Name: generation of brown fat-specific knockout mice using a combined cre-loxp, crispr-cas9, and adeno-associated virus single-guide rna system
Uploaded: 2023-03-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Brown Fat-Specific Knockout Mice Using a Combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and Adeno-Associated Virus Single-Guide RNA System at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet delvis av US National Institutes of Health (NIH) tilskudd R01DK122808, R01DK102898 og R01DK132469 (til Y.-H.T.), samt P30DK036836 (til Joslin Diabetes Center's Diabetes Research Center). TT ble støttet av SUNSTAR Research Fellowship (Hiroo Kaneda Scholarship, Sunstar Foundation, Japan) og American Heart Association grant 903968. Y. Z. ble støttet av Charles A. King Trust Fellowship. Vi takker Sean D. Kodani for korrekturlesing av manuskriptet.

Alle dyreforsøk og omsorgsprosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Joslin Diabetes Center.
1. Screening av effektive sgRNA i dyrkede celler
MERK: For å gjøre analysen kostnadseffektiv, før pakking av sgRNAene i AAV-partikler, anbefaler vi å teste forskjellige sgRNA i dyrkede celler via et lentivirusbasert system for Cas9 / sgRNA-uttrykk (figur 1) og velge sgRNAene som gir h?...

<ol>
	<li>Kopelman, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+as+a+medical+problem.">Obesity as a medical problem.</a> Nature. 404 (6778), 635-643 (2000).</li><li>Finkelstein, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+severe+obesity+forecasts+through+2030.">Obesity and severe obesity forecasts through 2030.</a> American Journal of Preventive Medicine. 42 (6), 563-570 (2012).</li><li>Craft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+and+Alzheimer's+disease+pathogenesis:+Potential+mechanisms+and+implications+for+treatment.">Insulin resistance and Alzheimer's disease pathogenesis: Potential mechanisms and implications for treatment.</a> Current Alzheimer Research. 4 (2), 147-152 (2007).</li><li>Villarroya, F., Cereijo, R., Villarroya, J., Giralt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue+as+a+secretory+organ.">Brown adipose tissue as a secretory organ.</a> Nature Reviews Endocrinology. 13 (1), 26-35 (2017).</li><li>Scheele, C., Wolfrum, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+crosstalk+in+tissue+plasticity+and+human+metabolism.">Brown adipose crosstalk in tissue plasticity and human metabolism.</a> Endocrine Reviews. 41 (1), 53-65 (2020).</li><li>Becher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue+is+associated+with+cardiometabolic+health.">Brown adipose tissue is associated with cardiometabolic health.</a> Nature Medicine. 27 (1), 58-65 (2021).</li><li>Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+and+beige+fat:+Physiological+roles+beyond+heat+generation.">Brown and beige fat: Physiological roles beyond heat generation.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).</li><li>Scheja, L., Heeren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endocrine+function+of+adipose+tissues+in+health+and+cardiometabolic+disease.">The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease.</a> Nature Reviews Endocrinology. 15 (9), 507-524 (2019).</li><li>Darcy, J., Tseng, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ComBATing+aging-does+increased+brown+adipose+tissue+activity+confer+longevity.">ComBATing aging-does increased brown adipose tissue activity confer longevity.</a> Geroscience. 41 (3), 285-296 (2019).</li><li>da Silva Xavier, G., Hodson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+peripheral+metabolic+disease.">Mouse models of peripheral metabolic disease.</a> Best Practice &amp; Research Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 32 (3), 299-315 (2018).</li><li>Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Cre-LoxP+system:+General+principles+to+determine+tissue-specific+roles+of+target+genes.">Mouse Cre-LoxP system: General principles to determine tissue-specific roles of target genes.</a> Laboratory Animal Research. 34 (4), 147-159 (2018).</li><li>Wang, D., Zhang, F., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+therapeutic+genome+editing:+Strategies+and+in+vivo+delivery+by+AAV+vectors.">CRISPR-based therapeutic genome editing: Strategies and in vivo delivery by AAV vectors.</a> Cell. 181 (1), 136-150 (2020).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Dow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+in+vivo+genome+editing+with+CRISPR-Cas9.">Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 33 (4), 390-394 (2015).</li><li>Bates, R., Huang, W., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue:+An+emerging+target+for+adeno-associated+viral+vectors.">Adipose tissue: An emerging target for adeno-associated viral vectors.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 19, 236-249 (2020).