Name: semi-automated phenotypic analysis of functional 3d spheroid cell cultures
Uploaded: 2023-08-18T13:10:00
Duration: 6 min 48 s
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Sidoli实验室非常感谢白血病研究基金会（Hollis Brownstein New Investigator Research Grant）、AFAR（Sagol Network GerOmics 奖）、Deerfield（Xseed 奖）、Relay Therapeutics、默克公司和 NIH 主任办公室 （1S10OD030286-01）。

1. 缓冲液和试剂
<ol><li>HepG2/C3A细胞的细胞生长培养基：制备含有10%胎牛血清（FBS）、非必需氨基酸（1%v/v）、L-谷氨酰胺（1%v/v）和青霉素/链霉素（0.5%v/v）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，4.5g/L葡萄糖）。将生长培养基储存在4°C。</li>
	<li>THLE-3 细胞的细胞生长培养基：制备含有其补充剂（牛垂体提取物 [BPE]、氢化可的松、人表皮生长因子 [hEGF]、肾上腺素、转铁蛋白、胰岛素、视黄酸、三碘甲状腺原氨酸、硫酸庆大霉素-两性霉素 [GA]）以及 10% FBS、5 ng/mL hEGF 和 70 ng/mL 磷脂醇胺。</li>
	<li>500 mM DL-二硫苏糖醇 （DTT）：要制备 10 mL，将 0.771 g DTT 重悬于 10 mL HPLC 级水中。在-20°C下储存100μL等分试样。</li>
	<li>200 mM 碘乙酰胺：要制备 1 mL，将 36 mg 碘乙酰胺重悬于 1 mL 的 50 mM 碳酸氢铵中。不要储存重悬的碘乙酰胺。</li>
	<li>5% 十二烷基硫酸钠 （SDS）：要制备 50 mL，将 2.5 g SDS 重悬于 50 mL 的 50 mM 碳酸氢铵中。储存在4°C。</li>
	<li>12% 磷酸：要制备 100 mL，请在 85.9 mL HPLC 级水中稀释 14.1 mL 的 85% 磷酸。在室温 （RT） 下储存在玻璃瓶中。</li>
	<li>结合缓冲液：要制备 1 L，将 900 mL 浓甲醇加入 100 mL 10 mM 碳酸氢铵或 TEAB 中。</li>
	<li>0.1% 三氟乙酸 （TFA） 溶液：将 1 mL 浓 TFA 加入 999 mL HPLC 级水中。储存在4°C。</li>
	<li>60% 乙腈/0.1% TFA 溶液：将 600 mL HPLC 级乙腈 （60% v/v） 加入 399 mL HPLC 级水中。接下来，向该溶液中加入1mL浓TFA，然后储存在4°C。</li>
	<li>流动相A（MPA） - 0.1%甲酸：将1 mL浓甲酸加入999 mL HPLC级水中，混匀。</li>
	<li>流动相B （MPB） - 80% HPLC级乙腈+0.1%甲酸：将800 mL HPLC级乙腈加入199 mL HPLC级水中。接下来，向该溶液中加入 1 mL 浓甲酸并混合。</li>
</ol>2.球状体的制备
注： 图1A 表示从细胞系制备和培养3D球状体的初始步骤。
<ol><li>解冻冷冻的HepG2 / C3A和THLE-3细胞，并在组织培养瓶或培养皿中使用标准生长培养基将它们作为单层生长，直到它们达到约80%的汇合度。 注意：当细胞达到汇合时，使用显微镜检查一般细胞形态和生长模式。不建议使用高传代数的细胞。</li>
	<li>用 Hank 平衡盐溶液（HBSS，T75 cm2 烧瓶或 10 cm 培养皿使用 5 mL）洗涤细胞两次。</li>
	<li>加入5mL在HBSS中稀释的0.05%胰蛋白酶-EDTA（1：2稀释），并在37°C下用5%CO2孵育5分钟。使用显微镜评估细胞分离，并加入 3 mL FBS 或生长培养基（含有 10% FBS）以中和胰蛋白酶反应。</li>
	<li>将细胞悬液转移到 15 mL 试管中。在室温下以270× g 旋转5分钟。</li>
	<li>吸出上清液并将细胞重悬于5mL完全生长培养基中。 注意：如果细胞过多，请在计数前稀释细胞悬液。</li>
	<li>计数细胞数并在完全生长培养基中稀释细胞悬液，以获得最大体积为 1.5 mL 的 1 x 106 。</li>
	<li>平衡含有微孔的超低附着力 24 孔圆形底板。<ol><li>用 0.5 mL 生长培养基洗涤孔。</li>
		<li>将板以3,000× g 离心5分钟（这从孔表面去除气泡）。</li>
	</ol></li>
	<li>将细胞悬液（在步骤1.4中制备）转移到板中，并以120× g离心3分钟。 注意：细胞悬液体积可能因细胞计数而异，但重要的是将其限制在 1.5 mL。</li>
	<li>将板在37°C下用5%CO2 孵育24小时，开始球状体形成。</li>
</ol>3. 将球状体培养到生物反应器中 （图2）
注意： 为了保留椭球体的结构，在处理 3D 球体时使用宽孔尖端。
<ol><li>在将球状体转移到其中之前，通过用25mL无菌水填充湿度室和用9mL生长培养基填充细胞室24小时来平衡生物反应器（图2A）。在填充湿度和细胞室时，请务必使用与长针头相连的 10 mL 注射器。</li>
	<li>将生物反应器在3D培养箱（图2D，F）中旋转（15rpm）在37°C下用5%CO2孵育24小时。</li>
	<li>使用 1 mL 宽口径吸头，轻轻上下移液，将球体从超低附着板上分离，并将球体转移到组织培养皿中。</li>
	<li>用 0.5 mL 预热的生长培养基洗涤超低附着板以捕获剩余的球体并将它们转移到步骤 3.3 中的同一培养皿中。</li>
