Name: generation of brown fat-specific knockout mice using a combined cre-loxp, crispr-cas9, and adeno-associated virus single-guide rna system
Uploaded: 2023-03-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Brown Fat-Specific Knockout Mice Using a Combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and Adeno-Associated Virus Single-Guide RNA System at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado en parte por las subvenciones R01DK122808, R01DK102898 y R01DK132469 (a Y.-H.T.), así como P30DK036836 (al Centro de Investigación de la Diabetes del Centro de Diabetes Joslin). T. T. fue apoyado por la beca de investigación SUNSTAR (beca Hiroo Kaneda, Fundación Sunstar, Japón) y la 903968 de subvenciones de la American Heart Association. Y. Z. fue apoyado por Charles A. King Trust Fellowship. Agradecemos a Sean D. Kodani por revisar amablemente el manuscrito.

Todos los experimentos con animales y procedimientos de cuidado fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Centro de Diabetes Joslin.
1. Cribado de sgRNAs eficaces en células cultivadas
NOTA: Para que el ensayo sea rentable, antes de empaquetar los sgRNAs en partículas AAV, recomendamos probar diferentes sgRNAs en células cultivadas a través de un sistema basado en lentivirus para la expresión de Cas...

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Los métodos publicados existentes para la administración de genes mediados por AAV a la MTD interescapular no contienen imágenes y videos detallados que describan las técnicas quirúrgicas y el enfoque para la inyección directa de AAV en el BAT. En la mayoría de los métodos publicados33,34, el AAV se inyecta en los tejidos grasos que rodean el MTD interescapular en lugar del propio MTD. Por lo tanto, hay varios pasos clave en este protocolo que determinan ...

La obesidad está aumentando a un ritmo significativo en todo el mundo, lo que lleva a un amplio espectro de enfermedades metabólicas 1,2,3. El tejido adiposo es clave para estas patologías. Los dos tipos funcionalmente distintos de tejido adiposo que existen son el tejido adiposo blanco (WAT), que almacena el exceso de calorías, y el tejido adiposo marrón (BAT) y su grasa beige / brite relacionada, que disipa la energía para la termogénesis. Si bien el BAT ha sido reconocido por su función de disipación de energía, también tiene funciones endocrinas a través de la producción de moléculas bioactivas que regulan el metabolismo en los órganos distales 4,5. Numerosos estudios en roedores han demostrado que aumentar la cantidad o actividad de la grasa marrón o beige conduce a un mayor gasto de energía y una mejor sensibilidad a la insulina. En humanos, las personas con MTD detectable tienen una prevalencia significativamente menor de enfermedades cardiometabólicas6. Por lo tanto, las MTD tienen un excelente potencial terapéutico para las secuelas metabólicas relacionadas con la obesidad 7,8,9.
Para investigar la fisiología y fisiopatología del desarrollo y la función de las MTD y dilucidar los mecanismos moleculares implicados en estos procesos, el modelo de ratón transgénico específico para MTD es un método de elección10. El sistema de recombinación Cre-LoxP es el medio más utilizado para producir ratones knockout condicionales mediante la edición del genoma del ratón. Este sistema ha permitido la modificación (sobreexpresión o knockout) de genes de interés de manera específica de tejido/célula11. También se puede utilizar para etiquetar un tipo de célula específico mediante la expresión de un gen reportero fluorescente selectivo.
Recientemente, el enfoque del sistema Cre-LoxP se ha desarrollado aún más mediante la combinación de la tecnología CRISPR-Cas9 y el sistema de ARN de guía única (sgRNA) del virus adenoasociado (AAV)12. El sistema CRISPR-Cas9 es una herramienta de edición de genes específica y eficiente para modificar, regular o apuntar a regiones precisas del genoma13. La edición del genoma basada en CRISPR-Cas9 permite una rápida manipulación genética de los loci genómicos porque no requiere una recombinación homóloga con un vector dirigido a genes. Las técnicas combinadas de Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 y AAV-sgRNA permiten a los investigadores comprender las funciones de los genes con mayor precisión al permitir la investigación del papel de los genes de interés en los momentos deseados en los tejidos / células. Además, estas técnicas combinadas reducen el tiempo y el esfuerzo requeridos para generar ratones transgénicos y permiten el control temporal de la actividad de CRISPR-Cas9 para la edición inducible del genoma en ratones si se utiliza una línea Cre inducible14.
Los vectores AAV son sistemas de administración de genes in vivo seguros y efectivos. Sin embargo, los AAV dirigidos al tejido adiposo se han quedado atrás de las aplicaciones en otros tejidos, como el cerebro, el corazón, el hígado y el músculo15. Debido a la eficiencia de transducción relativamente baja y al tropismo con vectores serotipos naturales, la entrega de genes guiados por AAV al tejido adiposo sigue siendo un desafío15. En los últimos 5 años, nosotros y otros hemos establecido con éxito formas efectivas y mínimamente invasivas de administrar genes guiados por AAV en el tejido adiposo y hemos creado modelos de ratón que nos permiten comprender los genes involucrados en la regulación de la función BAT16,17,18,19. Por ejemplo, al usar AAV8 para administrar sgRNA dirigido a Alox12, que codifica 12-lipoxigenasa (12-LOX), en el BAT de los ratones Ucp1-Cre / Cas9, hemos descubierto que BAT activado produce metabolitos 12-LOX, a saber, ácido 12-hidroxi-eicosapentaenoico (12-HEPE) y ácido 13R, 14S-dihidroxi docosahexaenoico (maresina 2), para regular el metabolismo de la glucosa y resolver la inflamación asociada a la obesidad, respectivamente16, 17. Aquí, proporcionamos un protocolo paso a paso sobre los procedimientos técnicos, particularmente la cirugía para la microinyección directa de AAV-sgRNA en los lóbulos BAT, para generar ratones knockout específicos de BAT utilizando el sistema combinado Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 y AAV-sgRNA.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM serum-free medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-LT1 Transfection Reagent</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>MIR 2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lentiCRISPR v2 vector&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>89060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G envelope plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2 packaging plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Cell Lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT-1 cells</td>
			<td>Developed in Tseng lab</td>
			<td>PMID: 14966273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Organisms/Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 knockin mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>24857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ucp1-CRE mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>24670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Banamine</td>
			<td>Patterson</td>
			<td>07-859-1323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Model 710 RN Syringe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/Bx</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>1273504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/Bx</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>1294522</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of brown fat-specific knockout mice using a combined cre-loxp, crispr-cas9, and adeno-associated virus single-guide rna system

