Name: generation of brown fat-specific knockout mice using a combined cre-loxp, crispr-cas9, and adeno-associated virus single-guide rna system
Uploaded: 2023-03-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Brown Fat-Specific Knockout Mice Using a Combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and Adeno-Associated Virus Single-Guide RNA System at JoVE.com

Bu çalışma kısmen ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) R01DK122808, R01DK102898 ve R01DK132469 (Y.-H.T.'ye) ve P30DK036836 (Joslin Diyabet Merkezi Diyabet Araştırma Merkezi'ne) hibeleri ile desteklenmiştir. T.T., SUNSTAR Araştırma Bursu (Hiroo Kaneda Bursu, Sunstar Vakfı, Japonya) ve Amerikan Kalp Derneği hibe 903968 tarafından desteklenmiştir. Y. Z., Charles A. King Trust Fellowship tarafından desteklendi. Sean D. Kodani'ye makaleyi nazikçe düzelttiği için teşekkür ederiz.

Tüm hayvan deneyleri ve bakım prosedürleri, Joslin Diyabet Merkezi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Kültürlenmiş hücrelerde etkili sgRNA'ların taranması
NOT: Tahlili uygun maliyetli hale getirmek için, sgRNA'ları AAV parçacıklarına paketlemeden önce, Cas9 / sgRNA ekspresyonu için lentivirüs tabanlı bir sistem aracılığıyla kültürlenmiş hücrelerde farklı sgRNA'lar...