	<li>使用光学显微镜（4倍放大倍率）评估球体的大小、致密度和圆度，并选择充分成型的球体。 注意：细胞在致密时充分形成，并且在处理过程中不会散开。同样重要的是，球体是一个单一的单元，而不是聚集在一起。转移到生物反应器时，球状体尺寸在 100-200 μm 之间是优选的。</li>
	<li>将球状体转移到装有 5 mL 新鲜生长培养基的平衡生物反应器中。转移球状体后，用新鲜的生长培养基完全填充生物反应器，并在填充培养基时确保避免向生物反应器添加气泡。</li>
	<li>将生物反应器置于3D培养箱中，并使用控制单元调节旋转速度（图2C）。对于HepG2 / C3A球体，将转速设置为10-11 rpm;对于 THLE-3 球体，将其设置为 11-12 rpm。 注意：当球体均匀分布在生物反应器的中心且不接触其壁时，旋转速度设置正确。 图2E显示了一个旋转的生物反应器。</li>
	<li>每 2-3 天更换一次生长培养基，取出 10 mL 旧培养基并用 10 mL 新鲜培养基代替;更换培养基时，确保不要去除球状体（图2B）。 注意：建议进行例行的媒体交换（例如，48 小时/48 小时/72 小时）并保留详细记录。</li>
	<li>每次更换媒体时调整旋转速度。随着球体尺寸和数量的增加而提高速度。</li>
	<li>培养 15 天后，将球状体分成两个新的生物反应器。 注：根据细胞系和生长速率，时间可能会有所不同，应单独优化。</li>
	<li>20 天后，球状体就可以收集了。</li>
</ol>4. 球体的图像采集和计数
注：球状体计数的简化流程如图 3A所示。对于椭球体计数和面积测定（第 5 节），评估 3D 结构的致密性至关重要。这将有助于更增强颜色对比度，这对于方法的准确性是必要的。
<ol><li>打开平板电脑上安装的 3D 应用程序。</li>
	<li>选择生物反应器并拍摄快照。 注意： 或者，可以拍照。应考虑以下参数。<ol><li>在生物反应器后面放置黑色背景（生物反应器盒中提供黑色支撑）。</li>
		<li>确保细胞室上没有光反射。</li>
		<li>将照片拍摄得尽可能靠近生物反应器。</li>
	</ol></li>
	<li>在斐济中打开一张图片（ImageJ）。</li>
	<li>准备要分析的图片：<ol><li>选择 椭圆 工具。在插头周围画一个圆圈。</li>
		<li>单击键盘上的 “删除 ”，将圆圈内的所有内容设置为黑色。在细胞室周围画一个圆圈。确保所有球体都在圆圈内。</li>
	</ol></li>
	<li>运行宏以计算椭球体：<ol><li>单击 Plugins > Macro > Record。将宏文本从 补充文件 1 复制到记录器中。</li>
		<li>按 “创建”，将打开一个新窗口。按 “运行 ”分析打开的图片。</li>
		<li>将打开一个新窗口，其中包含结果（计数、总面积、平均大小和面积百分比）。</li>
	</ol></li>
	<li>关闭图像，然后对需要球状体计数的每个图像重复步骤 4.4 和 4.5。为了更轻松、更快速地进行处理，请保存宏并通过单击“ 插件”>“宏”>“运行 ”来运行它，然后选择保存的宏。</li>
</ol>5. 球体面积的平面测定
注：用于确定椭球体面积的简化管道如图 3B 所示。
<ol><li>按照步骤 3.5 中的说明拍摄图像。</li>
	<li>在开始之前，设置一个全局比例来测量椭球体的面积。<ol><li>在斐济打开一张带有所需放大倍率比例尺的图片。选择线条工具。在比例尺上绘制（线条需要与比例尺一样长）。</li>
		<li>打开 “分析”>“设置比例”。 写下已知距离（线的长度会自动输入到 “距离”（以像素为单位）中。 确保勾选 “全局”。</li>
		<li>按 OK。现在，为将要分析的图片设置了比例。</li>
	</ol></li>
	<li>要开始平面测定，请运行宏（补充文件 2）。<ol><li>单击“ 处理”>“批处理>宏”。 选择包含要分析的图片的文件夹。此文件夹将是 Input。</li>
		<li>选择在步骤 5.3.1 中创建的文件夹作为 输出。 按 处理。</li>
	</ol></li>
	<li>作为质量检查，评估测量的椭球体面积是否与原始图像相对应。 注意： 宏不包括边缘上的球体，其中只能测量部分球体。</li>
</ol>6. 球状体的收集
注意：强烈建议使用宽孔尖端收集球体以保持其 3D 结构。可以使用生物反应器前部的塞子进行收集（图2A）。
收集时球状体的大小可能因细胞系、起始细胞数和分裂过程（培养天数、每个生物反应器球状体数量和分裂率）而异。
<ol><li>为了收集球状体，使用连接到长针的注射器通过顶部端口从生物反应器中取出 5 mL 培养基。确保让球体沉入生物反应器的底部中心（靠近底部端口）。</li>
	<li>打开前端口并使用 1 mL 宽孔尖端收集球状体。将球状体放入微量离心管中。将球状体以500× g 离心5分钟并丢弃培养基。</li>
	<li>用 200 μL HBSS 洗涤球状体以除去 FBS。以500× g 离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用液氮快速冷冻球状体颗粒，并储存在-80°C直至处理。</li>
</ol>7. 球状体的活力
注：通过测量受损细胞释放的腺苷酸激酶（AK）的活性来确定球状体活力（图4A）。由于扩散梯度，当球体直径小于 900 μm 时，AK 测量是有效的12.如果球体变大，或者对活力测量有任何疑问，则可以进行ATP测定15。
<ol><li>收集球状体上清液并将 20 μL 转移到 96 孔白壁板（平底透明）中。向每个孔中加入 100 μL 腺苷酸激酶检测试剂，并通过轻轻上下移液来匀浆。</li>
	<li>通过在室温下在速度真空中离心2分钟来除去气泡，在室温下孵育板20分钟。</li>
	<li>将板放入光度计（酶标仪，发光模式）并启动程序。根据套件制造商的说明设置参数。 注：在生物发光活力测定中，直接光度计光输出（通常为RLU）可用于计算细胞反应。由于腺苷酸激酶只会从细胞完整性受损的细胞中泄漏，因此可以使用裂解试剂实现总腺苷酸激酶控制。</li>
