Name: generation of brown fat-specific knockout mice using a combined cre-loxp, crispr-cas9, and adeno-associated virus single-guide rna system
Uploaded: 2023-03-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Brown Fat-Specific Knockout Mice Using a Combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and Adeno-Associated Virus Single-Guide RNA System at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato in parte dalle sovvenzioni del National Institutes of Health (NIH) degli Stati Uniti R01DK122808, R01DK102898 e R01DK132469 (a Y.-H.T.), nonché P30DK036836 (al Diabetes Research Center del Joslin Diabetes Center). T. T. è stato sostenuto dalla SUNSTAR Research Fellowship (Hiroo Kaneda Scholarship, Sunstar Foundation, Giappone) e dalla borsa di studio dell'American Heart Association 903968. Y. Z. è stato sostenuto dalla Charles A. King Trust Fellowship. Ringraziamo Sean D. Kodani per la gentile correzione del manoscritto.

Tutti gli esperimenti sugli animali e le procedure di cura sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso il Joslin Diabetes Center.
1. Screening di sgRNA efficaci in cellule in coltura
NOTA: Per rendere il test economicamente vantaggioso, prima di confezionare gli sgRNA in particelle AAV, si consiglia di testare diversi sgRNA in cellule coltivate tramite un sistema basato su lentivirus per l'espressi...

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J., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rAAV-mediated+gene+delivery+to+adipose+tissue.">rAAV-mediated gene delivery to adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 1950, 389-405 (2019).</li><li>Xue, K., Wu, D., Qiu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+and+efficient+gene+knockout+and+overexpression+in+mouse+interscapular+brown+adipocytes+in+vivo.">Specific and efficient gene knockout and overexpression in mouse interscapular brown adipocytes in vivo.</a> STAR Protocols. 3 (4), 101895 (2022).</li></ol>

I metodi pubblicati esistenti per la somministrazione genica mediata da AAV alla BAT interscapolare non contengono immagini e video dettagliati che descrivono le tecniche chirurgiche e l'approccio per l'iniezione diretta di AAV nel BAT. Nella maggior parte dei metodi pubblicati33,34, l'AAV viene iniettato nei tessuti adiposi che circondano il BAT interscapolare anziché nel BAT stesso. Quindi, ci sono diversi passaggi chiave in questo protocollo che determinano i...

