Name: generation of brown fat-specific knockout mice using a combined cre-loxp, crispr-cas9, and adeno-associated virus single-guide rna system
Uploaded: 2023-03-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Brown Fat-Specific Knockout Mice Using a Combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and Adeno-Associated Virus Single-Guide RNA System at JoVE.com

이 작업은 미국 국립 보건원 (NIH) 보조금 R01DK122808, R01DK102898 및 R01DK132469 (Y.-HT에)와 P30DK036836 (Joslin Diabetes Center의 당뇨병 연구 센터에)에 의해 부분적으로 지원되었습니다. T.T.는 SUNSTAR Research Fellowship (Hiroo Kaneda Scholarship, Sunstar Foundation, Japan)과 미국 심장 협회 (American Heart Association) 보조금 903968의 지원을 받았습니다. Y. Z.는 Charles A. King Trust Fellowship의 지원을 받았습니다. 원고를 친절하게 교정해 주신 Sean D. Kodani에게 감사드립니다.

모든 동물 실험 및 관리 절차는 Joslin Diabetes Center의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 배양된 세포에서 효과적인 sgRNA 스크리닝
참고: 비용 효율적인 분석을 위해 sgRNA를 AAV 입자로 패키징하기 전에 Cas9/sgRNA 발현을 위해 렌티바이러스 기반 시스템을 통해 배양된 세포에서 다양한 sgRNA를 테스트하고(그?...