El tejido adiposo marrón (BAT) es un depósito adiposo especializado en la disipación de energía que también puede servir como órgano endocrino a través de la secreción de moléculas bioactivas. La creación de ratones knockout específicos de BAT es uno de los enfoques más populares para comprender la contribución de un gen de interés a la regulación de energía mediada por BAT. La estrategia convencional de orientación génica que utiliza el sistema Cre-LoxP ha sido el enfoque principal para generar ratones knockout específicos de tejido. Sin embargo, este enfoque requiere mucho tiempo y es tedioso. Aquí, describimos un protocolo para la eliminación rápida y eficiente de un gen de interés en BAT utilizando un sistema combinado de ARN de guía única (sgRNA) de Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 y virus adenoasociados (AAV). El BAT interescapular se encuentra en la capa profunda entre los músculos. Por lo tanto, las MTD deben exponerse para inyectar el VAA de forma precisa y directa en las MTD dentro del campo visual. El manejo quirúrgico adecuado es crucial para prevenir el daño a los nervios y vasos simpáticos, como la vena de Sultzer que se conecta al BAT. Para minimizar el daño tisular, existe una necesidad crítica de comprender la ubicación anatómica tridimensional de las MTD y las habilidades quirúrgicas requeridas en los pasos técnicos. Este protocolo destaca los procedimientos técnicos clave, incluido el diseño de sgRNAs dirigidos al gen de interés, la preparación de partículas AAV-sgRNA y la cirugía para la microinyección directa de AAV en ambos lóbulos BAT para generar ratones knockout específicos de BAT, que se pueden aplicar ampliamente para estudiar las funciones biológicas de los genes en BAT.