</ol>8. 蛋白质提取
注： 图1B 表示球状体处理和蛋白质提取的工作流程。
<ol><li>在第 36 天收集球状体（第 6 节）。将球状体重悬于 25 μL 的 5% SDS 中以裂解细胞。<ol><li>加入5%SDS后，通过上下移液使沉淀均质化。在某些情况下，当难以裂解球体时，请使用小杵。</li>
	</ol></li>
	<li>将样品与20mM DTT孵育1小时以减少蛋白质。通过上下移液进行混合。</li>
	<li>将样品与 40 mM 碘乙酰胺孵育 30 分钟，避免光照至烷基化蛋白。通过上下移液进行混合。</li>
	<li>向样品中加入12%磷酸溶液（10x），终浓度为1.2%。</li>
	<li>在六体积的结合缓冲液中稀释样品并轻轻混合。</li>
	<li>将样品加载到 S-Trap 滤板上，并以 500 x g 旋转 30 秒。 注意：如果步骤8.4中样品的总体积超过色谱柱体积容量，则分批加载样品并重复步骤8.6，直到所有样品都通过色谱柱。</li>
	<li>用 150 μL 结合缓冲液洗涤样品两次。每次洗涤后，以500 ×g 旋转30秒并丢弃流出物。</li>
	<li>将样品与在50mM碳酸氢铵中稀释的1μg测序级胰蛋白酶在37°C下孵育过夜。 注：建议至少 20 μg 蛋白质作为全面蛋白质组分析的起始材料。为此，1μg胰蛋白酶是有效消化的理想量。去除缓冲液和柱床之间的任何气泡。</li>
	<li>用 40 μL 50 mM 碳酸氢铵洗脱肽并汇集到同一收集管中。</li>
	<li>以500 ×g 旋转30秒。用 40 μL 0.1% TFA 洗脱肽，并将它们汇集到同一个收集管中。</li>
	<li>以500 ×g 旋转30秒。用 40 μL 60% 乙腈和 0.1% TFA 洗脱肽，并将它们汇集到同一个收集管中。</li>
	<li>以500 ×g 旋转30秒。干燥的混合洗脱液在速度真空中，并将样品储存在-80°C直至处理。</li>
</ol>9. 样品净化
注意：在进行蛋白质组学分析之前，有必要去除样品中存在的盐。盐在电喷雾过程中电离，会干扰高效液相色谱-质谱 （HPLC-MS） 分析，从而抑制肽的信号。Joseph-Chowdhury及其同事先前演示了本研究中使用的脱盐设置16。
<ol><li>在开始之前，确保有一个干净的 96 孔收集板来收集以下步骤中的流过物。在磁力搅拌板上混合 C18 树脂（50 mg/mL 的 100% 乙腈溶液）。</li>
	<li>在 96 孔滤板的每孔中加入 70 μL 的 C18 树脂悬浮液，迅速添加以确保 C18 树脂不会在移液器底部积聚。</li>
	<li>轻轻打开真空吸尘器以防止飞溅。丢弃在96孔收集板上收集的流出物。</li>
	<li>用 100 μL 0.1% TFA 洗涤树脂。轻轻打开真空吸尘器以防止飞溅和混合样品并丢弃流过。</li>
	<li>将每个样品重悬于100μL的0.1%TFA中。检查并确保pH值在2-3之间。</li>
	<li>将每个样品加载到滤板的每个孔中。轻轻打开真空吸尘器以防止飞溅和混合样品并丢弃流过。</li>
	<li>用 100 μL 0.1% TFA 洗涤。轻轻打开真空吸尘器以防止飞溅和混合样品。丢弃流过。</li>
	<li>用新的 96 孔板替换 96 孔收集板以收集脱盐样品。</li>
	<li>每孔加入 60 μL 乙腈/0.1% TFA。要从 C18 树脂中洗脱样品，请轻轻打开真空以防止飞溅。</li>
	<li>收集流出物并在室温下在快速真空中干燥。 进行LC-MS / MS或将板储存在-80°C，直到准备好处理样品。</li>
</ol>10. 液相色谱联用质谱法进行蛋白质组学分析
注：为了生成本手稿的数据，使用了具有两柱系统设置的nLC-MS/MS系统，其中300 μm ID x 0.5 cm C18捕获柱和75 μm ID x 25 cm C18-AQ （3 μm）分析纳米柱在内部填充。
<ol><li>准备在HPLC上运行的流动相： 流动相A（MPA）：0.1%甲酸的HPLC级水溶液 流动相B（MPB）：0.1%甲酸的HPLC级乙腈溶液</li>
	<li>对HPLC方法进行如下编程：在120分钟内4%-34%MPB，在5分钟内34%-90%MPB，在5分钟内等度90%MPB;流速：300 nL/min。</li>
	<li>设置MS采集方法以执行数据非依赖性采集（DIA），以生成检测到的肽信号的MS/MS谱图。</li>
	<li>在将样品放入nLC自动进样器之前，将1μg样品重悬于10μL 0.1%TFA中。</li>
	<li>按照编程运行nLC-MS方法，进行经典蛋白质组学采集：<ol><li>在 Orbitrap 中将全 MS 扫描设置为 300-1100 m/z，分辨率为 120,000（200 m/z 时），自动增益控制 （AGC） 目标为 125。</li>
		<li>将MS / MS设置在轨道上，顺序隔离窗口为50 m / z，AGC目标为400，高能碰撞解离（HCD）能量为30。</li>
	</ol></li>
</ol>11. 数据分析
<ol><li>将nLC-MS/MS原始数据文件导入到与所用MS平台兼容的峰检测软件中。</li>
	<li>选择适当的数据库（人、鼠标等）。</li>
	<li>将N-末端乙酰化设置为可变修饰，将氨基甲酰甲基半胱氨酸设置为固定修饰。</li>
	<li>指定胰蛋白酶为消化酶，允许两次漏切。</li>
	<li>根据用于光谱采集的质量分析仪设置质量公差。</li>
	<li>将分析导出为电子表格，并根据需要进一步处理数据。</li>
</ol>

<ol>
