &amp; Research Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 32 (3), 299-315 (2018).</li><li>Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Cre-LoxP+system:+General+principles+to+determine+tissue-specific+roles+of+target+genes.">Mouse Cre-LoxP system: General principles to determine tissue-specific roles of target genes.</a> Laboratory Animal Research. 34 (4), 147-159 (2018).</li><li>Wang, D., Zhang, F., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+therapeutic+genome+editing:+Strategies+and+in+vivo+delivery+by+AAV+vectors.">CRISPR-based therapeutic genome editing: Strategies and in vivo delivery by AAV vectors.</a> Cell. 181 (1), 136-150 (2020).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Dow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+in+vivo+genome+editing+with+CRISPR-Cas9.">Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 33 (4), 390-394 (2015).</li><li>Bates, R., Huang, W., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue:+An+emerging+target+for+adeno-associated+viral+vectors.">Adipose tissue: An emerging target for adeno-associated viral vectors.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 19, 236-249 (2020).</li><li>Sugimoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue-derived+MaR2+contributes+to+cold-induced+resolution+of+inflammation.">Brown adipose tissue-derived MaR2 contributes to cold-induced resolution of inflammation.</a> Nature Metabolism. 4 (6), 775-790 (2022).</li><li>Leiria, L. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=12-lipoxygenase+regulates+cold+adaptation+and+glucose+metabolism+by+producing+the+omega-3+lipid+12-HEPE+from+brown+fat.">12-lipoxygenase regulates cold adaptation and glucose metabolism by producing the omega-3 lipid 12-HEPE from brown fat.</a> Cell Metabolism. 30 (4), 768-783 (2019).</li><li>Shamsi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF6+and+FGF9+regulate+UCP1+expression+independent+of+brown+adipogenesis.">FGF6 and FGF9 regulate UCP1 expression independent of brown adipogenesis.</a> Nature Communications. 11, 1421 (2020).</li><li>Romanelli, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAd-CRISPR:+Inducible+gene+knockout+in+interscapular+brown+adipose+tissue+of+adult+mice.">BAd-CRISPR: Inducible gene knockout in interscapular brown adipose tissue of adult mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 297 (6), 101402 (2021).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+sgRNA+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+CRISPR-Cas9.">Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).</li><li>Sanson, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+libraries+for+CRISPR-Cas9+genetic+screens+with+multiple+modalities.">Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities.</a> Nature Communications. 9, 5416 (2018).</li><li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPOR:+Intuitive+guide+selection+for+CRISPR/Cas9+genome+editing+experiments+and+screens.">CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).</li><li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR.">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).</li><li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening.">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).</li><li>Tseng, Y. H., Kriauciunas, K. M., Kokkotou, E., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+insulin+receptor+substrates+in+brown+adipocyte+differentiation.">Differential roles of insulin receptor substrates in brown adipocyte differentiation.</a> Molecular and Cellular Biology. 24 (5), 1918-1929 (2004).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+Sample+preparation+to+detection.">Western blotting: Sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).</li><li>Jarrett, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+genome+editing+with+CRISPR/Cas9+generates+and+corrects+a+metabolic+disease.">Somatic genome editing with CRISPR/Cas9 generates and corrects a metabolic disease.</a> Scientific Reports. 7, 44624 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+RNA-targeting+CRISPR/Cas13d+technology+outperforms+shRNA+in+identifying+functional+circRNAs.">Optimized RNA-targeting CRISPR/Cas13d technology outperforms shRNA in identifying functional circRNAs.</a> Genome Biology. 22 (1), 41 (2021).</li><li>Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+purification,+and+quality+control+for+adeno-associated+virus-based+vectors.">Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).</li><li>Jimenez, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+adeno-associated+viral+vector-mediated+genetic+engineering+of+white+and+brown+adipose+tissue+in+adult+mice.">In vivo adeno-associated viral vector-mediated genetic engineering of white and brown adipose tissue in adult mice.</a> Diabetes. 62 (12), 4012-4022 (2013).</li><li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling.">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li><li>Huang, W., Queen, N. J., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rAAV-mediated+gene+delivery+to+adipose+tissue.">rAAV-mediated gene delivery to adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 1950, 389-405 (2019).</li><li>Xue, K., Wu, D., Qiu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+and+efficient+gene+knockout+and+overexpression+in+mouse+interscapular+brown+adipocytes+in+vivo.">Specific and efficient gene knockout and overexpression in mouse interscapular brown adipocytes in vivo.</a> STAR Protocols. 3 (4), 101895 (2022).</li></ol>

השיטות הקיימות שפורסמו להעברת גנים בתיווך AAV ל- BAT interscapular אינן מכילות תמונות וסרטונים מפורטים המתארים את טכניקות הניתוח ואת הגישה להזרקת AAV ישירה ל- BAT. ברוב השיטות שפורסמו33,34, AAV מוזרק לתוך רקמות השומן סביב BAT interscapular במקום BAT עצמו. לפיכך, ישנם מספר שלבים מרכזי?...