<ol>
	<li>Kopelman, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+as+a+medical+problem.">Obesity as a medical problem.</a> Nature. 404 (6778), 635-643 (2000).</li><li>Finkelstein, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+severe+obesity+forecasts+through+2030.">Obesity and severe obesity forecasts through 2030.</a> American Journal of Preventive Medicine. 42 (6), 563-570 (2012).</li><li>Craft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+and+Alzheimer's+disease+pathogenesis:+Potential+mechanisms+and+implications+for+treatment.">Insulin resistance and Alzheimer's disease pathogenesis: Potential mechanisms and implications for treatment.</a> Current Alzheimer Research. 4 (2), 147-152 (2007).</li><li>Villarroya, F., Cereijo, R., Villarroya, J., Giralt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue+as+a+secretory+organ.">Brown adipose tissue as a secretory organ.</a> Nature Reviews Endocrinology. 13 (1), 26-35 (2017).</li><li>Scheele, C., Wolfrum, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+crosstalk+in+tissue+plasticity+and+human+metabolism.">Brown adipose crosstalk in tissue plasticity and human metabolism.</a> Endocrine Reviews. 41 (1), 53-65 (2020).</li><li>Becher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue+is+associated+with+cardiometabolic+health.">Brown adipose tissue is associated with cardiometabolic health.</a> Nature Medicine. 27 (1), 58-65 (2021).</li><li>Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+and+beige+fat:+Physiological+roles+beyond+heat+generation.">Brown and beige fat: Physiological roles beyond heat generation.</a> Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).</li><li>Scheja, L., Heeren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endocrine+function+of+adipose+tissues+in+health+and+cardiometabolic+disease.">The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease.</a> Nature Reviews Endocrinology. 15 (9), 507-524 (2019).</li><li>Darcy, J., Tseng, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ComBATing+aging-does+increased+brown+adipose+tissue+activity+confer+longevity.">ComBATing aging-does increased brown adipose tissue activity confer longevity.</a> Geroscience. 41 (3), 285-296 (2019).</li><li>da Silva Xavier, G., Hodson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+peripheral+metabolic+disease.">Mouse models of peripheral metabolic disease.</a> Best Practice &amp; Research Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 32 (3), 299-315 (2018).</li><li>Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Cre-LoxP+system:+General+principles+to+determine+tissue-specific+roles+of+target+genes.">Mouse Cre-LoxP system: General principles to determine tissue-specific roles of target genes.</a> Laboratory Animal Research. 34 (4), 147-159 (2018).</li><li>Wang, D., Zhang, F., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+therapeutic+genome+editing:+Strategies+and+in+vivo+delivery+by+AAV+vectors.">CRISPR-based therapeutic genome editing: Strategies and in vivo delivery by AAV vectors.</a> Cell. 181 (1), 136-150 (2020).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Dow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+in+vivo+genome+editing+with+CRISPR-Cas9.">Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 33 (4), 390-394 (2015).</li><li>Bates, R., Huang, W., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue:+An+emerging+target+for+adeno-associated+viral+vectors.">Adipose tissue: An emerging target for adeno-associated viral vectors.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 19, 236-249 (2020).</li><li>Sugimoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue-derived+MaR2+contributes+to+cold-induced+resolution+of+inflammation.">Brown adipose tissue-derived MaR2 contributes to cold-induced resolution of inflammation.</a> Nature Metabolism. 4 (6), 775-790 (2022).</li><li>Leiria, L. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=12-lipoxygenase+regulates+cold+adaptation+and+glucose+metabolism+by+producing+the+omega-3+lipid+12-HEPE+from+brown+fat.">12-lipoxygenase regulates cold adaptation and glucose metabolism by producing the omega-3 lipid 12-HEPE from brown fat.</a> Cell Metabolism. 30 (4), 768-783 (2019).</li><li>Shamsi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF6+and+FGF9+regulate+UCP1+expression+independent+of+brown+adipogenesis.">FGF6 and FGF9 regulate UCP1 expression independent of brown adipogenesis.</a> Nature Communications. 11, 1421 (2020).</li><li>Romanelli, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAd-CRISPR:+Inducible+gene+knockout+in+interscapular+brown+adipose+tissue+of+adult+mice.">BAd-CRISPR: Inducible gene knockout in interscapular brown adipose tissue of adult mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 297 (6), 101402 (2021).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+sgRNA+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+CRISPR-Cas9.">Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).</li><li>Sanson, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+libraries+for+CRISPR-Cas9+genetic+screens+with+multiple+modalities.">Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities.</a> Nature Communications. 9, 5416 (2018).</li><li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPOR:+Intuitive+guide+selection+for+CRISPR/Cas9+genome+editing+experiments+and+screens.">CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).</li><li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR.">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).</li><li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening.">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).</li><li>Tseng, Y. H., Kriauciunas, K. M., Kokkotou, E., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+insulin+receptor+substrates+in+brown+adipocyte+differentiation.">Differential roles of insulin receptor substrates in brown adipocyte differentiation.</a> Molecular and Cellular Biology. 24 (5), 1918-1929 (2004).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+Sample+preparation+to+detection.">Western blotting: Sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).</li><li>Jarrett, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+genome+editing+with+CRISPR/Cas9+generates+and+corrects+a+metabolic+disease.">Somatic genome editing with CRISPR/Cas9 generates and corrects a metabolic disease.</a> Scientific Reports. 7, 44624 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+RNA-targeting+CRISPR/Cas13d+technology+outperforms+shRNA+in+identifying+functional+circRNAs.">Optimized RNA-targeting CRISPR/Cas13d technology outperforms shRNA in identifying functional circRNAs.</a> Genome Biology. 22 (1), 41 (2021).</li><li>Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+purification,+and+quality+control+for+adeno-associated+virus-based+vectors.">Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).</li><li>Jimenez, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+adeno-associated+viral+vector-mediated+genetic+engineering+of+white+and+brown+adipose+tissue+in+adult+mice.">In vivo adeno-associated viral vector-mediated genetic engineering of white and brown adipose tissue in adult mice.</a> Diabetes. 62 (12), 4012-4022 (2013).</li><li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling.">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li><li>Huang, W., Queen, N. J., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rAAV-mediated+gene+delivery+to+adipose+tissue.">rAAV-mediated gene delivery to adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 1950, 389-405 (2019).</li><li>Xue, K., Wu, D., Qiu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+and+efficient+gene+knockout+and+overexpression+in+mouse+interscapular+brown+adipocytes+in+vivo.">Specific and efficient gene knockout and overexpression in mouse interscapular brown adipocytes in vivo.</a> STAR Protocols. 3 (4), 101895 (2022).</li></ol>

İnterskapuler BAT'a AAV aracılı gen iletimi için mevcut yayınlanmış yöntemler, BAT'ye doğrudan AAV enjeksiyonu için cerrahi teknikleri ve yaklaşımı açıklayan ayrıntılı resimler ve videolar içermemektedir. Yayınlanan yöntemlerin çoğunda33,34, AAV, BAT'ın kendisi yerine interskapuler BAT'ı çevreleyen yağ dokularına enjekte edilir. Bu nedenle, bu protokolde çalışmanın başarısını belirleyen birkaç önemli adım vardır. Bunlar ara...