L'obesità sta aumentando a un ritmo significativo in tutto il mondo, portando a un ampio spettro di malattie metaboliche 1,2,3. Il tessuto adiposo è fondamentale per queste patologie. I due tipi funzionalmente distinti di tessuto adiposo che esistono sono il tessuto adiposo bianco (WAT), che immagazzina calorie in eccesso, e il tessuto adiposo bruno (BAT) e il relativo grasso beige / brite, che dissipa energia per la termogenesi. Mentre il BAT è stato riconosciuto per la sua funzione di dissipazione dell'energia, ha anche funzioni endocrine attraverso la produzione di molecole bioattive che regolano il metabolismo negli organi distali 4,5. Numerosi studi sui roditori hanno dimostrato che aumentare la quantità o l'attività del grasso bruno o beige porta ad un aumento del dispendio energetico e una migliore sensibilità all'insulina. Nell'uomo, le persone con BAT rilevabile hanno una prevalenza significativamente inferiore di malattie cardiometaboliche6. Pertanto, la BAT ha un eccellente potenziale terapeutico per le sequele metaboliche correlate all'obesità 7,8,9.
Per studiare la fisiologia e la fisiopatologia dello sviluppo e della funzione delle BAT e per chiarire i meccanismi molecolari coinvolti in questi processi, il modello murino transgenico specifico per BAT è un metodo di scelta10. Il sistema di ricombinazione Cre-LoxP è il mezzo più comunemente usato per produrre topi knockout condizionali modificando il genoma del topo. Questo sistema ha permesso la modifica (sovraespressione o knockout) di geni di interesse in modo tessuto/cellula-specifico11. Può anche essere utilizzato per marcare un tipo di cellula specifico esprimendo un gene reporter fluorescente selettivo.
Recentemente, l'approccio sistemico Cre-LoxP è stato ulteriormente sviluppato combinando la tecnologia CRISPR-Cas9 e il sistema di RNA a guida singola (sgRNA) del virus adeno-associato (AAV)12. Il sistema CRISPR-Cas9 è uno strumento di modifica genetica specifico ed efficiente per modificare, regolare o indirizzare regioni precise del genoma13. L'editing del genoma basato su CRISPR-Cas9 consente una rapida manipolazione genetica dei loci genomici perché non richiede una ricombinazione omologa con un vettore di targeting genico. Le tecniche combinate Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e AAV-sgRNA consentono ai ricercatori di comprendere le funzioni geniche in modo più preciso consentendo lo studio del ruolo dei geni di interesse nei momenti desiderati nei tessuti / cellule. Inoltre, queste tecniche combinate riducono il tempo e lo sforzo necessari per generare topi transgenici e consentono il controllo temporale dell'attività di CRISPR-Cas9 per l'editing del genoma inducibile nei topi se viene utilizzata una linea Cre inducibile14.
I vettori AAV sono sistemi di veicolazione genica in vivo sicuri ed efficaci. Tuttavia, gli AAV che prendono di mira il tessuto adiposo sono rimasti indietro rispetto alle applicazioni in altri tessuti, come cervello, cuore, fegato e muscolo15. A causa dell'efficienza di trasduzione relativamente bassa e del tropismo con vettori di sierotipo presenti in natura, la consegna genica guidata da AAV al tessuto adiposo è ancora impegnativa15. Negli ultimi 5 anni, noi e altri abbiamo stabilito con successo modi efficaci e minimamente invasivi per fornire geni guidati da AAV nel tessuto adiposo e creato modelli murini che ci permettono di acquisire una comprensione dei geni coinvolti nella regolazione della funzione BAT16,17,18,19. Ad esempio, utilizzando AAV8 per veicolare sgRNA targeting Alox12, che codifica per la 12-lipossigenasi (12-LOX), nel BAT dei topi Ucp1-Cre/Cas9, abbiamo scoperto che il BAT attivato produce 12-LOX metaboliti, vale a dire acido 12-idrossi-eicosapentaenoico (12-HEPE) e acido 13R, 14S-diidrossi docosaesaenoico (maresina 2), per regolare il metabolismo del glucosio e risolvere l'infiammazione associata all'obesità, rispettivamente16, 17. Qui, forniamo un protocollo passo-passo sulle procedure tecniche, in particolare la chirurgia per la microiniezione diretta di AAV-sgRNA nei lobi BAT, per generare topi knockout specifici per BAT utilizzando il sistema combinato Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e AAV-sgRNA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM serum-free medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-LT1 Transfection Reagent</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>MIR 2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lentiCRISPR v2 vector&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>89060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G envelope plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2 packaging plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Cell Lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT-1 cells</td>
			<td>Developed in Tseng lab</td>
			<td>PMID: 14966273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Organisms/Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 knockin mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>24857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ucp1-CRE mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>24670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Banamine</td>
			<td>Patterson</td>
			<td>07-859-1323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Model 710 RN Syringe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/Bx</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>1273504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/Bx</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>1294522</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of brown fat-specific knockout mice using a combined cre-loxp, crispr-cas9, and adeno-associated virus single-guide rna system

Il tessuto adiposo bruno (BAT) è un deposito adiposo specializzato nella dissipazione di energia che può anche servire come organo endocrino attraverso la secrezione di molecole bioattive. La creazione di topi knockout specifici per BAT è uno degli approcci più popolari per comprendere il contributo di un gene di interesse alla regolazione dell'energia mediata da BAT. La strategia convenzionale di targeting genico che utilizza il sistema Cre-LoxP è stato l'approccio principale per generare topi knockout tessuto-specifici. Tuttavia, questo approccio richiede tempo e noia. Qui, descriviamo un protocollo per il knockout rapido ed efficiente di un gene di interesse in BAT utilizzando un sistema combinato Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e virus adeno-associato (AAV) a guida singola (sgRNA). Il BAT interscapolare si trova nello strato profondo tra i muscoli. Pertanto, il BAT deve essere esposto per iniettare l'AAV in modo preciso e diretto nel BAT all'interno del campo visivo. Una corretta manipolazione chirurgica è fondamentale per prevenire danni ai nervi e ai vasi simpatici, come la vena di Sultzer che si collega al BAT. Per ridurre al minimo il danno tissutale, vi è una necessità critica di comprendere la posizione anatomica tridimensionale del BAT e le competenze chirurgiche richieste nelle fasi tecniche. Questo protocollo evidenzia le procedure tecniche chiave, tra cui la progettazione di sgRNA mirati al gene di interesse, la preparazione di particelle AAV-sgRNA e l'intervento chirurgico per la microiniezione diretta di AAV in entrambi i lobi BAT per generare topi knockout specifici per BAT, che possono essere ampiamente applicati per studiare le funzioni biologiche dei geni nelle BAT.

