Name: generation of brown fat-specific knockout mice using a combined cre-loxp, crispr-cas9, and adeno-associated virus single-guide rna system
Uploaded: 2023-03-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Brown Fat-Specific Knockout Mice Using a Combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and Adeno-Associated Virus Single-Guide RNA System at JoVE.com

この研究の一部は、米国国立衛生研究所(NIH)の助成金R01DK122808、R01DK102898、およびR01DK132469(Y.-H.T.へ)、およびP30DK036836(ジョスリン糖尿病センターの糖尿病研究センターへ)によって支援されました。T. T.は、サンスター・リサーチ・フェローシップ(金田博夫奨学金、サンスター財団)および米国心臓協会助成金903968の支援を受けました。Y.Z.はチャールズA.キングトラストフェローシップによってサポートされました。原稿を校正してくださったショーン・D・コダニに感謝します。

すべての動物実験とケア手順は、ジョスリン糖尿病センターの施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
1. 培養細胞における有効sgRNAのスクリーニング
注:アッセイを費用対効果の高いものにするために、sgRNAをAAV粒子にパッケージングする前に、Cas9/sgRNA発現用のレンチウイルスベースのシステム を介して 培養細胞?...

<ol>
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肩甲骨間BATへのAAV媒介遺伝子送達のための既存の公開された方法には、BATへのAAV直接注入のための外科的技術とアプローチを説明する詳細な写真とビデオは含まれていません。公表された方法33,34のほとんどにおいて、AAVは、BAT自体ではなく、肩甲骨間BAT周囲の脂肪組織に注入される。したがって、このプロトコルには、研究の成功を決定するいく...

肥満は世界中でかなりの速度で増加しており、広範囲の代謝性疾患につながっています1,2,3。脂肪組織はこれらの病状の鍵です。存在する2つの機能的に異なるタイプの脂肪組織は、過剰なカロリーを蓄える白色脂肪組織(WAT)と、熱発生のためにエネルギーを放散する褐色脂肪組織(BAT)とそれに関連するベージュ/ブライト脂肪です。BATはそのエネルギー放散機能で認識されていますが、遠位器官の代謝を調節する生理活性分子の生成を介して内分泌機能も持っています4,5。げっ歯類での多くの研究は、茶色またはベージュ色の脂肪の量または活性を増加させることがエネルギー消費の増加とインスリン感受性の改善につながることを示しています。ヒトでは、BATの検出可能な人は心代謝疾患の有病率が有意に低くなります6。したがって、BATは、肥満関連代謝後遺症7、8、9に対して優れた治療可能性を秘めています。
BATの発生と機能の生理学と病態生理学を調査し、これらのプロセスに関与する分子メカニズムを解明するために、BAT特異的トランスジェニックマウスモデルが最適な方法です10。Cre-LoxP組換えシステムは、マウスゲノムを編集することによって条件付きノックアウトマウスを作製するための最も一般的に使用される手段です。このシステムは、組織/細胞特異的な方法で目的の遺伝子の修飾(過剰発現またはノックアウト)を可能にしました11。また、選択的蛍光レポーター遺伝子を発現させることにより特定の細胞型を標識するために利用することもできる。
最近、Cre−LoxPシステムアプローチは、CRISPR-Cas9技術とアデノ随伴ウイルス(AAV)シングルガイドRNA(sgRNA)システムを組み合わせることによってさらに発展している12。CRISPR-Cas9システムは、ゲノム13の正確な領域を改変、調節、または標的化するための特異的で効率的な遺伝子編集ツールです。CRISPR-Cas9ベースのゲノム編集は、遺伝子ターゲティングベクターとの相同組換えを必要としないため、ゲノム遺伝子座の迅速な遺伝子操作を可能にします。Cre-LoxP、CRISPR-Cas9、およびAAV-sgRNA技術を組み合わせることで、研究者は組織/細胞における所望の時間における目的の遺伝子の役割を調査できるため、遺伝子機能をより正確に理解することができます。さらに、これらの組み合わせた技術は、トランスジェニックマウスの生成に必要な時間と労力を削減し、誘導性Cre系統が使用されている場合、マウスにおける誘導性ゲノム編集のためのCRISPR-Cas9活性の時間的制御を可能にする14。
AAVベクターは、安全で効果的なin vivo遺伝子デリバリーシステムです。しかし、脂肪組織を標的とするAAVは、脳、心臓、肝臓、筋肉などの他の組織での応用に遅れをとっています15。形質導入効率が比較的低く、天然に存在する血清型ベクターでは向性が強いため、脂肪組織へのAAV誘導遺伝子送達は依然として困難です15。過去5年間で、私たちらは、AAVガイド下遺伝子を脂肪組織に送達するための効果的で低侵襲な方法を確立することに成功し、BAT機能の調節に関与する遺伝子の理解を可能にするマウスモデルを作成しました16,17,18,19。例えば、AAV8を用いて、12-リポキシゲナーゼ(12-LOX)をコードするAlox12を標的とするsgRNAをUcp1-Cre/Cas9マウスのBATに送達することにより、活性化されたBATが12-LOX代謝物、すなわち12-ヒドロキシ-エイコサペンタエン酸(12-HEPE)と13R,14S-ジヒドロキシドコサヘキサエン酸(マレジン2)を産生し、それぞれグルコース代謝を調節し、肥満関連炎症を解消することを発見しました16。17.ここでは、Cre-LoxP、CRISPR-Cas9、およびAAV-sgRNAシステムを組み合わせてBAT特異的ノックアウトマウスを生成するための技術的手順、特にAAV-sgRNAをBATローブに直接マイクロインジェクションする手術に関する段階的なプロトコルを提供します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM serum-free medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-LT1 Transfection Reagent</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>MIR 2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lentiCRISPR v2 vector&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>89060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G envelope plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2 packaging plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Cell Lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT-1 cells</td>
			<td>Developed in Tseng lab</td>
			<td>PMID: 14966273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Organisms/Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 knockin mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>24857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ucp1-CRE mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>24670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Banamine</td>
			<td>Patterson</td>
			<td>07-859-1323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Model 710 RN Syringe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/Bx</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>1273504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/Bx</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>1294522</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of brown fat-specific knockout mice using a combined cre-loxp, crispr-cas9, and adeno-associated virus single-guide rna system