השמנת יתר עולה בקצב משמעותי ברחבי העולם, מה שמוביל למגוון רחב של מחלות מטבוליות 1,2,3. רקמת השומן היא המפתח לפתולוגיות אלה. שני הסוגים השונים מבחינה תפקודית של רקמת השומן הקיימים הם רקמת השומן הלבנה (WAT), המאחסנת קלוריות עודפות, ורקמת השומן החומה (BAT) ושומן הבז'/בריט הקשור אליה, המפזרים אנרגיה לצורך תרמוגנזה. בעוד BAT כבר מוכר על תפקוד פיזור האנרגיה שלה, יש לו גם פונקציות אנדוקריניות באמצעות ייצור של מולקולות ביו-אקטיביות המווסתות את חילוף החומרים באיברים דיסטליים 4,5. מחקרים רבים במכרסמים הוכיחו כי הגדלת כמות או פעילות השומן החום או הבז' מובילה להוצאה אנרגטית מוגברת ולשיפור הרגישות לאינסולין. בבני אדם, אנשים עם BAT לגילוי יש שכיחות נמוכה משמעותית של מחלות cardiometabolic6. לפיכך, BAT טומן בחובו פוטנציאל טיפולי מצוין עבור sequelae מטבולי הקשור להשמנת יתר 7,8,9.
כדי לחקור את הפיזיולוגיה והפתופיזיולוגיה של התפתחות ותפקוד BAT ולהבהיר את המנגנונים המולקולריים המעורבים בתהליכים אלה, מודל העכבר המהונדס הספציפי ל-BAT הוא שיטה לבחירה10. מערכת הרקומבינציה Cre-LoxP היא האמצעי הנפוץ ביותר לייצור עכברי נוקאאוט מותנה על ידי עריכת גנום העכבר. מערכת זו אפשרה שינוי (ביטוי יתר או נוקאאוט) של גנים בעלי עניין באופן ספציפי לרקמה/תא11. ניתן להשתמש בו גם כדי לתייג סוג תא מסוים על ידי ביטוי גן כתב פלואורסצנטי סלקטיבי.
לאחרונה, גישת מערכת Cre-LoxP פותחה עוד יותר על ידי שילוב של טכנולוגיית CRISPR-Cas9 ומערכת RNA (sgRNA)12 הקשורה לווירוס אדנו (AAV). מערכת CRISPR-Cas9 היא כלי ספציפי ויעיל לעריכת גנים כדי לשנות, לווסת או להתמקד באזורים מדויקים של גנום13. עריכת גנום מבוססת CRISPR-Cas9 מאפשרת מניפולציה גנטית מהירה של אתרים גנומיים מכיוון שהיא אינה דורשת רקומבינציה הומולוגית עם וקטור מיקוד גנים. טכניקות משולבות של Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ו-AAV-sgRNA מאפשרות לחוקרים להבין את תפקודי הגנים בצורה מדויקת יותר בכך שהן מאפשרות לחקור את תפקידם של גנים מעניינים בזמנים רצויים ברקמות/תאים. בנוסף, טכניקות משולבות אלה מפחיתות את הזמן והמאמץ הנדרשים ליצירת עכברים טרנסגניים ומאפשרות בקרה זמנית של פעילות CRISPR-Cas9 לעריכת גנום אינדוקטיבי בעכברים אם נעשה שימוש בקו Cre מושרה14.
וקטורי AAV בטוחים ויעילים במערכות העברת גנים vivo. עם זאת, AAVs המכוונים לרקמת שומן פיגרו אחרי יישומים ברקמות אחרות, כגון המוח, הלב, הכבד ושריר15. בשל יעילות ההולכה הנמוכה יחסית והטרופיזם עם וקטורי סרוטיפ טבעיים, העברת גנים מונחי AAV לרקמת השומן עדיין מאתגרת15. במהלך 5 השנים האחרונות, אנו ואחרים ביססנו בהצלחה דרכים יעילות וזעיר פולשניות להעברת גנים מונחי AAV לרקמת השומן ויצרנו מודלים עכבריים המאפשרים לנו להבין את הגנים המעורבים בוויסות תפקוד BAT16,17,18,19. לדוגמה, על ידי שימוש ב- AAV8 כדי לספק sgRNA המכוון ל- Alox12, המקודד 12-lipoxygenase (12-LOX), לתוך ה- BAT של עכברי Ucp1-Cre/Cas9, גילינו כי BAT פעיל מייצר מטבוליטים של 12-LOX, כלומר 12-hydroxy-eicosapentaenoic acid (12-HEPE) ו- 13R, 14S-dihydroxy docosahexaenoic acid (maresin 2), כדי לווסת את חילוף החומרים של גלוקוז ולפתור דלקת הקשורה להשמנת יתר, בהתאמה16, 17. כאן, אנו מספקים פרוטוקול שלב אחר שלב על ההליכים הטכניים, במיוחד הניתוח למיקרו-הזרקה ישירה של AAV-sgRNA לאונות העטלף, כדי ליצור עכברי נוקאאוט ספציפיים ל-BAT באמצעות מערכת Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ו-AAV-sgRNA המשולבת.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM serum-free medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-LT1 Transfection Reagent</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>MIR 2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lentiCRISPR v2 vector&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>89060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G envelope plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2 packaging plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Cell Lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT-1 cells</td>
			<td>Developed in Tseng lab</td>
			<td>PMID: 14966273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Organisms/Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 knockin mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>24857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ucp1-CRE mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>24670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Banamine</td>
			<td>Patterson</td>
			<td>07-859-1323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Model 710 RN Syringe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/Bx</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>1273504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/Bx</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>1294522</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of brown fat-specific knockout mice using a combined cre-loxp, crispr-cas9, and adeno-associated virus single-guide rna system

