Cryo-EM è diventata una tecnica standard per la determinazione della struttura delle proteine e dei loro complessi. Questo protocollo descrive le best practice per ottenere set di dati Cryo-EM ad alta risoluzione dai microscopi TEM da 200 kV di fascia media. Cryo-EM può determinare la struttura proteica in condizioni quasi native in soluzione per più stati conformazionali e stati funzionali contemporaneamente, il che è sfuggente per altre tecniche strutturali.
Le informazioni strutturali ottenute possono essere utilizzate per chiarire i meccanismi molecolari della funzione proteica, nonché per la progettazione di farmaci basati sulla struttura. Ad esempio, una recente pubblicazione nella struttura delle fibrille amiloidi ha rivelato più siti di legame di un ligando vitale. Tuttavia, in questo protocollo, utilizziamo i campioni standard di apofertitina e proteasoma per dimostrare i passaggi critici per ottenere dati Cryo-EM ad alta risoluzione.
Il funzionamento di un Cryo-TEM è diventato più facile negli ultimi anni, soprattutto grazie all'introduzione di funzionalità di automazione avanzate. Tuttavia, per la prima sessione, ti consigliamo di avere una formazione con utenti più esperti. Da lì, la progressione nella tecnica è relativamente veloce.
A dimostrare la procedura sarà Adrian Koh, che è uno scienziato senior delle applicazioni presso Thermo Fisher Scientific. Inserire griglie automatiche nella cassetta del caricatore automatico in condizioni di azoto liquido. Inserire la cassetta con griglie automatiche in una capsula di trasferimento raffreddata ad azoto liquido.
Inserire ulteriormente la capsula nel microscopio e fare clic sul pulsante Dock nell'interfaccia utente del microscopio per caricare la cassetta dalla capsula nel caricatore automatico del microscopio. Fare clic sul pulsante Inventario per verificare la presenza di griglie automatiche nella cassetta caricata. Quindi fare clic sui pulsanti Carica e Scarica per inserire le griglie automatiche nella colonna per l'imaging TEM.
Selezionare la scheda Atlante e fare clic sul pulsante Nuova sessione per aprire una nuova sessione. Inserisci dettagli come il nome della sessione e la posizione di archiviazione dei dati e fai clic sul pulsante Applica. Selezionare le griglie di interesse selezionando una casella di controllo accanto al numero di griglia corrispondente.
Fare clic sul pulsante Start per avviare una raccolta completamente automatizzata di atlanti di tutte le griglie selezionate. Una volta completata la raccolta, fare clic sulle etichette della griglia per rivedere gli atlanti acquisiti. Seleziona la scheda EPU e vai a Nuova sessione per creare una nuova sessione nel pannello di sinistra.
Selezionare l'opzione Nuova sessione per utilizzare i predefiniti ottici impostati correntemente. Inserisci il nome della sessione. Selezionare il tipo manuale della sessione per avere il controllo sulla selezione dei singoli fori e quadrati della griglia selezionati per la raccolta dei dati in un secondo momento nel protocollo.
Selezionare la modalità di acquisizione più veloce per utilizzare lo spostamento dell'immagine senza aberrazione per la raccolta dei dati. Quindi inserisci la posizione in cui salvare i metadati. Fare clic sul pulsante Applica per creare una nuova sessione.
Selezionare l'attività di selezione quadrata nel pannello di sinistra per visualizzare l'atlante raccolto della griglia. Identificare i quadrati della griglia con lamina di supporto intatta senza danni, sottili fori di ghiaccio vitreo e lamina, contaminazione trascurabile del ghiaccio cristallino nel quadrato della griglia e gradiente di luminosità minimo attraverso il quadrato della griglia e all'interno dei singoli fori della lamina. Selezionare i quadrati della griglia per la raccolta dei dati, nell'atlante completo o nelle immagini dei riquadri di alta qualità.
Fare clic con il pulsante destro del mouse su un quadrato della griglia di interesse e scegliere l'intera attività di selezione. Fare clic sul pulsante Auto Eucentric per spostarsi automaticamente nel primo quadrato della griglia selezionato. Regola l'altezza eucentrica e acquisisci un'immagine quadrata della griglia per trovare i fori della lamina.
Fare clic sul pulsante Trova fori per trovare i fori di alluminio nell'immagine. Fate clic sul pulsante Rimuovi fori (Remove Holes) per chiudere il pulsante della barra della griglia e deselezionare i fori vicino alle barre della griglia. Regolare i limiti nell'istogramma di luminosità del filtro del ghiaccio per rimuovere tutti i fori con ghiaccio troppo spesso e tutti i fori vuoti.
Fare clic con il pulsante destro del mouse su un foro nell'immagine quadrata della griglia e selezionare sposta lo stage nella fase di spostamento della posizione qui. Selezionare l'attività di definizione del modello nel pannello di sinistra. Fare clic sul pulsante Acquisisci per acquisire un'intera immagine.