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	<li>Kopelman, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+as+a+medical+problem.">Obesity as a medical problem.</a> Nature. 404 (6778), 635-643 (2000).</li><li>Finkelstein, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+severe+obesity+forecasts+through+2030.">Obesity and severe obesity forecasts through 2030.</a> American Journal of Preventive Medicine. 42 (6), 563-570 (2012).</li><li>Craft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+and+Alzheimer's+disease+pathogenesis:+Potential+mechanisms+and+implications+for+treatment.">Insulin resistance and Alzheimer's disease pathogenesis: Potential mechanisms and implications for treatment.</a> Current Alzheimer Research. 4 (2), 147-152 (2007).</li><li>Villarroya, F., Cereijo, R., Villarroya, J., Giralt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue+as+a+secretory+organ.">Brown adipose tissue as a secretory organ.</a> Nature Reviews Endocrinology. 13 (1), 26-35 (2017).</li><li>Scheele, C., Wolfrum, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+crosstalk+in+tissue+plasticity+and+human+metabolism.">Brown adipose crosstalk in tissue plasticity and human metabolism.</a> Endocrine Reviews. 41 (1), 53-65 (2020).</li><li>Becher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue+is+associated+with+cardiometabolic+health.">Brown adipose tissue is associated with cardiometabolic health.</a> Nature Medicine. 27 (1), 58-65 (2021).</li><li>Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+and+beige+fat:+Physiological+roles+beyond+heat+generation.">Brown and beige fat: Physiological roles beyond heat generation.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).</li><li>Scheja, L., Heeren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endocrine+function+of+adipose+tissues+in+health+and+cardiometabolic+disease.">The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease.</a> Nature Reviews Endocrinology. 15 (9), 507-524 (2019).</li><li>Darcy, J., Tseng, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ComBATing+aging-does+increased+brown+adipose+tissue+activity+confer+longevity.">ComBATing aging-does increased brown adipose tissue activity confer longevity.</a> Geroscience. 41 (3), 285-296 (2019).</li><li>da Silva Xavier, G., Hodson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+peripheral+metabolic+disease.">Mouse models of peripheral metabolic disease.</a> Best Practice &amp; Research Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 32 (3), 299-315 (2018).</li><li>Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Cre-LoxP+system:+General+principles+to+determine+tissue-specific+roles+of+target+genes.">Mouse Cre-LoxP system: General principles to determine tissue-specific roles of target genes.</a> Laboratory Animal Research. 34 (4), 147-159 (2018).</li><li>Wang, D., Zhang, F., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+therapeutic+genome+editing:+Strategies+and+in+vivo+delivery+by+AAV+vectors.">CRISPR-based therapeutic genome editing: Strategies and in vivo delivery by AAV vectors.</a> Cell. 181 (1), 136-150 (2020).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Dow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+in+vivo+genome+editing+with+CRISPR-Cas9.">Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 33 (4), 390-394 (2015).</li><li>Bates, R., Huang, W., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue:+An+emerging+target+for+adeno-associated+viral+vectors.">Adipose tissue: An emerging target for adeno-associated viral vectors.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 19, 236-249 (2020).</li><li>Sugimoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue-derived+MaR2+contributes+to+cold-induced+resolution+of+inflammation.">Brown adipose tissue-derived MaR2 contributes to cold-induced resolution of inflammation.</a> Nature Metabolism. 4 (6), 775-790 (2022).</li><li>Leiria, L. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=12-lipoxygenase+regulates+cold+adaptation+and+glucose+metabolism+by+producing+the+omega-3+lipid+12-HEPE+from+brown+fat.">12-lipoxygenase regulates cold adaptation and glucose metabolism by producing the omega-3 lipid 12-HEPE from brown fat.</a> Cell Metabolism. 30 (4), 768-783 (2019).</li><li>Shamsi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF6+and+FGF9+regulate+UCP1+expression+independent+of+brown+adipogenesis.">FGF6 and FGF9 regulate UCP1 expression independent of brown adipogenesis.</a> Nature Communications. 11, 1421 (2020).</li><li>Romanelli, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAd-CRISPR:+Inducible+gene+knockout+in+interscapular+brown+adipose+tissue+of+adult+mice.">BAd-CRISPR: Inducible gene knockout in interscapular brown adipose tissue of adult mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 297 (6), 101402 (2021).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+sgRNA+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+CRISPR-Cas9.">Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).</li><li>Sanson, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+libraries+for+CRISPR-Cas9+genetic+screens+with+multiple+modalities.">Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities.</a> Nature Communications. 9, 5416 (2018).</li><li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPOR:+Intuitive+guide+selection+for+CRISPR/Cas9+genome+editing+experiments+and+screens.">CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).</li><li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR.">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).</li><li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening.">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).</li><li>Tseng, Y. H., Kriauciunas, K. M., Kokkotou, E., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+insulin+receptor+substrates+in+brown+adipocyte+differentiation.">Differential roles of insulin receptor substrates in brown adipocyte differentiation.</a> Molecular and Cellular Biology. 24 (5), 1918-1929 (2004).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+Sample+preparation+to+detection.">Western blotting: Sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).</li><li>Jarrett, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+genome+editing+with+CRISPR/Cas9+generates+and+corrects+a+metabolic+disease.">Somatic genome editing with CRISPR/Cas9 generates and corrects a metabolic disease.</a> Scientific Reports. 7, 44624 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+RNA-targeting+CRISPR/Cas13d+technology+outperforms+shRNA+in+identifying+functional+circRNAs.">Optimized RNA-targeting CRISPR/Cas13d technology outperforms shRNA in identifying functional circRNAs.</a> Genome Biology. 22 (1), 41 (2021).</li><li>Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+purification,+and+quality+control+for+adeno-associated+virus-based+vectors.">Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).</li><li>Jimenez, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+adeno-associated+viral+vector-mediated+genetic+engineering+of+white+and+brown+adipose+tissue+in+adult+mice.">In vivo adeno-associated viral vector-mediated genetic engineering of white and brown adipose tissue in adult mice.</a> Diabetes. 62 (12), 4012-4022 (2013).</li><li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling.">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li><li>Huang, W., Queen, N. J., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rAAV-mediated+gene+delivery+to+adipose+tissue.">rAAV-mediated gene delivery to adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 1950, 389-405 (2019).</li><li>Xue, K., Wu, D., Qiu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+and+efficient+gene+knockout+and+overexpression+in+mouse+interscapular+brown+adipocytes+in+vivo.">Specific and efficient gene knockout and overexpression in mouse interscapular brown adipocytes in vivo.</a> STAR Protocols. 3 (4), 101895 (2022).</li></ol>

견갑간 BAT에 대한 AAV 매개 유전자 전달을 위해 기존에 발표된 방법에는 BAT에 AAV를 직접 주입하기 위한 수술 기술과 접근 방식을 설명하는 자세한 사진과 비디오가 포함되어 있지 않습니다. 공개된 대부분의 방법(33,34)에서, AAV는 BAT 자체 대신에 견갑간 BAT를 둘러싼 지방 조직에 주입된다. 따라서 이 프로토콜에는 연구의 성공을 결정하는 몇 가지 주요 단...