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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=After+trypsinisation,+3D+spheroids+of+C3A+hepatocytes+need+18+days+to+re-establish+similar+levels+of+key+physiological+functions+to+those+seen+in+the+liver.">After trypsinisation, 3D spheroids of C3A hepatocytes need 18 days to re-establish similar levels of key physiological functions to those seen in the liver.</a> Toxicology Research. 2, 123-135 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Bindea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClueGO:+a+Cytoscape+plug-in+to+decipher+functionally+grouped+gene+ontology+and+pathway+annotation+networks.">ClueGO: a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks.</a> Bioinformatics. 25 (8), 1091-1093 (2009).</li><li>Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenomics:+The+next+challenge.">Phenomics: The next challenge.</a> Nature Reviews. Genetics. 11 (12), 855-866 (2010).</li><li>Gonneaud, A., Asselin, C., Boudreau, F., Boisvert, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+organoids+by+proteomics.">Phenotypic analysis of organoids by proteomics.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li><li>Avelino, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics+of+3D+cell+culture:+A+useful+tool+to+validate+culture+of+spheroids+and+organoids.">Mass spectrometry-based proteomics of 3D cell culture: A useful tool to validate culture of spheroids and organoids.</a> SLAS Discovery. 27 (3), 167-174 (2022).</li><li>Chiang, J., McManus, L. M., MitchellIn, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liver physiology: Metabolism and Detoxification. Pathobiology of Human Disease. , 1770-1782 (2014).</li><li>Begriche, K., Massart, J., Robin, M. A., Borgne-Sanchez, A., Fromenty, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-induced+toxicity+on+mitochondria+and+lipid+metabolism:+Mechanistic+diversity+and+deleterious+consequences+for+the+liver.">Drug-induced toxicity on mitochondria and lipid metabolism: Mechanistic diversity and deleterious consequences for the liver.</a> Journal of Hepatology. 54 (4), 773-794 (2011).</li><li>Fey, S. J., Korzeniowska, B., Wrzesinski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+to+and+recovery+from+treatment+in+human+liver-mimetic+clinostat+spheroids:+a+model+for+assessing+repeated-dose+drug+toxicity.">Response to and recovery from treatment in human liver-mimetic clinostat spheroids: a model for assessing repeated-dose drug toxicity.</a> Toxicology Research. 9 (4), 379-389 (2020).</li><li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+image+analysis+software+tools+for+exploring+and+understanding+big+image+data+from+cell-based+assays.">Phenotypic image analysis software tools for exploring and understanding big image data from cell-based assays.</a> Cell Systems. 6 (6), 636-653 (2018).</li></ol>

