Name: semi-automated phenotypic analysis of functional 3d spheroid cell cultures
Uploaded: 2023-08-18T13:10:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures at JoVE.com

يعترف مختبر Sidoli بامتنان بمؤسسة أبحاث اللوكيميا (منحة أبحاث الباحث الجديد Hollis Brownstein) ، AFAR (جائزة Sagol Network GerOmics) ، Deerfield (جائزة Xseed) ، Relay Therapeutics ، Merck ، ومكتب مدير المعاهد الوطنية للصحة (1S10OD030286-01).

<ol>
	<li>Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture+systems:+advantages+and+applications.">3D cell culture systems: advantages and applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).</li><li>Nirmalanandhan, V. S., Duren, A., Hendricks, P., Vielhauer, G., Sittampalam, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+anticancer+agents+in+a+three-dimensional+cell+culture+model.">Activity of anticancer agents in a three-dimensional cell culture model.</a> Assay and Drug Development Technologies. 8 (5), 581-590 (2010).</li><li>Erickson, I. E., Huang, A. H., Chung, C., Li, R. T., Burdick, J. A., Mauck, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+maturation+and+structure-function+relationships+in+mesenchymal+stem+cell-+and+chondrocyte-seeded+hydrogels.">Differential maturation and structure-function relationships in mesenchymal stem cell- and chondrocyte-seeded hydrogels.</a> Tissue Engineering Part A. 15 (5), 1041-1052 (2009).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation.">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biology. 10 (29), (2012).</li><li>Liu, J., Abate, W., Xu, J., Corry, D., Kaul, B., Jackson, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroid+cultures+of+A549+and+HepG2+cells+exhibit+different+lipopolysaccharide+(LPS)+receptor+expression+and+LPS-induced+cytokine+response+compared+with+monolayer+cultures.">Three-dimensional spheroid cultures of A549 and HepG2 cells exhibit different lipopolysaccharide (LPS) receptor expression and LPS-induced cytokine response compared with monolayer cultures.</a> Innate Immunity. 17 (3), 245-255 (2011).</li><li>Khafaga, A. F., Mousa, S. A., Aleya, L., Abdel-Daim, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+(3D)+cell+culture:+a+valuable+step+in+advancing+treatments+for+human+hepatocellular+carcinoma.">Three-dimensional (3D) cell culture: a valuable step in advancing treatments for human hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Cell International. 22 (1), 243 (2022).</li><li>Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocellular+carcinoma.">Hepatocellular carcinoma.</a> The Lancet. 362 (9399), 1907-1917 (2003).</li><li>Sia, D., Llovet, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+cancer:+Translating+'-omics'+results+into+precision+medicine+for+hepatocellular+carcinoma.">Liver cancer: Translating '-omics' results into precision medicine for hepatocellular carcinoma.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 14 (10), 571-572 (2017).</li><li>Tang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+cell+biology+model+of+human+hepatocellular+carcinoma+in+vitro.">A three-dimensional cell biology model of human hepatocellular carcinoma in vitro.</a> Tumour Biology. 32 (3), 469-479 (2011).</li><li>van Zijl, F., Mikulits, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatospheres:+Three+dimensional+cell+cultures+resemble+physiological+conditions+of+the+liver.">Hepatospheres: Three dimensional cell cultures resemble physiological conditions of the liver.</a> World Journal of Hepatology. 2 (1), 1-7 (2010).</li><li>Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+as+an+in+vitro+platform+for+cancer+and+stem+cell+modeling.">Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling.</a> World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).</li><li>Wrzesinski, K., Fey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+and+the+recovery+of+physiological+functionality+in+3D+cultures+in+micro-bioreactors.">Metabolic reprogramming and the recovery of physiological functionality in 3D cultures in micro-bioreactors.</a> Bioengineering(Basel, Switzerland). 5 (1), 22 (2018).</li><li>Breslin, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+The+missing+link+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: The missing link in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).</li><li>Kapalczynska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D+cell+cultures+-+a+comparison+of+different+types+of+cancer+cell+cultures.">2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures.</a> Archives of Medical Science: AMS. 14 (4), 910-919 (2018).</li><li>Wrzesinski, K., Frandsen, H. S., Calitz, C., Gouws, C., Korzeniowska, B., Fey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinostat+3D+cell+culture:+Protocols+for+the+preparation+and+functional+analysis+of+highly+reproducible,+large,+uniform+spheroids+and+organoids.">Clinostat 3D cell culture: Protocols for the preparation and functional analysis of highly reproducible, large, uniform spheroids and organoids.</a> Methods in Molecular Biology. 2273, 17-62 (2021).</li><li>Joseph-Chowdhury, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+level+quantification+of+histone+post-translational+modifications+in+a+3D+cell+culture+model+of+hepatic+tissue.">Global level quantification of histone post-translational modifications in a 3D cell culture model of hepatic tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 183, 63606 (2022).</li><li>Wrzesinski, K., Fey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=After+trypsinisation,+3D+spheroids+of+C3A+hepatocytes+need+18+days+to+re-establish+similar+levels+of+key+physiological+functions+to+those+seen+in+the+liver.">After trypsinisation, 3D spheroids of C3A hepatocytes need 18 days to re-establish similar levels of key physiological functions to those seen in the liver.</a> Toxicology Research. 2, 123-135 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Bindea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClueGO:+a+Cytoscape+plug-in+to+decipher+functionally+grouped+gene+ontology+and+pathway+annotation+networks.">ClueGO: a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks.</a> Bioinformatics. 25 (8), 1091-1093 (2009).</li><li>Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenomics:+The+next+challenge.">Phenomics: The next challenge.</a> Nature Reviews. Genetics. 11 (12), 855-866 (2010).</li><li>Gonneaud, A., Asselin, C., Boudreau, F., Boisvert, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+organoids+by+proteomics.">Phenotypic analysis of organoids by proteomics.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li><li>Avelino, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics+of+3D+cell+culture:+A+useful+tool+to+validate+culture+of+spheroids+and+organoids.">Mass spectrometry-based proteomics of 3D cell culture: A useful tool to validate culture of spheroids and organoids.</a> SLAS Discovery. 27 (3), 167-174 (2022).</li><li>Chiang, J., McManus, L. M., MitchellIn, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liver physiology: Metabolism and Detoxification. Pathobiology of Human Disease. , 1770-1782 (2014).</li><li>Begriche, K., Massart, J., Robin, M. A., Borgne-Sanchez, A., Fromenty, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-induced+toxicity+on+mitochondria+and+lipid+metabolism:+Mechanistic+diversity+and+deleterious+consequences+for+the+liver.">Drug-induced toxicity on mitochondria and lipid metabolism: Mechanistic diversity and deleterious consequences for the liver.</a> Journal of Hepatology. 54 (4), 773-794 (2011).</li><li>Fey, S. J., Korzeniowska, B., Wrzesinski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+to+and+recovery+from+treatment+in+human+liver-mimetic+clinostat+spheroids:+a+model+for+assessing+repeated-dose+drug+toxicity.">Response to and recovery from treatment in human liver-mimetic clinostat spheroids: a model for assessing repeated-dose drug toxicity.</a> Toxicology Research. 9 (4), 379-389 (2020).</li><li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+image+analysis+software+tools+for+exploring+and+understanding+big+image+data+from+cell-based+assays.">Phenotypic image analysis software tools for exploring and understanding big image data from cell-based assays.</a> Cell Systems. 6 (6), 636-653 (2018).</li></ol>