רקמת שומן חומה (BAT) היא מחסן שומן המתמחה בפיזור אנרגיה שיכול לשמש גם כאיבר אנדוקריני באמצעות הפרשת מולקולות ביו-אקטיביות. יצירת עכברי נוקאאוט ספציפיים ל-BAT היא אחת הגישות הפופולריות ביותר להבנת תרומתו של גן מעניין לוויסות אנרגיה בתיווך BAT. אסטרטגיית מיקוד הגנים הקונבנציונלית המשתמשת במערכת Cre-LoxP הייתה הגישה העיקרית ליצירת עכברי נוקאאוט ספציפיים לרקמות. עם זאת, גישה זו גוזלת זמן ומייגעת. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול לנוקאאוט מהיר ויעיל של גן בעל עניין ב-BAT באמצעות מערכת משולבת של Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ו-ADENO-associated virus (AAV) Single Guide RNA (sgRNA). ה- BAT interscapular ממוקם בשכבה העמוקה בין השרירים. לכן, ה-BAT חייב להיות חשוף על מנת להזריק את ה-AAV בצורה מדויקת וישירה לתוך ה-BAT בתוך שדה הראייה. טיפול כירורגי מתאים הוא חיוני למניעת נזק לעצבים ולכלי הדם הסימפתטיים, כגון וריד הזולצר המתחבר ל- BAT. כדי למזער את הנזק לרקמות, יש צורך קריטי להבין את המיקום האנטומי התלת מימדי של ה- BAT ואת המיומנויות הכירורגיות הנדרשות בשלבים הטכניים. פרוטוקול זה מדגיש את ההליכים הטכניים העיקריים, כולל תכנון sgRNA המכוון לגן המעניין, הכנת חלקיקי AAV-sgRNA, והניתוח למיקרו-הזרקה ישירה של AAV לשתי אונות BAT ליצירת עכברי נוקאאוט ספציפיים ל-BAT, שניתן ליישם באופן נרחב כדי לחקור את הפונקציות הביולוגיות של גנים ב-BAT.

לאורך כל ההליכים לעיל, המסירה המדויקת של AAV-sgRNA ל- BAT היא קריטית להצלחת הפרוטוקול. כדי למקסם את ההשפעה של AAV-sgRNA ולמזער את הנזק לרקמות במהלך הניתוח, חיוני להבין את המיקום האנטומי התלת-ממדי (3D) של ה- BAT. כפי שניתן לראות באיור 3E, קשה לזהות את המיקום המדויק של ה-BAT מבלי לחשוף את הרקמה. ?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Brown Fat-Specific Knockout Mice Using a Combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and Adeno-Associated Virus Single-Guide RNA System at JoVE.com

Generation of Brown Fat-Specific Knockout Mice Using a Combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and Adeno-Associated Virus Single-Guide RNA System

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את ההליכים הטכניים ליצירת עכברי נוקאאוט ספציפיים לרקמת שומן חומה (BAT) הממנפים מערכת משולבת של Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ו- ADENO-associated virus (AAV) Single Guide RNA (sgRNA). השלבים המתוארים כוללים את התכנון של sgRNAs, הכנת חלקיקי AAV-sgRNA, ואת microinjection של AAV לתוך אונות BAT.

יצירת עכברי נוקאאוט ספציפיים לשומן חום באמצעות מערכת RNA חד-מנחה משולבת של Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ו-Adeno-Associated Virus

Brown adipose tissue (BAT) is an adipose depot specialized in energy dissipation that can also serve as an endocrine organ via the secretion of bioactive ...