Helle Sedighi Frandsen 受雇于 ClinoStar 系统的生产商 CelVivo ApS 担任研究科学家。卡罗琳·米克尔森（Karoline Mikkelsen）是受雇于CelVivo ApS的工业博士生，并在丹麦欧登塞的SDU进行博士研究。所有其他作者都没有相互竞争的经济利益。

了解三维（3D）细胞结构背后的生物学特性对于更全面地了解其功能极为重要。人们越来越关注使用3D模型来研究复杂的生物学和进行毒性筛选。在3D中培养细胞时，需要考虑许多因素，包括模型系统的表型评估。表型被定义为特定生物体的一组可观察到的特征，例如形态、行为、生理和生化特性20。
在该协议中，我们演示了如何从几个球状体进行蛋白质组学实验，并可用于监测典型的肝脏表型。质谱法已成为一种广泛应用的 3D 细胞表征方法，可以研究各种生物学问题 12、16、21、22。对于全面的蛋白质组分析，建议使用至少 20 μg 蛋白质起始材料，从中将 1 μg 注入质谱仪。值得一提的是，添加较少的样品可能会导致灵敏度下降，而添加更多样品会逐渐降低色谱质量并最终导致色谱柱堵塞。在这项研究中，我们发现 HepG2/C3A 和 THLE-3 球状体富含来自糖酵解和 TCA 循环的重要蛋白质，这些蛋白质是特定的肝脏通路，对维持血糖水平和能量产生至关重要23,24。实际上，质谱分析不仅可以提供蛋白质水平的信息，还可以研究蛋白质翻译后修饰，如我们小组16 之前所示。
3D 表型研究中要考虑的另一个方面是球状体的数量和大小。除了使实验更具可重复性外，计算球状体的数量并确定其大小对于确定何时将培养物分成多个生物反应器至关重要，因为容器内 3D 结构的数量会影响球状体的大小和代谢活性水平。然而，需要强调的是，球状体的数量和大小取决于细胞系、起始细胞数、分裂过程和收集时间。HepG2/C3A 球状体培养的详细信息，例如每个球状体的细胞数、蛋白质含量和大小随年龄的变化，由 Fey、Korzeniowska 和 Wrzesinski25 提供。为了使用此处描述的半自动方法进行准确和成功的分析，最关键的步骤是获得良好的球状体图像。为简单起见，可以用手机或平板电脑拍摄照片，但其分辨率应尽可能高。由于图像可以快速获取，因此可以进行大规模筛选实验，以可视化特定的表型特征或研究对药物治疗的反应。因此，由于基于细胞的检测数量不断增加，在过去 10 年中已经开发了许多用于图像分析的开源软件26。在该协议中，我们描述了一个使用FIJI18 软件来计数和测量球体大小的半自动系统。我们提供了脚本（简单的编程命令）来定义一系列可应用于图像集合的算法操作，使分析成为一个简单快捷的过程。但是，根据球体的特性，应采用手动测量。例如，如果球体太透明，斐济文字将不精确。顺便说一句，这种方法起作用的最重要标准之一是球体的致密性。这一特性将有助于增强球体和背景之间的颜色对比度，这对于方法的准确性是必要的。
总之，除了提出一种生长高可重复球体的方法外，还描述了一种通过图像捕获和蛋白质组学进行表型表征的半自动化系统。我们预计，通过全自动图像分析软件和下一代质谱仪，这个用于分析3D细胞的工具箱将变得更加强大。

体外细胞培养已被证明是建立生物学基础知识的必要和无价之宝。生物学和癌症的大部分科学知识都来自2D培养系统，即在单层中生长的细胞。尽管 2D 培养一直是主要的细胞培养系统，但它有许多缺点，可能会扼杀进一步的生物学进展。例如，2D 培养物缺乏对细胞信号转导和增殖很重要的细胞间相互作用1。迄今为止，3D 培养系统已被证明可以更好地模拟分化、药物反应、肿瘤侵袭和生物学 2,3,4,5。由于人口老龄化和癌症死亡率的增加，恶性癌症的 3D 建模尤为重要。肝细胞癌 （HCC） 是全球癌症相关死亡的主要原因之一，并且通常预后不佳6.已知肝细胞癌治愈率低、药物反应差、复发率高 6,7,8。已经开发了几种正常肝脏和肝细胞癌的 3D 模型，模拟体内正常和恶性肝组织的生理学 9,10。
目前的一些 3D 系统包括液体覆盖层、生物反应器、水凝胶、支架和 3D 打印结构。在生物反应器中产生的球状体特别具有独特的优势，因为它们模拟营养暴露、气体交换和细胞增殖/静止的肿瘤分布11。生物反应器因其易用性、大可扩展性、营养扩散性和可及性而特别适用于癌症模型11。此外，生物反应器可以进行高通量实验，提高可重复性，并减少人为错误。本研究中使用的生物反应器是独一无二的，因为它模拟了一个降低重力的系统，该系统最大限度地减少了典型生物反应器中施加的破坏性剪切力，从而实现了更好的重现性12。全向重力和剪切力的减少使细胞以更生理的方式发育。作为证据，在这种方法下生长的HepG2 / C3A细胞发育出球形细胞器，可产生体内水平的ATP，腺苷酸激酶，尿素和胆固醇13,14。此外，与 2D 培养相比，该 3D 系统中的药物治疗更先进、自动化。在 2D 培养中，由于需要胰蛋白酶消化和维持细胞健康，药物治疗通常必须具有较短的疗程。然而，在我们的案例中，我们可以对球状体进行长期药物治疗，而无需破坏细胞的结构和生理学。因此，从2D培养到3D培养的转变对于更好地模拟体内生物现象和进一步的科学发展是必要的。
本文介绍了一种生长高可重复球体的方法（图 1 和图 2），并展示了一种表型表征 3D 结构的半自动化系统（图 3）。在图像层面，我们提供了有关计数和测量球体面积的信息（图3）。通过使用质谱方法，我们展示了蛋白质组学如何用于评估特定的生物学功能（图4）。通过收集和分析这些数据，我们希望提高对3D细胞培养系统背后的生物学的理解。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>2239480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1481754</td>
