Questo protocollo dimostra come far crescere sferoidi altamente riproducibili e mostra come possono essere condotti esperimenti proteomici per caratterizzare la funzione biologica delle strutture 3D. La nostra coltura 3D può produrre simultaneamente centinaia di repliche biologiche nello stesso bioreattore e l'approccio LC-MS può misurare l'abbondanza di migliaia di proteine in un singolo esperimento. A dimostrare la procedura sarà Stephanie Stransky, una postdoc del laboratorio.
Per iniziare, prendi la sospensione di cellule HepG2/C3A e THLE-3. Contare il numero di cellule e diluire la sospensione cellulare in un terreno di coltura completo per ottenere 1 milione di cellule in un volume massimo di 1,5 millilitri. Lavare i pozzetti di una piastra inferiore rotonda a 24 pozzetti con 0,5 millilitri di terreno di coltura e centrifugare a 3.000 g per cinque minuti.
Trasferire la sospensione cellulare nella piastra e centrifugarla per tre minuti a 120 g. Quindi, incubare la piastra per avviare la formazione di sferoidi. Successivamente, equilibrare il bioreattore 24 ore prima di trasferire gli sferoidi riempiendo la camera di umidità con 25 millilitri di acqua sterile e la camera cellulare con nove millilitri di terreno di coltura utilizzando una siringa da 10 millilitri con un ago lungo.
Quindi, posizionare il bioreattore in un incubatore 3D per 24 ore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Pipettare delicatamente gli sferoidi su e giù utilizzando punte con foro largo un millilitro per staccarli dalla piastra di attacco ultra-bassa e trasferirli in un piatto di coltura tissutale. Per catturare eventuali sferoidi rimanenti, lavare la piastra con 0,5 millilitri di terreno di coltura preriscaldato e trasferirli nel piatto di coltura.
Utilizzando un microscopio ottico, valutare le dimensioni, la compattezza e la rotondità degli sferoidi per selezionare quelli adeguatamente formati. Trasferire lo sferoide selezionato nel bioreattore equilibrante riempito con cinque millilitri di terreno di coltura fresco. Quindi, riempi l'intero bioreattore con nuovi terreni di crescita.
Posizionare il bioreattore nell'incubatore 3D e regolare la velocità di rotazione utilizzando l'unità di controllo. Sostituisci 10 millilitri di terreno di coltura vecchio con 10 millilitri di terreno fresco ogni due o tre giorni. Modificare la velocità di rotazione ogni volta dopo aver sostituito il supporto.
Coltiva gli sferoidi per 15 giorni e dividili tra due bioreattori freschi. Apri l'app 3D installata sul tablet, seleziona il bioreattore e acquisisci l'immagine. In alternativa, posizionare uno sfondo nero dietro il bioreattore e assicurarsi che la luce non venga riflessa sulla camera cellulare.
Cattura l'immagine il più vicino possibile al bioreattore. Quindi, raccogliere gli sferoidi rimuovendo cinque millilitri di terreno dal bioreattore utilizzando una siringa attaccata a un lungo ago attraverso la porta superiore. Assicurarsi che gli sferoidi scendano verso il basso al centro del bioreattore.
Ora, apri la porta anteriore e raccogli gli sferoidi usando una punta larga un millilitro. Trasferire questi sferoidi in provette da microcentrifuga, centrifugare a 500 g per cinque minuti e smaltire il terreno. Lavare lo sferoide aggiungendo 200 microlitri di HBSS per rimuovere l'FBS.
Successivamente, eseguire la centrifugazione a 500 g per cinque minuti e scartare il surnatante. Quindi, immergere rapidamente il pellet sferoidale in azoto liquido per congelarlo e conservare questo pellet congelato a meno 80 gradi Celsius fino a un'ulteriore lavorazione. Per lisare le cellule, prelevare una provetta di sferoidi raccolti e risospenderli in 25 microlitri di SDS al 5%.
Omogeneizzare il pellet pipettando su e giù. Successivamente, sciogliere un microgrammo di campioni e 10 microlitri di acido tricloroacetico allo 0,1%. Dopo aver estratto la proteina e pulito i campioni, impostare il metodo di acquisizione MS per generare gli spettri MS/MS dai segnali peptidici identificati.
Quindi, trasferire la piastra nell'autocampionatore per cromatografia liquida da nanolitri. Impostare la scansione MS completa su un rapporto massa-carica compreso tra 300 e 1, 100 nell'Orbitrap. Regolare la risoluzione a 120000 e impostare l'obiettivo di controllo automatico del guadagno su 125.
Quindi, impostare MS/MS nell'Orbitrap con una finestra di isolamento sequenziale di 50 rapporto massa/carica. Puntare il target di controllo automatico del guadagno a 400 e impostare un'energia di dissociazione collisionale di energia più elevata di 30. Secondo l'analisi di vitalità degli sferoidi, i livelli di adenilato chinasi aumentano fino al giorno 17, con conseguente morte cellulare di circa il 7%.
Successivamente, il tasso di mortalità scende al di sotto del 5%Inoltre, un'analisi del primo componente principale rivela una chiara distinzione tra campioni di sferoidi e colture cellulari piatte. L'analisi proteomica ha indicato che gli sferoidi THLE-3 e HepG2/C3A hanno profili simili che riflettono la funzionalità epatica. Inoltre, gli sferoidi hanno mostrato una sovraespressione di due isoforme di metallotioneine rispetto alle cellule piatte.
Le reti funzionalmente raggruppate hanno mostrato l'arricchimento dell'ontologia genica per il processo metabolico dei carboidrati nelle sfere HepG2/C3A e THLE-3. Per evitare fuoriuscite di terreno di coltura, non aprire o chiudere la porta anteriore quando la camera cellulare è completamente piena di liquido. La preparazione e l'analisi del campione descritte in questo protocollo possono essere utilizzate per esplorare il proteoma della coltura cellulare utilizzando metodi 2D e 3D, nonché campioni di tessuto.