Obezite dünya çapında önemli bir oranda artmakta ve geniş bir metabolik hastalık spektrumuna yol açmaktadır 1,2,3. Yağ dokusu bu patolojilerin anahtarıdır. İşlevsel olarak farklı iki yağ dokusu tipi, fazla kaloriyi depolayan beyaz yağ dokusu (WAT) ve termojenez için enerjiyi dağıtan kahverengi yağ dokusu (BAT) ve ilgili bej / brite yağıdır. BAT, enerji dağıtıcı işlevi ile tanınırken, distal organlarda metabolizmayı düzenleyen biyoaktif moleküllerin üretimi yoluyla endokrin fonksiyonlara da sahiptir 4,5. Kemirgenlerde yapılan çok sayıda çalışma, kahverengi veya bej yağın miktarının veya aktivitesinin arttırılmasının, enerji harcamasının artmasına ve insülin duyarlılığının artmasına neden olduğunu göstermiştir. İnsanlarda, saptanabilir BAT'lı kişilerde kardiyometabolik hastalık prevalansı anlamlı derecede düşüktür6. Bu nedenle, BAT obezite ile ilişkili metabolik sekeller 7,8,9 için mükemmel terapötik potansiyele sahiptir.
BAT gelişim ve fonksiyonunun fizyolojisini ve patofizyolojisini araştırmak ve bu süreçlerde yer alan moleküler mekanizmaları aydınlatmak için, BAT'ye özgü transgenik fare modeli tercih edilen bir yöntemdir10. Cre-LoxP rekombinasyon sistemi, fare genomunu düzenleyerek koşullu nakavt fareleri üretmek için en yaygın kullanılan araçtır. Bu sistem, ilgili genlerin doku/hücreye özgü bir şekilde modifikasyonunu (aşırı ekspresyon veya nakavt) sağlamıştır11. Ayrıca, seçici bir floresan muhabir genini eksprese ederek belirli bir hücre tipini etiketlemek için de kullanılabilir.
Son zamanlarda, Cre-LoxP sistem yaklaşımı, CRISPR-Cas9 teknolojisi ve adeno-ilişkili virüs (AAV) tek kılavuzlu RNA (sgRNA) sistemi12'nin birleştirilmesiyle daha da geliştirilmiştir. CRISPR-Cas9 sistemi, genom13'ün kesin bölgelerini değiştirmek, düzenlemek veya hedeflemek için spesifik ve etkili bir gen düzenleme aracıdır. CRISPR-Cas9 tabanlı genom düzenleme, genomik lokusların hızlı genetik manipülasyonuna izin verir, çünkü bir gen hedefleme vektörü ile homolog rekombinasyon gerektirmez. Kombine Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ve AAV-sgRNA teknikleri, araştırmacıların dokularda / hücrelerde istenen zamanlarda ilgilenilen genlerin rolünün araştırılmasına izin vererek gen fonksiyonlarını daha kesin bir şekilde anlamalarını sağlar. Ek olarak, bu kombine teknikler transgenik fareler üretmek için gereken zamanı ve çabayı azaltır ve indüklenebilir bir Cre hattı kullanılıyorsa, farelerde indüklenebilir genom düzenlemesi için CRISPR-Cas9 aktivitesinin zamansal kontrolüne izin verir14.
AAV vektörleri in vivo gen dağıtım sistemlerinde güvenli ve etkilidir. Bununla birlikte, yağ dokusunu hedef alan AAV'ler, beyin, kalp, karaciğer ve kas15 gibi diğer dokulardaki uygulamaların gerisinde kalmıştır. Doğal olarak oluşan serotip vektörleri ile nispeten düşük transdüksiyon verimliliği ve tropizm nedeniyle, yağ dokusuna AAV rehberliğinde gen iletimi hala zordur15. Son 5 yılda, biz ve diğerleri, AAV rehberliğindeki genleri yağ dokusuna iletmek için etkili ve minimal invaziv yollar oluşturduk ve BAT fonksiyonunun düzenlenmesinde yer alan genleri anlamamızı sağlayan fare modelleri oluşturduk16,17,18,19. Örneğin, 12-lipoksijenazı (12-LOX) kodlayan Alox12'yi hedefleyen sgRNA'yı Ucp1-Cre / Cas9 farelerinin BAT'ına iletmek için AAV8'i kullanarak, aktive edilmiş BAT'ın glikoz metabolizmasını düzenlemek ve obezite ile ilişkili inflamasyonu çözmek için sırasıyla 12-hidroksi-eikosapentaenoik asit (12-HEPE) ve 13R, 14S-dihidroksi dokosaheksaenoik asit (maresin 2) olmak üzere 12-LOX metabolitleri ürettiğini keşfettik. 17. Burada, kombine Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ve AAV-sgRNA sistemini kullanarak BAT'a özgü nakavt fareleri üretmek için teknik prosedürler, özellikle AAV-sgRNA'nın BAT loblarına doğrudan mikroenjeksiyonu için cerrahi konusunda adım adım bir protokol sunuyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM serum-free medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransIT-LT1 Transfection Reagent</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>MIR 2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lentiCRISPR v2 vector&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>89060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G envelope plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2 packaging plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Cell Lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT-1 cells</td>
			<td>Developed in Tseng lab</td>
			<td>PMID: 14966273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Organisms/Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 knockin mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>24857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ucp1-CRE mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>24670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Banamine</td>
			<td>Patterson</td>
			<td>07-859-1323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Model 710 RN Syringe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/Bx</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>1273504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/Bx</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>1294522</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of brown fat-specific knockout mice using a combined cre-loxp, crispr-cas9, and adeno-associated virus single-guide rna system