			<td>Luer lock tip, graduated to 12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L wide bore pipet tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14222703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L wide bore pipet tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14222730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Orochem filter plate</td>
			<td>Orochem&#160;</td>
			<td>OF1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well skirted plate</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-96-FS-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well vacuum manifold</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAVM0960R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6141-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bronchial Epithelial Cell Growth Medium (BEGM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture grade water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-055-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoReactor</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bioreactor for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoStar incubator</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>CO2 incubator for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT17205CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elplasia 24-well round bottom ultra-low attachment plate containing microwells</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>28905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT21022CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hEGF</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell vios 160i</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>51033557</td>
			<td>CO2 incubator for 2D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W5-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25015CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25025CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB Resin 30 &#181;m</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td>
			<td>High resolution mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAULA microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT3002CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerkinElmer Victor X2 multilabel microplate reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH paper</td>
			<td>Hydrion</td>
			<td>93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoetanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A260-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette gun</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z666467 (Milipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil-Pur resin</td>
			<td>MSWIL</td>
			<td>R13.AQ.003</td>
			<td>120 &#197; pore size, C18-AQ phase, 3 &#956;M bead size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V511A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator (96-well plates)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15308325</td>
			<td>Savant SPD1010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile hood</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>1375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile serological pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S-trap</td>
			<td>Protifi</td>
			<td>C02-micro-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle (18 G)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14817100</td>
			<td>3&#34; length, 0.05&#34; diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>28904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z258415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated phenotypic analysis of functional 3d spheroid cell cultures

我们提出了一种方案，描述了使用独立的恒斜培养箱进行生长、处理和监测 3D 细胞培养物的特性和优势。恒斜器模拟了一种环境，在这种环境中，细胞可以组装成具有低剪切力和活性营养扩散的高度可重复的球状体。我们证明，癌症和非癌症肝细胞（HepG2/C3A 和 THLE-3 细胞系）都需要 3 周的生长才能达到与肝细胞相当的功能。该协议强调了使用带有摄像头监测细胞生长的3D细胞培养箱的便利性，因为可以拍摄快照以在治疗时计数和测量球状体。我们描述了 THLE-3 和 HepG2/C3A 细胞系的比较，展示了非癌细胞系如何生长以及永生化癌细胞。我们演示并说明了如何从几个球状体中进行蛋白质组学实验，这些球状体可以在不干扰细胞信号传导的情况下收集，即不需要胰蛋白酶消化。我们表明，蛋白质组学分析可用于监测呼吸链代谢的典型肝脏表型和参与金属解毒的蛋白质的产生，并描述了一种半自动系统来计数和测量球状体的面积。总而言之，该协议提供了一个工具箱，其中包括通过图像捕获进行的表型表征和用于在 3D 细胞培养模型上进行实验的蛋白质组学管道。

在该协议中，我们描述了创新的无应力3D细胞培养箱的特性，该系统专为培养3D球状体而设计（图2）。我们优化了 THLE-3 和 HepG2/C3A 细胞系的 3D 培养方案。这里描述的方案使用简单，允许每个生物反应器>100个球体的可重复性和具有成本效益的培养。一旦进入生物反应器，球状体的处理方式与在2D培养中维持的细胞类似。通过每周更换培养基两到三次（图2B）并根据球体的生长和大小调整旋转速度（图2C）来实现最佳生长条件。该系统在旋转生物反应器中培养 3D 球体（图 2E、F），通过将球体暴露在相等且非常低的剪切力下，为 3D 结构提供最佳生长环境。
我们之前已经展示了如何使用球状体来分析染色质修饰16。在这里，我们详细演示了如何获得肝球体以及如何进行蛋白质组学实验以分析完整的蛋白质组（图1）。简而言之，该方案通过使用THLE-3或HepG2 / C3A扁平细胞开始，直到培养达到80%汇合。为了将细胞培养为球状体，将大约 2,000 个细胞接种在含有微孔的超低附着板中以使其自我聚集，然后将形成的球状体转移到生物反应器中（图 1A）。尽管它们在培养 3 周后具有功能活性，如前所述17，但我们显示了该方案培养 36 天后收集的球状体的结果。收集后，将球状体旋转下来，并储存沉淀和上清液以供分析。如前所述，从上清液中评估细胞活力，以定量受损细胞释放的腺苷酸激酶17。从细胞沉淀中提取细胞蛋白，并通过高分辨率质谱分析完整的蛋白质组（图1B）。
该协议还演示了一种使用公共图像处理程序FIJI（Fiji Is Just ImageJ）18进行球状体计数的半自动方法（图3A）。应拍摄球状体的高质量图像进行分析，并应考虑第 5 节中提到的一些参数。然后，在准备用于分析的图片后，使用宏脚本（补充文件1）对球体进行计数。该宏的工作原理是首先在椭球体图片所在的文件夹中创建一个名为 FIJI Spheroids counting 的文件夹。在此文件夹中，保存了分析中的所有信息;这包括计数的球体图片，每个球体上都有一个 ID 号。它还包括一个名为球体计数的 Excel 文件。此文件包含计数的每个椭球体的像素面积和 ID 号。与一张分析图片对应的数据显示在文件的每个选项卡中。该选项卡根据所分析图片的名称进行标记。由于球体大小可能受到许多因素的影响，包括血管内结构的数量和药物治疗，因此监测其表面积（平面测量）也很重要。此处介绍的宏脚本（补充文件2）通过测量黑色区域来工作，这些区域对应于图片中的椭球体（图3B）。输出收集在名为 planimetry.xlsx 的文件中，其中包含每个椭球体的测量面积、周长和直径。还有一种称为 Feret 的测量方法，用于计算直径。Feret 是最长的直径，而 minFeret 是最短的。直径是这两者的平均值。在输出文件夹中，除了平面测量.xlsx文件外，还有一张测量的椭球体的图片。