褐色脂肪組織(BAT)は、エネルギー散逸に特化した脂肪貯蔵庫であり、生理活性分子の分泌 を介して 内分泌器官としても機能します。BAT特異的ノックアウトマウスの作成は、BATを介したエネルギー調節に対する目的の遺伝子の寄与を理解するための最も一般的なアプローチの1つです。Cre-LoxPシステムを利用した従来の遺伝子ターゲティング戦略は、組織特異的ノックアウトマウスを作製するための主要なアプローチでした。ただし、このアプローチは時間がかかり、面倒です。ここでは、Cre-LoxP、CRISPR-Cas9、およびアデノ随伴ウイルス(AAV)シングルガイドRNA(sgRNA)システムを組み合わせて、BATの目的遺伝子を迅速かつ効率的にノックアウトするためのプロトコルについて説明します。肩甲骨間BATは、筋肉間の深い層にあります。したがって、視野内のBATにAAVを正確かつ直接注入するには、BATを露光する必要があります。BATにつながるスルツァー静脈などの交感神経や血管の損傷を防ぐためには、適切な外科的取り扱いが不可欠です。組織の損傷を最小限に抑えるには、BATの3次元解剖学的位置と技術的ステップで必要な外科的スキルを理解することが重要です。このプロトコルは、目的の遺伝子を標的とするsgRNAの設計、AAV-sgRNA粒子の調製、BAT特異的ノックアウトマウスを生成するための両方のBATローブへのAAVの直接マイクロインジェクション手術など、主要な技術的手順を強調しており、BATの遺伝子の生物学的機能の研究に広く適用できます。

上記の手順を通して、AAV-sgRNAのBATへの正確な送達は、プロトコルの成功に不可欠です。AAV-sgRNAの効果を最大化し、手術中の組織損傷を最小限に抑えるには、BATの3次元(3D)解剖学的位置を理解することが不可欠です。図3Eに示すように、組織を露出させずにBATの正確な位置を特定することは困難です。ただし、過剰なBAT曝露は組織を損傷する可能性があります(<strong class="xf...