Impostate i valori per il ritardo dopo lo spostamento dell'immagine a 0,5 secondi e il ritardo dopo lo spostamento dello stage a cinque secondi. Fate clic sul pulsante Trova (Find and Center Hole) per centrare un foro nell'immagine. Seleziona il pulsante Aggiungi area di acquisizione e fai clic sull'immagine per selezionare la posizione nel foro centrato in cui verrà eseguita l'acquisizione di immagini ad alto ingrandimento.
Selezionare il pulsante Aggiungi area di messa a fuoco automatica e fare clic sull'immagine per selezionare la posizione sulla lamina di supporto accanto al foro centrato in cui verrà eseguita la messa a fuoco automatica dell'immagine. Fare clic sull'area di acquisizione verde per impostare una sequenza di valori di sfocatura nell'elenco di sfocatura nella sezione superiore della finestra del software. Dopo aver impostato le impostazioni specifiche della messa a fuoco automatica, scegliere l'opzione Dopo la centratura per la messa a fuoco automatica all'inizio di ogni cluster AFIS.
Scegli l'opzione Obiettivo obiettivo per una messa a fuoco automatica più veloce e una deriva dello stadio ridotta. Fare clic sul pulsante Prepara tutti i quadrati nell'attività di selezione dei fori per impostare automaticamente la raccolta dei dati e tutti gli altri quadrati della griglia selezionati in base alle impostazioni utilizzate in questo primo quadrato della griglia. Seleziona l'attività di definizione del modello, acquisisci una nuova immagine, sposta lo stage in un'area pulita su carbon foil facendo clic con il pulsante destro del mouse e seleziona l'opzione di menu sposta stage qui.
Selezionare la scheda Funzioni automatiche. Dopo aver impostato la sfocatura e l'iterazione desiderate, passare al preset di messa a fuoco automatica e fare clic sul pulsante di avvio per eseguire la funzione di messa a fuoco automatica. Selezionare l'attività Autostigmate, passare al preset Thon Ring e premere il pulsante Start.
Selezionare l'attività Autocoma e premere il pulsante Start. Spostare lo stage in un'area con un quadrato a griglia spezzato. Conferma la trasparenza dell'area scattando una singola immagine con messa a fuoco automatica.
Apri Sherpa UI e seleziona l'applicazione Energy Filter. Fare clic sul pulsante Centro e sull'opzione zero perdita per centrare la fessura del filtro a perdita zero energia. Fare clic sul pulsante Sintonizzazione nell'opzione isocromaticità.
Fare clic sull'opzione Ingrandimento sintonizzazione e Distorsioni sintonizzazione nelle distorsioni geometriche e cromatiche. Vai alla scheda EPU, seleziona l'attività acquisizione automatica e fai clic sul pulsante Avvia esecuzione per iniziare la raccolta dati completamente automatizzata. La figura mostra le griglie Cryo-EM che mostrano un gradiente di spessore del ghiaccio sulla superficie della griglia.
Le griglie escluse dall'ulteriore indagine sono una griglia cattiva con ghiaccio spesso e una griglia piegata con ghiaccio cattivo e contaminazione, mentre le griglie accettabili sono quelle con un buon gradiente di ghiaccio e una griglia tipica con ghiaccio sottile buono e piccolo gradiente di ghiaccio. La figura mostra il rendering 3D finale della mappa Cryo-EM di apoferritina ricostruita. L'elevata stabilità e simmetria lo rendono un campione di riferimento ottimale per l'imaging Cryo-EM ad alta risoluzione e l'elaborazione delle immagini.
La lucidatura bayesiana, il perfezionamento CTF e la correzione della sfera di Ewald hanno portato a una mappa di risoluzione di 1,63 angstrom. La figura mostra una vista dettagliata della mappa cryo-EM dell'apoferritina ricostruita a livello della catena laterale dei singoli amminoacidi. La densità delle catene laterali di amminoacidi è ben risolta e il modello atomico può essere costruito in modo inequivocabile all'interno della mappa.
L'immagine qui mostra due diversi set di dati a diversi valori di sfocatura raccolti dalla stessa griglia Cryo-EM con quadrati di griglia simili con una fessura completamente aperta e una fessura a 10 elettronvolt che indica che la fessura a 10 elettronvolt migliora significativamente il contrasto dell'immagine. La figura qui mostra una panoramica della mappa Cryo-EM del proteasoma 20S con subunità segmentate utilizzate come campione Cryo-EM standard. E la sua vista ingrandita con un modello atomico adattato rappresenta il nucleo catalitico stabile del complesso del proteasoma con la simmetria D7.
Il protocollo contiene due passaggi critici. Uno, alla ricerca di aree con ghiaccio vitreo sottile contenente particelle omogenee. E due, l'impostazione dell'illuminazione parallela per l'acquisizione dei dati.
Con ricostruzioni ad alta risoluzione di proteine che raggiungono due o tre angstrom in risoluzione, sei in grado di comprendere meglio i meccanismi molecolari della malattia e migliorare i lead farmacologici. In precedenza, la cristallizzazione era necessaria se si voleva studiare le basi strutturali dei fenomeni biologici. Oggi con Cryo-EM, questo non è più necessario.
E così con Cryo-EM, consentiamo agli scienziati di studiare una gamma più ampia di fenomeni biologici a livello strutturale.