تعمل هيلي سيديغي فراندسن كعالمة أبحاث في CelVivo ApS ، منتجة نظام ClinoStar. كارولين ميكلسن طالبة دكتوراه صناعية تعمل في CelVivo ApS وتؤدي دراسة الدكتوراه في SDU ، أودنسه ، الدنمارك. جميع المؤلفين الآخرين ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

إن فهم البيولوجيا وراء الهياكل الخلوية ثلاثية الأبعاد (3D) مهم للغاية للحصول على معرفة أكثر شمولا بوظائفها. هناك اهتمام متزايد باستخدام نماذج 3D لدراسة البيولوجيا المعقدة وإجراء فحص السمية. عند زراعة الخلايا في 3D ، يجب مراعاة العديد من العوامل ، بما في ذلك تقييم النمط الظاهري للنظام النموذجي. يعرف النمط الظاهري بأنه مجموعة من الخصائص التي يمكن ملاحظتها لكائن حي معين ، مثل التشكل والسلوك والخصائص الفسيولوجية والكيميائية الحيوية20.
في هذا البروتوكول ، نوضح كيف يمكن إجراء تجارب البروتينات من عدد قليل من الكائنات الكروية ويمكن استخدامها لمراقبة النمط الظاهري النموذجي للكبد. أصبح قياس الطيف الكتلي طريقة مطبقة على نطاق واسع لتوصيف الخلايا ثلاثية الأبعاد ، مما يسمح بالتحقيق في مجموعة متنوعة من الأسئلة البيولوجية 12،16،21،22. لإجراء تحليل شامل للبروتين ، يوصى باستخدام 20 ميكروغرام على الأقل من مادة بدء البروتين ، والتي يتم حقن 1 ميكروغرام منها في مطياف الكتلة. من المهم الإشارة إلى أن إضافة عينة أقل قد يؤدي إلى فقدان الحساسية ، وإضافة المزيد من شأنه أن يؤدي تدريجيا إلى تدهور جودة اللوني ويؤدي في النهاية إلى سد العمود. في هذه الدراسة ، أظهرنا أن الأجسام الكروية HepG2 / C3A و THLE-3 غنية ببروتينات مهمة من تحلل السكر ودورة TCA ، وهي مسارات كبدية محددة وضرورية للحفاظ على مستويات الجلوكوز في الدم ولإنتاج الطاقة23,24. في الواقع ، لا يوفر تحليل قياس الطيف الكتلي معلومات على مستوى البروتين فحسب ، بل يسمح أيضا بالتحقيق في تعديلات البروتين بعد الترجمة ، كما هو موضح سابقا من قبل مجموعتنا16.
جانب آخر يجب مراعاته في دراسات النمط الظاهري 3D هو عدد وحجم الأجسام الكروية. إلى جانب جعل التجارب أكثر قابلية للتكرار ، فإن حساب عدد الأجسام الكروية وتحديد حجمها أمر ضروري لتحديد وقت تقسيم الثقافة إلى مفاعلات حيوية متعددة ، حيث أن عدد هياكل 3D داخل الوعاء يمكن أن يؤثر على حجم الكائنات الكروية ومستويات النشاط الأيضي. ومع ذلك ، من المهم تسليط الضوء على أن عدد وحجم الأجسام الكروية يعتمدان على خط الخلية ، وعدد الخلايا الأولية ، وعملية الانقسام ، ووقت التجميع. تم توفير تفاصيل الثقافة الكروية HepG2 / C3A ، مثل عدد الخلايا لكل كروية ، ومحتوى البروتين ، والحجم كدالة للعمر ، بواسطة Fey و Korzeniowska و Wrzesinski25. للحصول على تحليل دقيق وناجح باستخدام الطريقة شبه الآلية الموضحة هنا ، فإن الخطوة الأكثر أهمية هي صورة كروية جيدة. من أجل البساطة ، يمكن التقاط الصورة بهاتف أو جهاز لوحي ، ولكن يجب أن تظل دقتها عالية قدر الإمكان. نظرا لسرعة الحصول على الصور ، فإنها تسمح لتجارب الفحص واسعة النطاق بتصور ميزات النمط الظاهري المحددة أو التحقيق في الاستجابات للعلاج بالعقاقير. لذلك ، نظرا للعدد المتزايد من المقايسات القائمة على الخلايا ، تم تطوير عدد من البرامج مفتوحة المصدر على مدى السنوات ال 10 الماضية لتحليل الصور26. في هذا البروتوكول ، نصف نظاما شبه آلي يستخدم برنامج FIJI18 لحساب وقياس حجم الأجسام الكروية. قدمنا نصوصا (أوامر برمجة بسيطة) لتحديد سلسلة من العمليات الخوارزمية التي يمكن تطبيقها على مجموعة الصور ، مما يجعل التحليل عملية سهلة وسريعة. ومع ذلك ، اعتمادا على خاصية كروية ، ينبغي استخدام القياس اليدوي. على سبيل المثال ، إذا كانت الأجسام الكروية شفافة للغاية ، فسيكون نص فيجي غير دقيق. بالمناسبة ، أحد أهم معايير هذه الطريقة للعمل هو انضغاط الأجسام الكروية. ستساهم هذه الخاصية في تباين ألوان أكثر تعزيزا بين الكرويات والخلفية ، وهو أمر ضروري لكي تكون الطريقة دقيقة.
باختصار ، إلى جانب تقديم منهجية لزراعة الكرات عالية التكاثر ، تم أيضا وصف نظام شبه آلي مقترن بتوصيف النمط الظاهري عبر التقاط الصور والبروتينات. نتوقع أن تصبح مجموعة الأدوات هذه لتحليل خلايا 3D أكثر قوة مع برنامج تحليل الصور الآلي الكامل ومقاييس الطيف الكتلي من الجيل التالي.