</li><li>Sugimoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue-derived+MaR2+contributes+to+cold-induced+resolution+of+inflammation.">Brown adipose tissue-derived MaR2 contributes to cold-induced resolution of inflammation.</a> Nature Metabolism. 4 (6), 775-790 (2022).</li><li>Leiria, L. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=12-lipoxygenase+regulates+cold+adaptation+and+glucose+metabolism+by+producing+the+omega-3+lipid+12-HEPE+from+brown+fat.">12-lipoxygenase regulates cold adaptation and glucose metabolism by producing the omega-3 lipid 12-HEPE from brown fat.</a> Cell Metabolism. 30 (4), 768-783 (2019).</li><li>Shamsi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF6+and+FGF9+regulate+UCP1+expression+independent+of+brown+adipogenesis.">FGF6 and FGF9 regulate UCP1 expression independent of brown adipogenesis.</a> Nature Communications. 11, 1421 (2020).</li><li>Romanelli, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAd-CRISPR:+Inducible+gene+knockout+in+interscapular+brown+adipose+tissue+of+adult+mice.">BAd-CRISPR: Inducible gene knockout in interscapular brown adipose tissue of adult mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 297 (6), 101402 (2021).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+sgRNA+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+CRISPR-Cas9.">Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).</li><li>Sanson, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+libraries+for+CRISPR-Cas9+genetic+screens+with+multiple+modalities.">Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities.</a> Nature Communications. 9, 5416 (2018).</li><li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPOR:+Intuitive+guide+selection+for+CRISPR/Cas9+genome+editing+experiments+and+screens.">CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).</li><li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR.">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).</li><li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening.">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).</li><li>Tseng, Y. H., Kriauciunas, K. M., Kokkotou, E., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+insulin+receptor+substrates+in+brown+adipocyte+differentiation.">Differential roles of insulin receptor substrates in brown adipocyte differentiation.</a> Molecular and Cellular Biology. 24 (5), 1918-1929 (2004).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+Sample+preparation+to+detection.">Western blotting: Sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).</li><li>Jarrett, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+genome+editing+with+CRISPR/Cas9+generates+and+corrects+a+metabolic+disease.">Somatic genome editing with CRISPR/Cas9 generates and corrects a metabolic disease.</a> Scientific Reports. 7, 44624 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+RNA-targeting+CRISPR/Cas13d+technology+outperforms+shRNA+in+identifying+functional+circRNAs.">Optimized RNA-targeting CRISPR/Cas13d technology outperforms shRNA in identifying functional circRNAs.</a> Genome Biology. 22 (1), 41 (2021).</li><li>Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+purification,+and+quality+control+for+adeno-associated+virus-based+vectors.">Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).</li><li>Jimenez, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+adeno-associated+viral+vector-mediated+genetic+engineering+of+white+and+brown+adipose+tissue+in+adult+mice.">In vivo adeno-associated viral vector-mediated genetic engineering of white and brown adipose tissue in adult mice.</a> Diabetes. 62 (12), 4012-4022 (2013).</li><li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling.">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li><li>Huang, W., Queen, N. J., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rAAV-mediated+gene+delivery+to+adipose+tissue.">rAAV-mediated gene delivery to adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 1950, 389-405 (2019).</li><li>Xue, K., Wu, D., Qiu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+and+efficient+gene+knockout+and+overexpression+in+mouse+interscapular+brown+adipocytes+in+vivo.">Specific and efficient gene knockout and overexpression in mouse interscapular brown adipocytes in vivo.</a> STAR Protocols. 3 (4), 101895 (2022).</li></ol>

De eksisterende publiserte metodene for AAV-mediert genlevering til interskapulær BAT inneholder ikke detaljerte bilder og videoer som beskriver operasjonsteknikker og tilnærming for direkte AAV-injeksjon i BAT. I de fleste av de publiserte metodene33,34 injiseres AAV i fettvevet rundt den interskapulære BAT i stedet for selve BAT. Derfor er det flere viktige trinn i denne protokollen som bestemmer suksessen til studien. Disse inkluderer utformingen av sgRNA, ...