A lo largo de los procedimientos anteriores, la entrega precisa de AAV-sgRNA al BAT es crucial para el éxito del protocolo. Para maximizar el efecto de AAV-sgRNA y minimizar el daño tisular durante la cirugía, es esencial comprender la ubicación anatómica tridimensional (3D) del BAT. Como se muestra en la figura 3E, es difícil identificar la ubicación precisa de las MTD sin exponer el tejido. Sin embargo, la exposición excesiva a las MTD puede dañar el tejido (F...

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Generation of Brown Fat-Specific Knockout Mice Using a Combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and Adeno-Associated Virus Single-Guide RNA System

En este protocolo, describimos los procedimientos técnicos para generar ratones knockout específicos para tejido adiposo marrón (BAT) aprovechando un sistema combinado de ARN de guía única (sgRNA) de Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 y virus adenoasociado (AAV). Los pasos descritos incluyen el diseño de los sgRNAs, la preparación de las partículas AAV-sgRNA y la microinyección de AAV en los lóbulos BAT.

Generación de ratones knockout específicos de grasa marrón utilizando un sistema combinado de ARN de guía única Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 y virus adenoasociado

Brown adipose tissue (BAT) is an adipose depot specialized in energy dissipation that can also serve as an endocrine organ via the secretion of bioactive ...

Este protocolo genera ratones knockout específicos de grasa marrón utilizando un sistema de ARN de guía única Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 y virus adenoasociados. Incluye una técnica quirúrgica para administrar AAV de forma segura en la grasa marrón. La principal ventaja de esta técnica es que puede generar rápidamente knockouts específicos de tejido sin necesidad de criar ratones selectivamente.El enfoque para hacer knockout o knockdowns específicos del tejido se puede adaptar a otros tejidos si el procedimiento quirúrgico para inyectar AAV se modifica en función del órgano diana. Para comenzar, administrar el analgésico por vía subcutánea al ratón UCP1 Cre Cas9 anestesiado para minimizar y prevenir el dolor postoperatorio y la angustia. Luego afeite el pelaje en su área interescapular con una afeitadora y esterilice el área quirúrgica con al menos tres rondas alternas de un exfoliante a base de yodo o clorhexidina, seguido de etanol al 70%.Usando un bisturí, haga una incisión de dos centímetros en la piel por encima del tejido adiposo marrón entre las escápulas para exponer la grasa interescapular. Después de hacer una sola incisión, corte los tejidos grasos en el borde entre la región distal de los tejidos grasos y los músculos. Luego, usando las tijeras quirúrgicas en la mano dominante, retire los tejidos grasos sin rodeos y verticalmente para exponer el tejido adiposo marrón mientras pellizca los tejidos grasos, incluido el tejido adiposo marrón, con la mano no dominante.Use la vena de Sulzer como punto de referencia para indicar la ubicación precisa del tejido adiposo marrón. A continuación, para cada ratón, inyecte 20 microlitros de virus adenoasociado o AAV lentamente en cada lóbulo de los dos tejidos adiposos marrones utilizando una aguja afilada de calibre 32 conectada a una jeringa Hamilton de 100 microlitros. Confirme que la inyección exitosa indica que no hay fugas del sitio inyectado durante la administración de AAV.Después de asegurar la homeostasis, coloque los tejidos grasos expuestos de nuevo en su posición normal para suturar el borde de los tejidos grasos y el músculo con un hilo de monofilamento absorbible 5-0. Finalmente, suturar la piel abierta con hilos trenzados sin teñir VICRYL recubiertos 5-0. La ubicación precisa del tejido adiposo marrón no se puede identificar sin exponerlo, sin embargo, el exceso de exposición daña el tejido.Los defectos potenciales que pueden haber llevado a inyecciones fallidas incluyeron inyectar la solución de AAV en la región incorrecta, penetración de la aguja a través del tejido y abombamiento del tejido debido a un volumen excesivo de la solución AAV. La administración precisa de ARN guía único AAV al tejido adiposo marrón fue crucial para el éxito del protocolo. La clave del éxito al exponer el tejido adiposo marrón es la técnica quirúrgica de tijera, incluida la dirección y la profundidad de las tijeras, y la ubicación de la jeringa Hamilton.Esta técnica tiene una carga de generación de tejido específico para animales knockout para comprender los reguladores moleculares del metabolismo energético relacionado con la grasa marrón.

Research

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Biology

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