لقد ثبت أن مزارع الخلايا في المختبر ضرورية ولا تقدر بثمن في إنشاء المعرفة الأساسية في علم الأحياء. الكثير من الفهم العلمي في علم الأحياء والسرطان على وجه التحديد جاء من نظام ثقافة 2D الذي هو خلايا تنمو في طبقة واحدة. على الرغم من أن ثقافة 2D كانت نظام زراعة الخلايا المهيمن ، إلا أن لها العديد من العيوب التي يمكن أن تخنق المزيد من التقدم البيولوجي. على سبيل المثال ، تفتقر الثقافات ثنائية الأبعاد إلى تفاعلات الخلايا الخلوية المهمة لإشارات الخلية وانتشارها1. حتى الآن ، ثبت أن أنظمة الثقافة ثلاثية الأبعاد تعمل على تحسين تمايز النماذج ، والاستجابة للأدوية ، وغزو الورم ، والبيولوجيا2،3،4،5. النمذجة 3D من السرطانات الخبيثة أمر حيوي بشكل خاص بسبب ارتفاع عدد السكان المسنين ووفيات السرطان. سرطان الخلايا الكبدية (HCC) هو أحد الأسباب الرئيسية للوفيات المرتبطة بالسرطان في جميع أنحاء العالم وكثيرا ما يكون له تشخيص سيئللغاية 6. من المعروف أن سرطان الكبد لديه معدل شفاء منخفض ، واستجابة ضعيفة للأدوية ، ومعدل تكرار مرتفع6،7،8. تم تطوير العديد من نماذج 3D للكبد الطبيعي وسرطان الكبد التي تحاكي فسيولوجيا أنسجة الكبد الطبيعية والخبيثة في الجسم الحي 9,10.
تتضمن بعض أنظمة 3D الحالية تراكبات سائلة ومفاعلات حيوية وهيدروجيل وسقالات وهياكل مطبوعة ثلاثية الأبعاد. توفر الأجسام الكروية المتولدة في المفاعلات الحيوية مزايا فريدة على وجه التحديد لأنها تحاكي توزيع الورم للتعرض للمغذيات وتبادل الغازات وتكاثر الخلايا / السكون11. المفاعلات الحيوية مناسبة بشكل خاص لنماذج السرطان نظرا لسهولة استخدامها ، وقابلية التوسع الكبيرة ، ونشر المغذيات ، وإمكانية الوصولإليها 11. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تسمح المفاعلات الحيوية بإجراء تجارب عالية الإنتاجية ، وقابلية أكبر للتكاثر ، وتقليل الخطأ البشري. المفاعل الحيوي المستخدم في هذه الدراسة فريد من نوعه لأنه يحاكي نظاما منخفض الجاذبية ، مما يقلل من قوى القص التخريبية المطبقة في المفاعلات الحيوية النموذجية مما يسمح باستنساخ أفضل12. تسمح الجاذبية متعددة الاتجاهات وتقليل قوى القص للخلايا بالتطور بطريقة فسيولوجية أكثر. كدليل على ذلك ، تقوم خلايا HepG2 / C3A التي تنمو وفقا لهذه المنهجية بتطوير عضيات كروية تنتج في الجسم الحي مستويات ATP وأدينيلات كيناز واليوريا والكوليسترول13,14. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العلاجات الدوائية في نظام 3D هذا أكثر تقدما وآلية مقارنة بثقافات 2D. في الثقافات 2D ، يجب أن يكون للعلاجات الدوائية في كثير من الأحيان دورة زمنية قصيرة بسبب الحاجة إلى التربسين والحفاظ على صحة الخلايا. ومع ذلك ، في حالتنا ، يمكننا إجراء علاجات دوائية طويلة الأمد للكرويات دون الحاجة إلى تعطيل بنية الخلايا وفسيولوجيتها. لذلك ، فإن التحول من ثقافات 2D إلى 3D ضروري لنمذجة أفضل للظواهر البيولوجية في الجسم الحي والمزيد من التطور العلمي.
تقدم هذه الورقة منهجية لزراعة كرويات عالية التكاثر (الشكل 1 والشكل 2) وتظهر نظاما شبه آلي لتوصيف الهياكل ثلاثية الأبعاد ظاهريا (الشكل 3). على مستوى الصورة ، نقدم معلومات حول عد وقياس مساحة الأجسام الكروية (الشكل 3). باستخدام طرق قياس الطيف الكتلي ، نوضح كيف يمكن استخدام البروتينات لتقييم وظائف بيولوجية محددة (الشكل 4). من خلال جمع وتحليل هذه البيانات ، نأمل في تحسين فهم البيولوجيا وراء أنظمة زراعة الخلايا 3D.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>2239480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1481754</td>
			<td>Luer lock tip, graduated to 12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L wide bore pipet tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14222703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L wide bore pipet tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14222730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Orochem filter plate</td>
			<td>Orochem&#160;</td>
			<td>OF1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well skirted plate</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-96-FS-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well vacuum manifold</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAVM0960R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6141-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bronchial Epithelial Cell Growth Medium (BEGM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture grade water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-055-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoReactor</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bioreactor for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoStar incubator</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>CO2 incubator for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT17205CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elplasia 24-well round bottom ultra-low attachment plate containing microwells</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>28905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT21022CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hEGF</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell vios 160i</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>51033557</td>
			<td>CO2 incubator for 2D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W5-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25015CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25025CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB Resin 30 &#181;m</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td>
			<td>High resolution mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAULA microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT3002CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerkinElmer Victor X2 multilabel microplate reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH paper</td>
			<td>Hydrion</td>
			<td>93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoetanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A260-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette gun</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z666467 (Milipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil-Pur resin</td>
			<td>MSWIL</td>
			<td>R13.AQ.003</td>
			<td>120 &#197; pore size, C18-AQ phase, 3 &#956;M bead size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V511A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator (96-well plates)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15308325</td>
			<td>Savant SPD1010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile hood</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>1375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile serological pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S-trap</td>
			<td>Protifi</td>
			<td>C02-micro-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle (18 G)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14817100</td>
			<td>3&#34; length, 0.05&#34; diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>28904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z258415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated phenotypic analysis of functional 3d spheroid cell cultures