비만은 전 세계적으로 상당한 속도로 증가하고 있으며, 이는 광범위한 대사 질환으로 이어진다 1,2,3. 지방 조직은 이러한 병리의 핵심입니다. 존재하는 두 가지 기능적으로 구별되는 유형의 지방 조직은 과도한 칼로리를 저장하는 백색 지방 조직(WAT)과 열 생성을 위해 에너지를 발산하는 갈색 지방 조직(BAT) 및 관련 베이지색/브라이트 지방입니다. BAT는 에너지 소산 기능으로 인정 받았지만 원위 기관의 신진 대사를 조절하는 생리 활성 분자의 생산을 통한 내분비 기능도 가지고 있습니다 4,5. 설치류에 대한 수많은 연구에서 갈색 또는 베이지색 지방의 양이나 활성을 증가시키면 에너지 소비가 증가하고 인슐린 감수성이 향상된다는 사실이 입증되었습니다. 인간의 경우, BAT가 검출되는 사람은 심혈관 질환의 유병률이 현저히 낮다6. 따라서, BAT는 비만 관련 대사 후유증에 대한 우수한 치료 가능성을 보유한다 7,8,9.
BAT 발달 및 기능의 생리학 및 병태생리학을 조사하고 이러한 과정에 관여하는 분자 메커니즘을 밝히기 위해 BAT 특이적 형질전환 마우스 모델을 선택하는 방법10. Cre-LoxP 재조합 시스템은 마우스 게놈을 편집하여 조건부 녹아웃 마우스를 생산하는 데 가장 일반적으로 사용되는 수단입니다. 이 시스템은 조직/세포 특이적 방식으로 관심 유전자의 변형(과발현 또는 녹아웃)을 가능하게 했다11. 또한 선택적 형광 리포터 유전자를 발현하여 특정 세포 유형을 표지하는 데 사용할 수 있습니다.
최근에, Cre-LoxP 시스템 접근법은 CRISPR-Cas9 기술과 아데노 관련 바이러스(AAV) 단일 가이드 RNA(sgRNA) 시스템(12)을 결합하여 더욱 발전되었다. CRISPR-Cas9 시스템은 게놈13의 정확한 영역을 수정, 조절 또는 표적화하기 위한 구체적이고 효율적인 유전자 편집 도구입니다. CRISPR-Cas9 기반 게놈 편집은 유전자 표적 벡터와 상동 재조합이 필요하지 않기 때문에 게놈 유전자좌의 신속한 유전자 조작이 가능합니다. Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 및 AAV-sgRNA 기술을 결합하면 조직/세포에서 원하는 시간에 관심 유전자의 역할을 조사할 수 있으므로 연구자가 유전자 기능을 보다 정확하게 이해할 수 있습니다. 또한, 이러한 결합된 기술은 형질전환 마우스를 생성하는 데 필요한 시간과 노력을 줄이고 유도성 Cre 라인을 사용하는 경우 마우스에서 유도성 게놈 편집을 위한 CRISPR-Cas9 활성의 시간적 제어를 허용합니다14.
AAV 벡터는 안전하고 효과적인 생체 내 유전자 전달 시스템입니다. 그러나 지방 조직을 표적으로 하는 AAV는 뇌, 심장, 간, 근육과 같은 다른 조직에서의 응용에 뒤쳐져 있다15. 상대적으로 낮은 형질도입 효율과 자연적으로 발생하는 혈청형 벡터의 친화성으로 인해 지방 조직으로의 AAV 유도 유전자 전달은 여전히 어려운과제입니다 15. 지난 5년 동안 우리와 다른 사람들은 AAV 유도 유전자를 지방 조직으로 전달하는 효과적이고 최소 침습적인 방법을 성공적으로 확립했으며 BAT 기능 조절에 관여하는 유전자를 이해할 수 있는 마우스 모델을 만들었습니다16,17,18,19. 예를 들어, AAV8을 사용하여 12-리폭시게나제(12-LOX)를 암호화하는 Alox12를 표적으로 하는 sgRNA를 Ucp1-Cre/Cas9 마우스의 BAT에 전달함으로써, 활성화된 BAT가 12-LOX 대사산물, 즉 12-하이드록시-에이코사펜타엔산(12-HEPE) 및 13R, 14S-디하이드록시도코사헥사엔산(maresin 2)을 생성하여 각각 포도당 대사를 조절하고 비만 관련 염증을 해결한다는 것을 발견했습니다16, 17. 여기에서는 결합된 Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 및 AAV-sgRNA 시스템을 사용하여 BAT 특이적 녹아웃 마우스를 생성하기 위한 기술 절차, 특히 BAT 로브에 AAV-sgRNA를 직접 미세주입하는 수술에 대한 단계별 프로토콜을 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM serum-free medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-LT1 Transfection Reagent</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>MIR 2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lentiCRISPR v2 vector&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>89060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G envelope plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2 packaging plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Cell Lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT-1 cells</td>
			<td>Developed in Tseng lab</td>
			<td>PMID: 14966273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Organisms/Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 knockin mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>24857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ucp1-CRE mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>24670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Banamine</td>
			<td>Patterson</td>
			<td>07-859-1323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Model 710 RN Syringe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/Bx</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>1273504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/Bx</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>1294522</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of brown fat-specific knockout mice using a combined cre-loxp, crispr-cas9, and adeno-associated virus single-guide rna system