Durante le procedure di cui sopra, la consegna precisa di AAV-sgRNA alla BAT è cruciale per il successo del protocollo. Per massimizzare l'effetto di AAV-sgRNA e minimizzare il danno tissutale durante l'intervento chirurgico, è essenziale comprendere la posizione anatomica tridimensionale (3D) del BAT. Come mostrato nella Figura 3E, è difficile identificare la posizione precisa della BAT senza esporre il tessuto. Tuttavia, l'esposizione eccessiva alle BAT può danneggiare il tessuto (<str...

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Generation of Brown Fat-Specific Knockout Mice Using a Combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and Adeno-Associated Virus Single-Guide RNA System

In questo protocollo, descriviamo le procedure tecniche per generare topi knockout specifici per il tessuto adiposo bruno (BAT) sfruttando un sistema combinato di Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e RNA a guida singola (sgRNA) del virus adeno-associato (AAV). I passaggi descritti includono la progettazione degli sgRNA, la preparazione delle particelle AAV-sgRNA e la microiniezione di AAV nei lobi BAT.

Generazione di topi knockout specifici per il grasso bruno utilizzando un sistema combinato di RNA a guida singola Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e virus adeno-associato

Brown adipose tissue (BAT) is an adipose depot specialized in energy dissipation that can also serve as an endocrine organ via the secretion of bioactive ...

Questo protocollo genera topi knockout specifici per il grasso bruno utilizzando un sistema di RNA a guida singola Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e virus adeno-associato. Include una tecnica chirurgica per somministrare in modo sicuro AAV nel grasso bruno. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può generare rapidamente knockout tessuto-specifici senza bisogno di allevare topi in modo selettivo.L'approccio per effettuare knockout o knockdown tessuto-specifici può essere adattato ad altri tessuti se la procedura chirurgica per l'iniezione di AAV viene modificata in base all'organo bersaglio. Per iniziare, somministrare l'analgesico per via sottocutanea al topo UCP1 Cre Cas9 anestetizzato per ridurre al minimo e prevenire il dolore e l'angoscia postoperatori. Quindi radere la pelliccia sulla sua area interscapolare usando un rasoio e sterilizzare l'area chirurgica con almeno tre cicli alternati di uno scrub a base di iodio o clorexidina, seguito da etanolo al 70%.Usando un bisturi, fai un'incisione di due centimetri nella pelle sopra il tessuto adiposo bruno tra le scapole per esporre il grasso interscapolare. Dopo aver praticato una singola incisione, tagliare i tessuti adiposi al confine tra la regione distale dei tessuti grassi e dei muscoli. Quindi, utilizzando le forbici chirurgiche nella mano dominante, staccare i tessuti grassi senza mezzi termini e verticalmente per esporre il tessuto adiposo bruno mentre pizzicare i tessuti adiposi, incluso il tessuto adiposo bruno, con la mano non dominante.Utilizzare la vena di Sulzer come punto di riferimento per indicare la posizione precisa del tessuto adiposo bruno. Successivamente, per ogni topo, iniettare lentamente 20 microlitri di virus adeno-associato o AAV in ciascun lobo dei due tessuti adiposi bruni utilizzando un ago affilato di calibro 32 collegato a una siringa di Hamilton da 100 microlitri. Confermare la riuscita dell'iniezione indicata dall'assenza di perdite dal sito iniettato durante la somministrazione di AAV.Dopo aver assicurato l'omeostasi, riposizionare i tessuti adiposi esposti nella loro posizione normale per suturare il bordo dei tessuti adiposi e del muscolo utilizzando un filo monofilamento assorbibile 5-0. Infine, suturare la pelle aperta con 5-0 rivestiti VICRYL fili intrecciati non tinti. La posizione precisa del tessuto adiposo bruno non può essere identificata senza esporlo, tuttavia, danni da esposizione eccessiva al tessuto.I potenziali difetti che potrebbero aver portato a iniezioni infruttuose includevano l'iniezione della soluzione AAV nella regione errata, la penetrazione dell'ago attraverso il tessuto e il gonfiamento del tessuto a causa di un volume eccessivo della soluzione AAV. La consegna precisa dell'RNA guida singola AAV al tessuto adiposo bruno è stata fondamentale per il successo del protocollo. La chiave del successo durante l'esposizione del tessuto adiposo bruno è la tecnica chirurgica a forbice, compresa la direzione e la profondità delle forbici e la posizione della siringa di Hamilton.Questa tecnica ha un carico che genera animali knockout tessuto-specifici per comprendere i regolatori molecolari del metabolismo energetico correlato al grasso bruno.

Research

JoVE Journal

Biology

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Biologia

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