نقدم بروتوكولا يصف خصائص ومزايا استخدام حاضنة clinostat مستقلة لزراعة ومعالجة ومراقبة ثقافات الخلايا 3D. يحاكي clinostat بيئة يمكن أن تتجمع فيها الخلايا ككرويات قابلة للتكاثر بدرجة عالية مع قوى قص منخفضة وانتشار نشط للمغذيات. لقد أثبتنا أن كلا من خلايا الكبد السرطانية وغير السرطانية (خطوط خلايا HepG2 / C3A و THLE-3) تتطلب 3 أسابيع من النمو قبل تحقيق وظائف مماثلة لخلايا الكبد. يسلط هذا البروتوكول الضوء على راحة استخدام الحاضنات لخلايا 3D مع كاميرات تراقب نمو الخلايا ، حيث يمكن التقاط لقطات لحساب وقياس الأجسام الكروية عند العلاج. وصفنا المقارنة بين خطوط خلايا THLE-3 و HepG2 / C3A ، مما يوضح كيف يمكن زراعة خطوط الخلايا غير السرطانية وكذلك الخلايا السرطانية الخالدة. نوضح ونوضح كيف يمكن إجراء تجارب البروتينات من عدد قليل من الأجسام الكروية ، والتي يمكن جمعها دون إزعاج إشارات الخلية ، أي لا يلزم التربسين. لقد أوضحنا أنه يمكن استخدام تحليل البروتينات لمراقبة النمط الظاهري النموذجي للكبد لعملية التمثيل الغذائي للسلسلة التنفسية وإنتاج البروتينات المشاركة في إزالة السموم المعدنية ووصف نظام شبه آلي لحساب وقياس منطقة الكرة الأرضية. إجمالا ، يقدم البروتوكول صندوق أدوات يشتمل على توصيف النمط الظاهري عبر التقاط الصور وخط أنابيب البروتينات لتجربة نماذج زراعة الخلايا 3D.