פרוטוקול זה מייצר עכברי נוקאאוט ספציפיים לשומן חום באמצעות Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ומערכת RNA חד-מנחה הקשורה לווירוסים הקשורים לאדנו. הוא כולל טכניקה כירורגית כדי לנהל בבטחה AAV לתוך השומן החום. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה ליצור במהירות נוקאאוטים ספציפיים לרקמות ללא צורך לגדל עכברים באופן סלקטיבי.הגישה להכנת נוקאאוט ספציפי לרקמות או הפלות יכולה להיות מותאמת לרקמות אחרות אם ההליך הכירורגי להזרקת AAV משתנה על בסיס איבר היעד. כדי להתחיל, לנהל את משכך כאבים תת עורית לעכבר UCP1 Cre Cas9 מורדם כדי למזער ולמנוע כאב ומצוקה לאחר הניתוח. לאחר מכן יש לגלח את הפרווה על האזור הבין-סקפולרי שלה באמצעות מכונת גילוח, ולעקר את אזור הניתוח עם לפחות שלושה סיבובים לסירוגין של פילינג על בסיס יוד או כלורהקסידין, ואחריו 70% אתנול.באמצעות אזמל, לבצע חתך של שני סנטימטרים בעור מעל רקמת השומן החומה בין עצם השכמה כדי לחשוף את השומן interscapular. לאחר ביצוע חתך יחיד, לחתוך את רקמות השומן על הגבול בין האזור הדיסטלי של רקמות השומן והשרירים. לאחר מכן בעזרת המספריים הכירורגיים ביד הדומיננטית, מקלפים את רקמות השומן בצורה בוטה ואנכית כדי לחשוף את רקמת השומן החומה תוך צביטת רקמות השומן, כולל רקמת השומן החומה, ביד הלא דומיננטית.השתמש בווריד של זולצר כציון דרך כדי לציין את המיקום המדויק של רקמת השומן החומה. לאחר מכן, עבור כל עכבר, הזריקו 20 מיקרוליטר של וירוס הקשור לאדנו או AAV באיטיות לכל אונה של שתי רקמות השומן החומות באמצעות מחט חדה, 32 מד, המחוברת למזרק המילטון 100 מיקרוליטר. יש לוודא שההזרקה המוצלחת מסומנת בכך שאין דליפות מהאתר המוזרק במהלך מתן ה-AAV.לאחר הבטחת הומאוסטזיס, החזירו את רקמות השומן החשופות למקומן הרגיל כדי לתפור את קצה רקמות השומן והשריר באמצעות חוט מונופילמנט נספג 5-0. לבסוף, תפרו את העור הפתוח בחוטים קלועים לא צבועים 5-0 VICRYL מצופים. לא ניתן לזהות את מיקומה המדויק של רקמת השומן החום מבלי לחשוף אותה, אולם חשיפה עודפת פוגעת ברקמה.הפגמים הפוטנציאליים שאולי הובילו להזרקות לא מוצלחות כללו הזרקת תמיסת AAV לאזור הלא נכון, חדירת מחט דרך הרקמה, ובלון רקמה עקב נפח מוגזם של תמיסת AAV. ההעברה המדויקת של RNA מנחה יחיד AAV לרקמת השומן החומה הייתה חיונית להצלחת הפרוטוקול. המפתח להצלחה בחשיפת רקמת השומן החומה הוא טכניקת מספריים כירורגית, כולל כיוון ועומק המספריים, ומיקום מזרק המילטון.לטכניקה זו יש חיות נוקאאוט ספציפיות לרקמות המייצרות עומסים כדי להבין את הרגולטורים המולקולריים של מטבוליזם האנרגיה הקשור לשומן חום.

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

הדמיה ב-RNA לוקליזציה Xenopus ביציות

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

דור מצע לEndonucleases של מערכות CRISPR / קאש

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

דור של מחיקות הגנומי בשורות תאים יונקים באמצעות CRISPR / Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

וזמינותו חשופה כמותיים נקודה עבור טיטור AAV והשימוש בה להערכה תפקודית של וירוס Adeno-הקשורים ההרכבה-הפעלת חלבונים

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

משולב נוקלאוטיד שיחולץ חלבון ב Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

הכנה והזרקה של עוברים של יתושי קולקס כדי ליצור מוטציות Null באמצעות CRISPR /Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

הנדסת גנום של תאי B אנושיים ראשוניים באמצעות CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

פיתוח תהליכים לייצור וטיהור של וירוס הקשורים לאדנו (AAV)2 וקטור באמצעות מערכת תרבית תאים של חרקים בקלווירוס

Adeno-associated viruses (AAV) are promising vectors for gene therapy applications. Here, the AAV2 vector is produced by co-culture of Spodoptera ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...