갈색 지방 조직(BAT)은 생리 활성 분자의 분비를 통해 내분비 기관 역할도 할 수 있는 에너지 소산에 특화된 지방 저장소입니다. BAT 특이적 녹아웃 마우스의 생성은 BAT 매개 에너지 조절에 대한 관심 유전자의 기여를 이해하기 위한 가장 인기 있는 접근 방식 중 하나입니다. Cre-LoxP 시스템을 활용한 기존의 유전자 표적화 전략은 조직 특이적 녹아웃 마우스를 생성하는 주요 접근 방식이었습니다. 그러나 이 방법은 시간이 많이 걸리고 지루합니다. 여기에서는 결합된 Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 및 아데노 관련 바이러스(AAV) 단일 가이드 RNA(sgRNA) 시스템을 사용하여 BAT에서 관심 유전자를 빠르고 효율적으로 녹아웃하기 위한 프로토콜을 설명합니다. interscapular BAT는 근육 사이의 깊은 층에 위치합니다. 따라서 AAV를 시야 내에서 BAT에 정확하고 직접 주입하기 위해서는 BAT가 노출되어야 합니다. 적절한 외과적 치료는 BAT에 연결되는 Sultzer의 정맥과 같은 교감 신경 및 혈관의 손상을 방지하는 데 중요합니다. 조직 손상을 최소화하기 위해서는 BAT의 3차원 해부학적 위치와 기술 단계에서 요구되는 수술 기술을 이해하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 관심 유전자를 표적으로 하는 sgRNA의 설계, AAV-sgRNA 입자의 준비, BAT에서 유전자의 생물학적 기능을 연구하는 데 광범위하게 적용될 수 있는 BAT 특이적 녹아웃 마우스를 생성하기 위해 두 BAT 로브에 AAV를 직접 미세주입하는 수술을 포함한 주요 기술 절차를 강조합니다.

위의 절차 전반에 걸쳐 AAV-sgRNA를 BAT에 정확하게 전달하는 것이 프로토콜의 성공에 매우 중요합니다. AAV-sgRNA의 효과를 극대화하고 수술 중 조직 손상을 최소화하기 위해서는 BAT의 3차원(3D) 해부학적 위치를 이해하는 것이 필수적입니다. 도 3E에 나타난 바와 같이, 조직을 노출시키지 않고는 BAT의 정확한 위치를 식별하기 어렵다. 그러나 과도한 BAT 노출은 조직을 손상시킬 수 ?...

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Generation of Brown Fat-Specific Knockout Mice Using a Combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and Adeno-Associated Virus Single-Guide RNA System

이 프로토콜에서는 결합된 Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 및 아데노 관련 바이러스(AAV) 단일 가이드 RNA(sgRNA) 시스템을 활용하여 갈색 지방 조직(BAT) 특이적 녹아웃 마우스를 생성하는 기술 절차를 설명합니다. 설명된 단계에는 sgRNA의 설계, AAV-sgRNA 입자의 준비 및 BAT 로브에 AAV의 미세 주입이 포함됩니다.

결합된 Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 및 아데노 관련 바이러스 단일 가이드 RNA 시스템을 사용한 갈색 지방 특이적 녹아웃 마우스 생성

Brown adipose tissue (BAT) is an adipose depot specialized in energy dissipation that can also serve as an endocrine organ via the secretion of bioactive ...