Kahverengi yağ dokusu (BAT), biyoaktif moleküllerin salgılanması yoluyla endokrin bir organ olarak da işlev görebilen, enerji dağılımında uzmanlaşmış bir yağ deposudur. BAT'a özgü nakavt farelerin yaratılması, ilgili bir genin BAT aracılı enerji düzenlemesine katkısını anlamak için en popüler yaklaşımlardan biridir. Cre-LoxP sistemini kullanan geleneksel gen hedefleme stratejisi, dokuya özgü nakavt fareleri üretmek için temel yaklaşım olmuştur. Ancak, bu yaklaşım zaman alıcı ve sıkıcıdır. Burada, kombine bir Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ve adeno-ilişkili virüs (AAV) tek kılavuzlu RNA (sgRNA) sistemi kullanarak BAT'a ilgi duyan bir genin hızlı ve verimli bir şekilde nakavt edilmesi için bir protokol açıklıyoruz. İnterskapuler BAT, kaslar arasındaki derin tabakada bulunur. Bu nedenle, AAV'yi görme alanı içinde BAT'a tam ve doğrudan enjekte etmek için BAT açığa çıkarılmalıdır. BAT'ye bağlanan Sultzer damarı gibi sempatik sinirlerin ve damarların zarar görmesini önlemek için uygun cerrahi kullanım çok önemlidir. Doku hasarını en aza indirmek için, BAT'ın üç boyutlu anatomik yerini ve teknik adımlarda gerekli olan cerrahi becerileri anlamak için kritik bir ihtiyaç vardır. Bu protokol, ilgilenilen geni hedef alan sgRNA'ların tasarımı, AAV-sgRNA parçacıklarının hazırlanması ve BAT'deki genlerin biyolojik işlevlerini incelemek için geniş çapta uygulanabilecek BAT'ye özgü nakavt fareleri üretmek için AAV'nin her iki BAT lobuna doğrudan mikroenjeksiyonu ameliyatı da dahil olmak üzere temel teknik prosedürleri vurgulamaktadır.

Yukarıdaki prosedürler boyunca, AAV-sgRNA'nın BAT'a kesin olarak verilmesi, protokolün başarısı için çok önemlidir. AAV-sgRNA'nın etkisini en üst düzeye çıkarmak ve ameliyat sırasında doku hasarını en aza indirmek için, BAT'nin üç boyutlu (3D) anatomik yerini anlamak önemlidir. Şekil 3E'de gösterildiği gibi, dokuyu açığa çıkarmadan BAT'ın kesin yerini belirlemek zordur. Bununla birlikte, aşırı BAT maruziyeti dokuya zarar verebilir (Şek...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Brown Fat-Specific Knockout Mice Using a Combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and Adeno-Associated Virus Single-Guide RNA System at JoVE.com

Generation of Brown Fat-Specific Knockout Mice Using a Combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and Adeno-Associated Virus Single-Guide RNA System

Bu protokolde, kombine bir Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ve adeno ilişkili virüs (AAV) tek kılavuzlu RNA (sgRNA) sisteminden yararlanarak kahverengi yağ dokusuna (BAT) özgü nakavt fareleri üretmek için teknik prosedürleri açıklıyoruz. Açıklanan adımlar, sgRNA'ların tasarımını, AAV-sgRNA parçacıklarının hazırlanmasını ve AAV'nin BAT loblarına mikroenjeksiyonunu içerir.

Kombine Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ve Adeno İlişkili Virüs Tek Kılavuzlu RNA Sistemi Kullanılarak Kahverengi Yağa Özgü Nakavt Farelerin Üretimi

Brown adipose tissue (BAT) is an adipose depot specialized in energy dissipation that can also serve as an endocrine organ via the secretion of bioactive ...