Fedme øker med en betydelig hastighet over hele verden, noe som fører til et bredt spekter av metabolske sykdommer 1,2,3. Fettvevet er nøkkelen til disse patologiene. De to funksjonelt distinkte typer fettvev som finnes er hvitt fettvev (WAT), som lagrer overflødige kalorier, og brunt fettvev (BAT) og dets relaterte beige / brite fett, som sprer energi for termogenese. Mens BAT har blitt anerkjent for sin energiavledende funksjon, har den også endokrine funksjoner via produksjon av bioaktive molekyler som regulerer metabolisme i distale organer 4,5. Tallrike studier hos gnagere har vist at økt mengde eller aktivitet av brunt eller beige fett fører til økt energiforbruk og forbedret insulinfølsomhet. Hos mennesker har personer med påviselig BAT en betydelig lavere forekomst av kardiometabolske sykdommer6. BAT har således et utmerket terapeutisk potensial for fedmerelaterte metabolske følgetilstander 7,8,9.
For å undersøke fysiologien og patofysiologien til BATs utvikling og funksjon og for å belyse de molekylære mekanismene som er involvert i disse prosessene, er den BAT-spesifikke transgene musemodellen en metode for valg10. Cre-LoxP-rekombinasjonssystemet er den mest brukte måten å produsere betingede knockoutmus ved å redigere musegenomet. Dette systemet har muliggjort modifisering (overekspresjon eller knockout) av gener av interesse på en vevs-/cellespesifikk måte11. Det kan også brukes til å merke en bestemt celletype ved å uttrykke et selektivt fluorescerende reportergen.
Nylig har Cre-LoxP-systemtilnærmingen blitt videreutviklet ved å kombinere CRISPR-Cas9-teknologien og adeno-associated virus (AAV) single-guide RNA (sgRNA) system12. CRISPR-Cas9-systemet er et spesifikt og effektivt genredigeringsverktøy for å modifisere, regulere eller målrette mot presise regioner av genomet13. CRISPR-Cas9-basert genomredigering muliggjør rask genetisk manipulering av genomiske loci fordi det ikke krever homolog rekombinasjon med en genmålrettingsvektor. Kombinerte Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- og AAV-sgRNA-teknikker gjør det mulig for forskere å forstå genfunksjoner mer presist ved å tillate undersøkelse av rollen til gener av interesse på ønskede tidspunkter i vev / celler. I tillegg reduserer disse kombinerte teknikkene tiden og kreftene som kreves for å generere transgene mus og tillater tidsmessig kontroll av CRISPR-Cas9-aktivitet for induserbar genomredigering hos mus hvis en induserbar Cre-linje brukes14.
AAV-vektorer er trygge og effektive in vivo genleveringssystemer. AAV-er rettet mot fettvev har imidlertid ligget etter applikasjoner i andre vev, som hjerne, hjerte, lever og muskel15. På grunn av relativt lav transduksjonseffektivitet og tropisme med naturlig forekommende serotypevektorer, er AAV-veiledet genlevering til fettvev fortsatt utfordrende15. I løpet av de siste 5 årene har vi og andre lykkes med å etablere effektive og minimalt invasive måter å levere AAV-guidede gener inn i fettvev og laget musemodeller som lar oss få en forståelse av genene som er involvert i reguleringen av BAT-funksjonen16,17,18,19. For eksempel, ved å bruke AAV8 til å levere sgRNA rettet mot Alox12, som koder for 12-lipoksygenase (12-LOX), inn i BAT av Ucp1-Cre / Cas9-musene, har vi oppdaget at aktivert BAT produserer 12-LOX-metabolitter, nemlig 12-hydroksy-eikosapentaensyre (12-HEPE) og 13R, 14S-dihydroksydokosaheksaensyre (maresin 2), for å regulere glukosemetabolismen og løse fedme-assosiert betennelse, henholdsvis16, 17. Her gir vi en trinnvis protokoll om de tekniske prosedyrene, spesielt kirurgi for direkte mikroinjeksjon av AAV-sgRNA i BAT-, for å generere BAT-spesifikke knockoutmus ved bruk av det kombinerte Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- og AAV-sgRNA-systemet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM serum-free medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-LT1 Transfection Reagent</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>MIR 2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lentiCRISPR v2 vector&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>89060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G envelope plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2 packaging plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Cell Lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT-1 cells</td>
			<td>Developed in Tseng lab</td>
			<td>PMID: 14966273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Organisms/Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 knockin mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>24857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ucp1-CRE mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>24670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Banamine</td>
			<td>Patterson</td>
			<td>07-859-1323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Model 710 RN Syringe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/Bx</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>1273504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/Bx</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>1294522</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of brown fat-specific knockout mice using a combined cre-loxp, crispr-cas9, and adeno-associated virus single-guide rna system