이 프로토콜은 Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 및 아데노 관련 바이러스 단일 가이드 RNA 시스템을 사용하여 갈색 지방 특이적 녹아웃 마우스를 생성합니다. 여기에는 갈색 지방에 AAV를 안전하게 투여하는 수술 기술이 포함됩니다. 이 기술의 주요 장점은 마우스를 선택적으로 번식시킬 필요 없이 조직 특이적 녹아웃을 빠르게 생성할 수 있다는 것입니다.조직 특이적 녹아웃 또는 녹다운을 만드는 접근 방식은 AAV 주입을 위한 수술 절차가 표적 기관에 따라 수정되는 경우 다른 조직에 적용할 수 있습니다. 먼저, 수술 후 통증과 고통을 최소화하고 예방하기 위해 마취된 UCP1 Cre Cas9 마우스에 진통제를 피하 투여합니다. 그런 다음 면도기를 사용하여 견갑간 부위의 털을 면도하고 요오드 기반 또는 클로르헥시딘 기반 스크럽을 최소 3회 번갈아 가며 수술 부위를 소독한 다음 70% 에탄올을 사용합니다.메스를 사용하여 견갑골 사이의 갈색 지방 조직 위의 피부에 2cm 절개를하여 견갑간 지방을 노출시킵니다. 단일 절개를 한 후 지방 조직과 근육의 원위 영역 사이의 경계에서 지방 조직을 자릅니다. 그런 다음 주로 사용하는 손에 있는 수술용 가위를 사용하여 지방 조직을 무뚝뚝하고 수직으로 떼어내어 갈색 지방 조직을 노출시키고 갈색 지방 조직을 포함한 지방 조직을 비우세 손으로 꼬집습니다.Sulzer의 정맥을 랜드마크로 사용하여 정확한 갈색 지방 조직 위치를 나타냅니다. 다음으로, 각 마우스에 대해 100 마이크로 리터 해밀턴 주사기에 연결된 날카로운 32 게이지 바늘을 사용하여 두 개의 갈색 지방 조직의 각 엽에 20 마이크로 리터의 아데노 관련 바이러스 또는 AAV를 천천히 주입합니다. AAV 투여 중 주입 부위에서 누출이 없음을 나타내는 성공적인 주입을 확인합니다.항상성을 확보한 후 노출된 지방 조직을 정상 위치로 되돌려 5-0 흡수성 모노필라멘트 실을 사용하여 지방 조직과 근육의 가장자리를 봉합합니다. 마지막으로 5-0 코팅된 VICRYL 염색되지 않은 편조 실로 열린 피부를 봉합합니다. 갈색 지방 조직의 정확한 위치는 노출시키지 않고는 식별할 수 없지만 조직에 대한 과도한 노출 손상.주사 실패로 이어질 수 있는 잠재적인 결함에는 AAV 용액을 잘못된 부위에 주입하는 것, 조직을 통한 바늘 침투, 과도한 양의 AAV 용액으로 인한 조직 풍선이 포함됩니다. 갈색 지방 조직에 AAV 단일 가이드 RNA를 정확하게 전달하는 것은 프로토콜의 성공에 결정적이었습니다. 갈색 지방 조직을 노출시키면서 성공의 열쇠는 가위의 방향과 깊이, 해밀턴 주사기의 위치를 포함한 수술용 가위 기술입니다.이 기술은 갈색 지방 관련 에너지 대사의 분자 조절자를 이해하기 위해 부하를 발생시키는 조직 특이적 녹아웃 동물을 가지고 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

머릿속 RNA 현지화에서 Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

연구

생물학

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

CRISPR / 카스 시스템의 Endonucleases을위한 기판 생성

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

CRISPR / Cas9를 통해 포유 동물 세포주의 게놈에 삭제 세대

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

AAV 적정 및 Adeno 관련 바이러스 어셈블리 활성화의 기능 평가 대 한 그것의 사용에 대 한 양적 점 오 점 분석 결과 단백질

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

결합 된 뉴클레오티드와 꼬마 선 충 의 단백질 추출

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9를 사용하여 Null 돌연변이를 생성하기 위해 컬렉스 모기의 배아를 준비하고 주입합니다.

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9를 사용하여 1차 인간 B 세포의 게놈 공학

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

바쿨로바이러스-곤충세포배양시스템을 이용한 아데노 관련 바이러스(AAV)2 벡터의 생산 및 정화를 위한 공정 개발

Adeno-associated viruses (AAV) are promising vectors for gene therapy applications. Here, the AAV2 vector is produced by co-culture of Spodoptera ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...