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Generation of Brown Fat-Specific Knockout Mice Using a Combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and Adeno-Associated Virus Single-Guide RNA System

このプロトコルでは、Cre-LoxP、CRISPR-Cas9、およびアデノ随伴ウイルス(AAV)シングルガイドRNA(sgRNA)システムを組み合わせて褐色脂肪組織(BAT)特異的ノックアウトマウスを生成するための技術的手順について説明します。記載されたステップには、sgRNAの設計、AAV-sgRNA粒子の調製、およびBATローブへのAAVのマイクロインジェクションが含まれる。

Cre-LoxP、CRISPR-Cas9、およびアデノ随伴ウイルスシングルガイドRNAシステムを組み合わせた褐色脂肪特異的ノックアウトマウスの作製

Brown adipose tissue (BAT) is an adipose depot specialized in energy dissipation that can also serve as an endocrine organ via the secretion of bioactive ...

このプロトコルは、Cre-LoxP、CRISPR-Cas9、およびアデノ随伴ウイルスシングルガイドRNAシステムを使用して、褐色脂肪特異的ノックアウトマウスを生成します。これには、AAVを褐色脂肪に安全に投与するための外科的技術が含まれています。この技術の主な利点は、マウスを選択的に繁殖させることなく、組織特異的ノックアウトを迅速に生成できることです。組織特異的ノックアウトまたはノックダウンを行うアプローチは、AAVを注射するための外科的手順が標的臓器に基づいて変更される場合、他の組織に適合させることができる。まず、鎮痛剤を麻酔をかけたUCP1 Cre Cas9マウスに皮下投与して、術後の痛みや苦痛を最小限に抑え、予防します。次に、シェーバーを使用して肩甲骨間領域の毛皮を剃り、ヨウ素ベースまたはクロルヘキシジンベースのスクラブを少なくとも3回交互に使用し、続いて70%エタノールで手術領域を滅菌します。メスを使用して、肩甲骨の間の茶色の脂肪組織の上の皮膚を2センチメートル切開し、肩甲骨間脂肪を露出させます。1回切開した後、脂肪組織の遠位領域と筋肉の境界にある脂肪組織を切断します。次に、利き手の手術用ハサミを使用して、脂肪組織を鈍く垂直に剥がし、茶色の脂肪組織を露出させ、茶色の脂肪組織を含む脂肪組織を利き手ではない手でつまみます。スルザー静脈をランドマークとして使用して、正確な茶色の脂肪組織の位置を示します。次に、各マウスについて、100マイクロリットルのハミルトン注射器に接続された鋭い32ゲージの針を使用して、20マイクロリットルのアデノ随伴ウイルスまたはAAVを2つの褐色脂肪組織の各葉にゆっくりと注入します。AAV投与中に注入部位からの漏れがないことが示す注入が成功したことを確認します。恒常性を確保した後、露出した脂肪組織を通常の位置に戻し、5-0吸収性モノフィラメント糸を使用して脂肪組織と筋肉の端を縫合します。最後に、5-0コーティングされたVICRYL未染色編組糸で開いた皮膚を縫合します。褐色脂肪組織の正確な位置は、それを露出させなければ特定できないが、組織への過度の曝露損傷である。注射の失敗につながった可能性のある潜在的な欠陥には、AAV溶液を誤った領域に注入すること、組織を通る針の貫通、およびAAV溶液の過剰な量による組織の膨らみが含まれていました。褐色脂肪組織へのAAVシングルガイドRNAの正確な送達は、プロトコルの成功に不可欠でした。褐色脂肪組織を露出させながら成功するための鍵は、はさみの方向と深さ、およびハミルトンシリンジの位置を含む外科用はさみ技術です。この技術は、褐色脂肪関連のエネルギー代謝の分子調節因子を理解するために、負荷を発生させる組織特異的ノックアウト動物を有する。

Research

JoVE Journal

Biology

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可視化RNAの局在にアフリカツメガエル卵母細胞

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

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Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

CRISPR / Cas9経由哺乳動物細胞株におけるゲノム欠失の生成

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A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

AAV 滴定とそのアデノ随伴ウイルスのアセンブリ活性化機能の評価のための定量的ドットしみ試金蛋白質

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

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結合されたヌクレオチドおよび線虫のタンパク質抽出

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

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CRISPR/Cas9を使用してヌル突然変異を生成するための Culex 蚊の胚の調製と注入

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9を用いた初等ヒトB細胞のゲノム工学

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

バキュロウイルス昆虫細胞培養システムを用いたアデノ関連ウイルス(AAV)2ベクターの製造と精製のためのプロセス開発

Adeno-associated viruses (AAV) are promising vectors for gene therapy applications. Here, the AAV2 vector is produced by co-culture of Spodoptera ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...