Bu protokol, bir Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ve adeno ilişkili virüs tek kılavuzlu RNA sistemi kullanarak kahverengi yağa özgü nakavt fareleri üretir. AAV'yi kahverengi yağa güvenli bir şekilde uygulamak için cerrahi bir teknik içerir. Bu tekniğin temel avantajı, fareleri seçici olarak yetiştirmeye gerek kalmadan dokuya özgü nakavtları hızla üretebilmesidir.Dokuya özgü nakavt veya nakavt yapma yaklaşımı, AAV enjekte etmek için cerrahi prosedür hedef organa göre değiştirilirse diğer dokulara uyarlanabilir. Başlamak için, postoperatif ağrı ve sıkıntıyı en aza indirmek ve önlemek için anestezi uygulanan UCP1 Cre Cas9 fareye analjezik deri altından uygulayın. Daha sonra kürkü bir tıraş makinesi kullanarak interskapuler bölgesinde tıraş edin ve cerrahi alanı iyot bazlı veya klorheksidin bazlı bir ovmanın en az üç alternatif turu ve ardından% 70 etanol ile sterilize edin.Bir neşter kullanarak, interskapular yağları açığa çıkarmak için skapula arasındaki kahverengi yağ dokusunun üzerindeki deride iki santimetrelik bir kesi yapın. Tek bir kesi yaptıktan sonra yağ dokularının distal bölgesi ile kaslar arasındaki sınırdaki yağ dokularını kesin. Daha sonra baskın eldeki cerrahi makası kullanarak, kahverengi yağ dokusunu açığa çıkarmak için yağ dokularını künt ve dikey olarak soyun, kahverengi yağ dokusu da dahil olmak üzere yağ dokularını baskın olmayan el ile sıkıştırın.Sulzer'in damarını, kesin kahverengi yağ dokusu yerini belirtmek için bir dönüm noktası olarak kullanın. Daha sonra, her fare için, 100 mikrolitrelik bir Hamilton şırıngasına bağlı keskin bir 32 gauge iğne kullanarak iki kahverengi yağ dokusunun her bir lobuna yavaşça 20 mikrolitre adeno ilişkili virüs veya AAV enjekte edin. AAV uygulaması sırasında enjekte edilen bölgeden sızıntı olmadığını gösteren başarılı enjeksiyonu onaylayın.Homeostazı sağladıktan sonra, 5-0 emilebilir bir monofilament iplik kullanarak yağ dokularının ve kasın kenarını dikmek için maruz kalan yağ dokularını normal konumlarına geri yerleştirin. Son olarak, açık cildi 5-0 kaplamalı VICRYL boyasız örgülü ipliklerle dikin. Kahverengi yağ dokusunun kesin yeri, maruz kalmadan tespit edilemez, ancak dokuya aşırı maruz kalma hasarı.Başarısız enjeksiyonlara yol açabilecek potansiyel kusurlar, AAV çözeltisinin yanlış bölgeye enjekte edilmesini, dokudan iğne penetrasyonunu ve AAV çözeltisinin aşırı hacmi nedeniyle doku balonlaşmasını içeriyordu. AAV tek kılavuz RNA'nın kahverengi yağ dokusuna hassas bir şekilde verilmesi, protokolün başarısı için çok önemliydi. Kahverengi yağ dokusunu açığa çıkarırken başarının anahtarı, makasın yönü ve derinliği ve Hamilton şırıngasının yeri de dahil olmak üzere cerrahi makas tekniğidir.Bu teknik, kahverengi yağ ile ilgili enerji metabolizmasının moleküler düzenleyicilerini anlamak için yük üreten dokuya özgü nakavt hayvanlarına sahiptir.

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Görselleştirme RNA Yerelleştirme Xenopus Oosit

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

CRISPR / Cas Sistemleri Endonükleazlar için Substrat Üretimi

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

CRISPR / Cas9 üzerinden Memeli Hücre Hatlarında Genomik Delesyonlar Üretimi

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

Nicel Dot Blot tahlil AAV titrasyon ve virüs Adeno ilişkili derleme etkinleştirme işlev değerlendirmesi için kullanımı için proteinler

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Kombine nükleotit ve Caenorhabditis elegans Protein çekimi

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 Kullanarak Boş Mutasyonlar Oluşturmak için Culex Sivrisineklerinin Embriyolarının Hazırlanması ve EnjekteSi

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 Kullanarak Birincil İnsan B Hücrelerinin Genom Mühendisliği

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

Baculovirus-Insect Hücre Kültürü Sistemi Kullanılarak Adeno-İlişkili Virüsün (AAV)2 Vektörün Üretimi ve Saflaştırılması için Süreç Geliştirme

Adeno-associated viruses (AAV) are promising vectors for gene therapy applications. Here, the AAV2 vector is produced by co-culture of Spodoptera ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...