في هذا البروتوكول ، نصف خصائص حاضنة الخلايا ثلاثية الأبعاد المبتكرة الخالية من الإجهاد ، وهو نظام مصمم خصيصا لزراعة الأجسام الكروية ثلاثية الأبعاد (الشكل 2). قمنا بتحسين بروتوكول الزراعة ثلاثية الأبعاد لخطوط خلايا THLE-3 و HepG2 / C3A. البروتوكول الموصوف هنا سهل الاستخدام ويسمح بالتكاثر والاستزراع الفعال من حيث التكلفة لما > 100 كروي لكل مفاعل حيوي. مرة واحدة في المفاعل الحيوي ، يتم التعامل مع كرويات مماثلة للخلايا التي يتم الحفاظ عليها في ثقافة 2D. يتم تحقيق ظروف النمو المثلى من خلال تبادل الوسائط مرتين إلى ثلاث مرات في الأسبوع (الشكل 2 ب) وضبط سرعة الدوران وفقا لنمو وحجم الأجسام الكروية (الشكل 2ج). يوفر هذا النظام ، الذي يتم فيه استزراع كرويات ثلاثية الأبعاد في مفاعلات حيوية دوارة (الشكل 2E ، F) ، بيئة نمو مثالية للهياكل ثلاثية الأبعاد عن طريق تعريض كروي لكمية متساوية ومنخفضة جدا من قوة القص.
لقد أظهرنا سابقا كيف يمكن استخدام الأجسام الكروية لتحليل تعديل الكروماتين16. هنا ، نوضح بالتفصيل كيفية الحصول على كرويات الكبد وكيف يمكن إجراء تجارب البروتينات لتحليل البروتين الكامل (الشكل 1). باختصار ، بدأ البروتوكول باستخدام الخلايا المسطحة THLE-3 أو HepG2 / C3A حتى وصلت الثقافة إلى التقاء 80٪. لاستزراع الخلايا ككرويات ، تم طلاء ما يقرب من 2000 خلية في لوحة ربط منخفضة للغاية تحتوي على آبار دقيقة للسماح لها بالتجميع الذاتي ، ثم تم نقل كرويات مشكلة إلى مفاعل حيوي (الشكل 1 أ). على الرغم من أنها نشطة وظيفيا بعد 3 أسابيع في الثقافة ، كما هو موضح سابقا17 ، فإننا نعرض نتائج من كرويات تم جمعها بعد 36 يوما في الثقافة لهذا البروتوكول. بعد التجميع ، تم نسج الأجسام الكروية ، وتم تخزين كل من الحبيبات والمواد الطافية للتحليل. تم تقييم صلاحية الخلية من المادة الطافية لتحديد كمية كيناز أدينيلات المنبعثة من الخلايا التالفة ، كما هو موضح سابقا17. تم استخراج البروتينات الخلوية من حبيبات الخلية ، وتم تحليل البروتين الكامل بواسطة قياس الطيف الكتلي عالي الدقة (الشكل 1 ب).
يوضح هذا البروتوكول أيضا طريقة شبه آلية لحساب الأجسام الكروية (الشكل 3A) باستخدام برنامج معالجة الصور العامة FIJI (Fiji Is Just ImageJ)18. يجب التقاط صورة جيدة للكروية للتحليل ، ويجب مراعاة بعض المعلمات كما هو مذكور في القسم 5. ثم ، بعد إعداد الصورة للتحليل ، يتم استخدام برنامج نصي ماكرو (الملف التكميلي 1) لحساب الأجسام الكروية. يعمل الماكرو عن طريق إنشاء مجلد يسمى FIJI Spheroids counting أولا ، داخل المجلد حيث توجد الصور الكروية. في هذا المجلد ، يتم حفظ جميع المعلومات من التحليل ؛ يتضمن ذلك صورة للكرويات التي تم عدها ، مع رقم معرف على كل كروي. يتضمن أيضا ملف Excel يسمى العد الكروي. يحتوي هذا الملف على منطقة البكسل ورقم الهوية لكل كروي تم حسابه. يتم تقديم البيانات المقابلة لصورة واحدة تم تحليلها في كل علامة تبويب من الملف. يتم تسمية علامة التبويب وفقا لاسم الصورة التي تم تحليلها. نظرا لأن حجم الكرة يمكن أن يضعف بسبب العديد من العوامل ، بما في ذلك عدد الهياكل داخل الوعاء والعلاج بالعقاقير ، فمن المهم أيضا مراقبة مساحة سطحها (قياس المسطح). يعمل نص الماكرو المعروض هنا (الملف التكميلي 2) عن طريق قياس المناطق السوداء ، والتي تتوافق مع الكروية في الصورة (الشكل 3B). يتم جمع المخرجات في ملف يسمى planimetry.xlsx ، والذي يحتوي على المساحة المقاسة والمحيط وقطر كل كروية. هناك أيضا قياس يسمى Feret ، يستخدم لحساب القطر. النمس هو أطول قطر ممكن ، في حين أن minFeret هو الأقصر. القطر هو متوسط هذين. داخل مجلد الإخراج ، إلى جانب ملف .xlsx القياس ، توجد أيضا صورة للكرويات التي تم قياسها.
قبل الشروع في تحليل البروتين ، تم تقييم صلاحية الكائنات الكروية على مدار وقت الثقافة. تزداد مستويات AK حتى اليوم 17 ، لتصل إلى ما يقرب من 7٪ من موت الخلايا ، ثم تنخفض الوفيات إلى مستويات أقل من 5٪ (الشكل 4A) ، وهو ما يتوافق مع العمل المنشورسابقا 17. يوضح هذا البروتوكول أيضا تحليل البروتين الكامل لمراقبة النمط الظاهري للخلية. أولا ، تمت مقارنة البروتينات من الخلايا المسطحة THLE-3 و HepG2 / C3A والكروية. من خلال تحليل المكون الرئيسي الأول (PC1) ، من الواضح أن هناك فصلا صارما لعينات كروية من ثقافات الخلايا المسطحة ، ويبدو أن ارتباط نوع الخلية (THLE-3 و HepG2 / C3A) غير ذي صلة (الشكل 4B). على الرغم من أن الأجسام الكروية THLE-3 و HepG2 / C3A لا تتجمع معا ، إلا أنها تشترك في ملفات تعريف متشابهة تتفق مع وظائف الكبد. نوضح في هذا البروتوكول مثال الميتالوثيونين ، الذي له دور في إزالة السموم المعدنية التي يقوم بها الكبد. حددنا في تحليل البروتينات 2 أشكال متساوية يتم التعبير عنها بشكل مفرط في كرويات مقارنة بالخلايا المسطحة (MT1E و MT1X) (الشكل 4C). نعرض أيضا إثراء علم الوجود الجيني (GO) لكلا خطي الخلايا المزروعين ككرويات. عملية التمثيل الغذائي للكربوهيدرات ، والتي تشمل دورة حمض الكربوكسيل (دورة TCA) ، وسلسلة نقل الإلكترون (التنفس الخلوي) ، واستقلاب البيروفات ، هي مصطلح متكرر ويتم إثرائه في كل من الكرات HepG2 / C3A و THLE-3 (الشكل 4D ، E). إزالة السموم الخلوية والأحماض الدهنية واستقلاب الكوليسترول هي وظائف أخرى غنية في كل من الأجسام الكروية. معا ، من المعروف أن هذه الوظائف ضرورية لوظيفة الكبد.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig01.jpg"> الشكل 1: سير عمل لاستزراع الكائنات الكروية وإعداد العينة . (أ) النهج التجريبي لزراعة الخلايا 3D. تم زرع مزارع الخلايا المسطحة عند نقطة الالتقاء المرغوبة وزرعها على صفيحة بئر 24 منخفضة للغاية تحتوي على آبار دقيقة ، حيث تتجمع الخلايا ذاتيا في كرويات. بعد 24 ساعة ، تم نقل الأجسام الكروية إلى مفاعل حيوي وزراعتها حتى تصبح جاهزة للتحليل. (ب) بعد الجمع ، تم تكوير الحبيبات وتم تخزين كل من الحبيبات الطافية للاستزراع حتى المعالجة. تم استخراج الهستونات16والبروتينات غير الهستونية وهضمها في الببتيدات وتحليلها بواسطة مطياف الكتلة عالي الدقة. تم البحث في الملفات الخام التي تم الحصول عليها من قياس الطيف الكتلي مقابل قاعدة البيانات البشرية ، وتمت معالجة البيانات بشكل أكبر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig02v2.jpg"> الشكل 2: نظام زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد. أ: أجزاء المفاعل الحيوي. يتكون المفاعل الحيوي من غرفة تبادل الغازات والترطيب التي تحتوي على حبات الماء وغرفة خلية قابلة للفتح مع قابسين لتبادل الوسائط وجمع المواد الكروية. (ب) تبادل وسائط المفاعلات الأحيائية. يمتلئ المفاعل الحيوي ب 10 مل من وسائط النمو باستخدام حقنة بإبرة. (ج) تطبيق التحكم في النظام. يمكن التحكم في سرعة الدوران ومستوى CO2 ودرجة الحرارة وسجل الإنذار والوظائف الأخرى باستخدام وحدة التحكم. د: وضع المفاعل الحيوي في حاضنة 3D. يحتوي كل مفاعل حيوي على محرك مرتبط يمكنه تدوير المفاعل الحيوي ببطء. (ه) مفاعل حيوي في حركة بسرعة (rpm) يتحكم فيها قرص (C). يتم ضبط السرعة (دورة في الدقيقة) وفقا لحجم الكائنات الكروية. (F) المفاعلات الحيوية داخل حاضنة de 3D. يمكن أن تتسع حاضنة 3D لما يصل إلى 6 مفاعلات حيوية يتم التحكم فيها بشكل فردي. الصورة مقدمة من جيسون توريس للتصوير الفوتوغرافي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig02largev2.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig03.jpg"> الشكل 3: توصيف النمط الظاهري للكرويات عن طريق التقاط الصور. أ: عدد الأجسام الكروية شبه الآلية. بعد أخذ لقطات من الأجسام الكروية في المفاعل الحيوي ، يتم إعداد الصورة للتحليل في فيجي. يتم حساب كل كروي ، ويتم توفير رقم معرف لكل منهم. يتم استخدام ماكرو ، ويتم عرض النتائج التي تعرض معرف الكروي الذي تم عده ، والتسمية (اسم الصورة التي تم تحليلها) ، والمنطقة (عدد وحدات البكسل التي تم حسابها في الكروية). ب: التحديد الطوي للمنطقة الكروية. باستخدام ماكرو ، يتم تحديد مساحة ومحيط وقطر كروي معين. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig04.jpg"> الشكل 4: تحليل البروتيوم للكرويات الكبدية. (أ) حسبت صلاحية الثيرويدات على أساس إطلاق كيناز أدينيلات (AK) على طاف الثقافة. النتائج هي وسيلة لتكرار نقاط البيانات ± SD. (B) تم إجراء تحليل المكون الرئيسي (PCA) لمقارنة بروتين الخلايا المسطحة والكروية THLE-3 و HepG2 / C3A. ج: الوفرة النسبية للفلوثيونين، وهي بروتينات يعبر عنها الكبد البشري. يتم تمثيل البيانات كوسيلة ± SEM. (د) تظهر الشبكة المجمعة وظيفيا إثراء GO للكرويات HepG2 / C3A و (E) الكرويات THLE-3 ، حيث يتم عرض تسمية المصطلح الأكثر أهمية لكل مجموعة فقط. تم إنشاء الشبكة باستخدام ClueGo19. يمثل حجم العقدة مصطلح أهمية الإثراء. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الملف التكميلي 1: برنامج نصي ماكرو لحساب الكرة الأرضية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
الملف التكميلي 2: ماكرو لتحديد البلانمترية الكروية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/Supplementary%20File%202.docx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures at JoVE.com

Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures

نقدم بروتوكولا لزراعة الكرويات عالية التكرار وتوصيفها الظاهري باستخدام التقاط الصور والبروتينات.

تحليل النمط الظاهري شبه الآلي لثقافات الخلايا الكروية 3D الوظيفية

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell ...

يوضح هذا البروتوكول كيفية زراعة كرويات قابلة للتكرار بدرجة عالية ويوضح كيف يمكن إجراء تجارب بروتينية لتوصيف الوظيفة البيولوجية لهياكل 3D. يمكن لثقافة 3D الخاصة بنا أن تنتج في وقت واحد مئات النسخ البيولوجية في نفس المفاعل الحيوي ، ويمكن لنهج LC-MS قياس وفرة الآلاف من البروتينات في تجربة واحدة. ستوضح العملية ستيفاني سترانسكي ، باحثة ما بعد الدكتوراه من المختبر.للبدء ، خذ تعليق خلايا HepG2 / C3A و THLE-3. احسب عدد الخلايا وخفف تعليق الخلية في وسائط نمو كاملة للحصول على مليون خلية بحد أقصى 1.5 ملليلتر. اغسل آبار ملحق منخفض للغاية ، صفيحة سفلية مستديرة ذات 24 بئرا مع 0.5 ملليلتر من وسائط النمو وأجهزة الطرد المركزي عند 3000 جرام لمدة خمس دقائق.نقل تعليق الخلية إلى لوحة والطرد المركزي لمدة ثلاث دقائق في 120g. ثم احتضان اللوحة لبدء تكوين كروي. بعد ذلك ، قم بموازنة المفاعل الحيوي قبل 24 ساعة من نقل الأجسام الكروية عن طريق ملء غرفة الرطوبة ب 25 ملليلتر من الماء المعقم وغرفة الخلية بتسعة ملليلتر من وسائط النمو باستخدام حقنة 10 ملليلتر بإبرة طويلة.ثم ضع المفاعل الحيوي في حاضنة ثلاثية الأبعاد لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بسحب الأجسام الكروية برفق لأعلى ولأسفل باستخدام أطراف تجويف عريضة بحجم ملليلتر واحد لفصلها عن لوحة التثبيت المنخفضة للغاية ونقلها إلى طبق زراعة الأنسجة. لالتقاط أي كرويات متبقية ، اغسل الطبق ب 0.5 مل من وسائط النمو الدافئة مسبقا وانقلها إلى طبق الثقافة.باستخدام المجهر الضوئي ، قم بتقييم حجم الكرويات وانضغاطها واستدارتها لاختيار تلك التي تم تشكيلها بشكل مناسب. انقل الكروي المحدد إلى المفاعل الحيوي المتوازن المملوء بخمسة ملليلتر من وسائط النمو الطازجة. ثم املأ المفاعل الحيوي بأكمله بوسائط نمو جديدة.ضع المفاعل الحيوي في حاضنة 3D واضبط سرعة الدوران باستخدام وحدة التحكم. استبدل 10 ملليلتر من وسائط النمو القديمة ب 10 ملليلتر من الوسائط الطازجة كل يومين إلى ثلاثة أيام. قم بتغيير سرعة الدوران في كل مرة بعد استبدال الوسائط.استزرع الكرويات لمدة 15 يوما وقسمها بين مفاعلين حيويين جديدين. افتح تطبيق 3D المثبت على الجهاز اللوحي ، وحدد المفاعل الحيوي ، والتقط الصورة. كبديل ، ضع خلفية سوداء خلف المفاعل الحيوي وتأكد من عدم انعكاس الضوء على حجرة الخلية.التقط الصورة بالقرب من المفاعل الحيوي قدر الإمكان. بعد ذلك ، اجمع الأجسام الكروية عن طريق إزالة خمسة ملليلتر من الوسائط من المفاعل الحيوي باستخدام حقنة متصلة بإبرة طويلة عبر المنفذ العلوي. تأكد من نزول الأجسام الكروية إلى المركز السفلي للمفاعل الحيوي.الآن ، افتح المنفذ الأمامي واجمع الكرويات باستخدام طرف تجويف عريض بحجم ملليلتر واحد. نقل هذه المواد الكروية إلى أنابيب الطرد المركزي الصغيرة ، وأجهزة الطرد المركزي في 500g لمدة خمس دقائق ، والتخلص من وسائل الإعلام. اغسل الكرة بإضافة 200 ميكرولتر من HBSS لإزالة FBS.بعد ذلك ، قم بإجراء الطرد المركزي عند 500 جرام لمدة خمس دقائق وتخلص من المادة الطافية. بعد ذلك ، اغمر الحبيبات الكروية بسرعة في النيتروجين السائل لتجميدها وتخزين هذه الحبيبات المجمدة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى مزيد من المعالجة. لتحليل الخلايا ، خذ أنبوبا من الكرويات المجمعة وأعد تعليقها في 25 ميكرولتر من 5٪ SDS.