Brunt fettvev (BAT) er et fettdepot spesialisert på energispredning som også kan tjene som et endokrint organ via sekresjon av bioaktive molekyler. Opprettelsen av BAT-spesifikke knockoutmus er en av de mest populære tilnærmingene for å forstå bidraget fra et gen av interesse for BAT-mediert energiregulering. Den konvensjonelle genmålrettingsstrategien som bruker Cre-LoxP-systemet har vært den viktigste tilnærmingen for å generere vevsspesifikke knockoutmus. Denne tilnærmingen er imidlertid tidkrevende og kjedelig. Her beskriver vi en protokoll for rask og effektiv knockout av et gen av interesse for BAT ved bruk av et kombinert Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 og adenoassosiert virus (AAV) enkeltveis RNA (sgRNA) system. Den interscapulære BAT ligger i det dype laget mellom musklene. BAT må derfor eksponeres for å injisere AAV nøyaktig og direkte inn i BAT innenfor synsfeltet. Riktig kirurgisk håndtering er avgjørende for å forhindre skade på sympatiske nerver og kar, for eksempel Sultzers vene som kobles til BAT. For å minimere vevskader er det et kritisk behov for å forstå den tredimensjonale anatomiske plasseringen av BAT og de kirurgiske ferdighetene som kreves i de tekniske trinnene. Denne protokollen fremhever de viktigste tekniske prosedyrene, inkludert utformingen av sgRNA rettet mot genet av interesse, fremstilling av AAV-sgRNA-partikler og kirurgi for direkte mikroinjeksjon av AAV i begge BAT-lober for å generere BAT-spesifikke knockoutmus, som bredt kan brukes til å studere de biologiske funksjonene til gener i BAT.

Gjennom de ovennevnte prosedyrene er nøyaktig levering av AAV-sgRNA til BAT avgjørende for protokollens suksess. For å maksimere effekten av AAV-sgRNA og minimere vevskaden under operasjonen, er det viktig å forstå den tredimensjonale (3D) anatomiske plasseringen av BAT. Som vist i figur 3E er det vanskelig å identifisere den nøyaktige plasseringen av BAT uten å eksponere vevet. Overflødig BAT-eksponering kan imidlertid skade vevet (figur 3H, I<...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Brown Fat-Specific Knockout Mice Using a Combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and Adeno-Associated Virus Single-Guide RNA System at JoVE.com

Generation of Brown Fat-Specific Knockout Mice Using a Combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and Adeno-Associated Virus Single-Guide RNA System

I denne protokollen beskriver vi de tekniske prosedyrene for å generere brunt fettvev (BAT)-spesifikke knockoutmus som utnytter et kombinert Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 og adenoassosiert virus (AAV) enkeltveis RNA (sgRNA) system. De beskrevne trinnene inkluderer utformingen av sgRNAene, fremstillingen av AAV-sgRNA-partiklene og mikroinjeksjon av AAV i BAT-.

Generering av brune fettspesifikke knockoutmus ved bruk av et kombinert Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 og adenoassosiert virus enkeltveis RNA-system

Brown adipose tissue (BAT) is an adipose depot specialized in energy dissipation that can also serve as an endocrine organ via the secretion of bioactive ...