تجانس الحبيبات عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. بعد ذلك ، قم بإذابة ميكروغرام واحد من العينات و 10 ميكرولتر من حمض ثلاثي كلورو أسيتيك 0.1٪. بعد استخراج البروتين وتنظيف العينات ، قم بإعداد طريقة اكتساب MS لتوليد أطياف MS / MS من إشارات الببتيد المحددة.بعد ذلك ، انقل اللوحة إلى جهاز أخذ العينات التلقائي للكروماتوغرافيا السائلة النانولترية. اضبط فحص MS الكامل على 300 إلى 1،100 نسبة الكتلة إلى الشحن في Orbitrap. اضبط الدقة على 120000 واضبط هدف التحكم التلقائي في الكسب على 125.بعد ذلك ، قم بتعيين MS / MS في Orbitrap مع نافذة عزل متسلسلة تبلغ 50 نسبة كتلة إلى شحنة. صوب هدف التحكم التلقائي في الكسب عند 400 وقم بتعيين طاقة تفكك تصادم أعلى للطاقة تبلغ 30. وفقا لتحليل جدوى الكائنات الكروية ، تزداد مستويات أدينيلات كيناز حتى اليوم 17 ، مما يؤدي إلى حوالي 7٪ من موت الخلايا.بعد ذلك ، ينخفض معدل الوفيات إلى أقل من 5٪ علاوة على ذلك ، يكشف تحليل المكون الرئيسي الأول عن تمييز واضح بين العينات الكروية ومزارع الخلايا المسطحة. أشار التحليل البروتيني إلى أن الأجسام الكروية THLE-3 و HepG2 / C3A لها ملامح متشابهة تعكس وظائف الكبد. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت الكائنات الكروية تعبيرا مفرطا عن شكلين متساويين من الميتالوثيونين مقارنة بالخلايا المسطحة.أظهرت الشبكات المجمعة وظيفيا إثراء أنطولوجيا الجينات لعملية التمثيل الغذائي للكربوهيدرات في مجالات HepG2 / C3A و THLE-3. لتجنب انسكاب وسائط النمو ، لا تفتح أو تغلق المنفذ الأمامي عندما تمتلئ حجرة الخلية بالكامل بالسائل. يمكن استخدام تحضير العينات وتحليلها الموصوف في هذا البروتوكول لاستكشاف بروتين زراعة الخلايا باستخدام طرق 2D و 3D ، بالإضافة إلى عينات الأنسجة.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

الطيف الكتلي والنهج القائم Luminogenic للتميز المرحلة الأولى الاستقلابية الكفاءة من<em&gt; في المختبر</em&gt; الثقافات خلية

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

الكشف والتصور من المجمعات البروتين الناجم عن الأضرار الحمض النووي في الثقافات خلية تعليق باستخدام التقريب ربط القرب

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

بيوبانينج شبه الآلي المكتبات عرض البكتيريا الببتيد تقارب كاشف اكتشاف وتحليل يعزل الناتجة

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

تشريح RPE-المشيمية والشبكية البشرية لتحليل البروتين

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

تحسين بروتوكول إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين من الماوس الهيكل العظمى والعضلات

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

دراسة عن الأيض من المبيدات الحشرية النظامية الستة في ثقافة تعليق الخلية المنشأة حديثا المستمدة من الشاي(كاميليا سينينسيس L.) يترك

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

في الوقت الحقيقي ، وشبه التلقائي قياس الفلورسنت من الدرجة الهوائية السائل سطح المجري الجوي للخلايا الاساسيه الإنسان الظهاريه

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

تحليل خلية واحدة من الأليل النشطة نسخيا بواسطة جزيء واحد FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

إنتاج البروتينات الخالية من الخلايا للتحليل الوظيفي وتطوير الأجسام المضادة التي تستهدف البروتينات الغشائية

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

تحليل توليف الدهون المحايدة في Saccharomyces cerevisiae بواسطة وضع العلامات الأيضية وكروماتوغرافيا طبقة رقيقة

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...