Denne protokollen genererer brune fettspesifikke knockoutmus ved hjelp av et Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 og adenoassosiert virus enkeltguidet RNA-system. Det inkluderer en kirurgisk teknikk for sikker administrering av AAV i det brune fettet. Den største fordelen med denne teknikken er at den raskt kan generere vevsspesifikke knockouts uten å måtte avle mus selektivt.Tilnærmingen til vevsspesifikk knockout eller knockdowns kan tilpasses andre vev dersom den kirurgiske prosedyren for injeksjon av AAV modifiseres basert på målorganet. For å begynne, administrer smertestillende subkutant til den bedøvede UCP1 Cre Cas9-musen for å minimere og forhindre postoperativ smerte og nød. Barber deretter pelsen på det interscapulære området ved hjelp av en barbermaskin, og steriliser det kirurgiske området med minst tre alternerende runder med en jodbasert eller klorhexidinbasert skrubb, etterfulgt av 70% etanol.Bruk en skalpell, gjør et to centimeter snitt i huden over det brune fettvevet mellom scapulae for å avsløre det interscapulære fettet. Etter å ha gjort et enkelt snitt, kutt fettvevet på grensen mellom den distale regionen av fettvev og muskler. Bruk deretter den kirurgiske saksen i den dominerende hånden, skrell fettvevet av sløvt og vertikalt for å eksponere det brune fettvevet mens du klemmer fettvevet, inkludert det brune fettvevet, med den ikke-dominerende hånden.Bruk Sulzers vene som et landemerke for å indikere den nøyaktige plasseringen av brunt fettvev. For hver mus injiseres deretter 20 mikroliter adenoassosiert virus eller AAV langsomt inn i hver av de to brune fettvevene ved hjelp av en skarp 32 gauge nål koblet til en 100 mikroliter Hamilton sprøyte. Bekreft vellykket injeksjon indikert ved ingen lekkasjer fra injeksjonsstedet under administrering av AAV.Etter å ha sikret homeostase, plasser det eksponerte fettvevet tilbake i sin normale stilling for å suturere kanten av fettvev og muskel ved hjelp av en 5-0 absorberbar monofilamenttråd. Til slutt, sutur den åpne huden med 5-0 belagt VICRYL ufarget flettet tråder. Den nøyaktige plasseringen av det brune fettvevet kan ikke identifiseres uten å utsette det, men overflødig eksponeringsskade på vevet.De potensielle feilene som kunne ha ført til mislykkede injeksjoner, var blant annet injeksjon av AAV-oppløsningen i feil område, inntrengning av nålen gjennom vevet og oppblåsning av vev på grunn av for høyt volum av AAV-oppløsningen. Den nøyaktige leveransen av AAV single guide RNA til det brune fettvevet var avgjørende for protokollens suksess. Nøkkelen til suksess mens du eksponerer det brune fettvevet er kirurgisk sakseteknikk, inkludert saksens retning og dybde, og plasseringen av Hamilton-sprøyten.Denne teknikken har en belastningsgenererende vevsspesifikke knockoutdyr for å forstå molekylære regulatorer av brunt fettrelatert energimetabolisme.

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

Substrat Generation for endonukleaser av CRISPR / Cas Systems

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

Generasjon av Genomiske slettinger i pattedyrcellelinjer via CRISPR / Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

En kvantitativ Dot Blot analysen for AAV titrering og bruk for funksjonell vurdering av Adeno-assosiert Virus montering-aktivere proteiner

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Kombinert Nucleotide og Protein utdrag i Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Forberede og injisere embryoer av Culex mygg for å generere nullmutasjoner ved hjelp av CRISPR / Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

Genomteknikk av primære humane B-celler ved hjelp av CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

Prosessutvikling for produksjon og rensing av Adeno-assosiert virus (AAV)2 Vektor ved hjelp av Baculovirus-Insect Cell Culture System

Adeno-associated viruses (AAV) are promising vectors for gene therapy applications. Here, the AAV2 vector is produced by co-culture of Spodoptera ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...