在进行蛋白质组分析之前，在培养时间内评估球状体的活力。AK水平升高至第17天，达到细胞死亡的约7%，然后死亡降至5%以下（图4A），这与先前发表的工作17一致。该协议还显示了用于监测细胞表型的完整蛋白质组分析。首先，比较了THLE-3和HepG2/C3A扁平细胞和球状体的蛋白质组;通过分析第一主成分（PC1），可以明显看出球状体样品与扁平细胞培养物有严格的分离，并且细胞类型（THLE-3和HepG2 / C3A）的相关性似乎无关紧要（图4B）。虽然 THLE-3 和 HepG2/C3A 球状体不会聚集在一起，但它们具有与肝功能一致的相似特征。我们在该协议中展示了金属硫蛋白的例子，金属硫蛋白在肝脏进行的金属解毒中起作用。我们在蛋白质组学分析中鉴定出与扁平细胞（MT1E和MT1X）相比，球状体中过表达的2种亚型（图4C）。我们还展示了作为球状体生长的两种细胞系的基因本体 （GO） 富集。碳水化合物代谢过程包括三羧酸循环（TCA循环）、电子传递链（细胞呼吸）和丙酮酸代谢，是一个常用术语，在HepG2 / C3A和THLE-3球体中都富含（图4D，E）。细胞解毒、脂肪酸和胆固醇代谢是两个球体中富含的其他功能。众所周知，这些功能对肝功能至关重要。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig01.jpg"> 图 1：球状体培养和样品制备的工作流程 。 （A）3D细胞培养实验方法。将所需汇合度的扁平细胞培养物胰蛋白酶消化并接种在含有微孔的超低附着 24 孔板上，细胞在其中自组装成球状体。24小时后，将球状体转移到生物反应器中并培养，直到它们准备好进行分析。（B） 收集后，将球状体沉淀，沉淀和培养物上清液均储存直至处理。提取组蛋白16和非组蛋白，消化成肽，通过高分辨率质谱分析。从质谱法中获得的原始文件与人类数据库进行搜索，并对数据进行进一步处理。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig01large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig02v2.jpg"> 图 2：3D 细胞培养系统 。 （A） 生物反应器部件。生物反应器由一个包含水珠的气体交换和加湿室和一个带有两个塞子的可打开细胞室组成，用于培养基交换和球状体收集。（B）生物反应器介质交换。使用带针头的注射器填充生物反应器中 10 mL 生长培养基。（C） 系统控制应用程序。转速、CO2 水平、温度、报警日志和其他功能可以使用控制单元进行控制。（D） 将生物反应器置于 3D 培养箱中。每个生物反应器都有一个相关的电机，可以缓慢地旋转生物反应器。（E） 生物反应器以 （C） 片剂控制的速度 （rpm） 运动。速度 （rpm） 根据球体的大小进行调整。（F） 3D培养箱内的生物反应器。3D 培养箱最多可容纳 6 个独立控制的生物反应器。照片由 Jason Torres Photography 提供。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig02largev2.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig03.jpg"> 图 3：通过图像捕获对球状体进行表型表征 。 （A） 半自动球状体计数。在生物反应器中拍摄球状体的快照后，准备图像以供在斐济进行分析。对每个球体进行计数，并为每个球体提供一个 ID 号。使用宏，并显示结果，显示计数椭球体的 ID、标签（分析的图片名称）和面积（椭球体中计数的像素数）。（B）球状体面积的平面测定。使用宏，可以确定特定椭球体的面积、周长和直径。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig03large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig04.jpg"> 图 4：肝球体的蛋白质组分析。 （A） 根据培养物上清液上腺苷酸激酶 （AK） 的释放来计算球状体的活力。±（B）主成分分析（PCA）比较THLE-3和HepG2/C3A扁平细胞和球体的蛋白质组。（C）金属硫蛋白的相对丰度，金属硫蛋白是由人类肝脏表达的蛋白质。数据表示为SEM±均值。 （D） 功能分组网络显示 HepG2/C3A 球状体和 （E） THLE-3 球状体的 GO 富集，其中仅显示每组最高有效项的标签。该网络是使用 ClueGo19 构建的。节点大小表示术语扩充意义。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig04large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
补充文件 1：用于椭球体计数的宏脚本。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">请点击这里下载此文件。</a>
补充文件 2：用于椭球平面测定的宏。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/Supplementary%20File%202.docx" target="_blank">请点击这里下载此文件。</a>

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Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures

我们提出了一种使用图像捕获和蛋白质组学培养高可重复球体及其表型表征的方案。

功能性 3D 球状体细胞培养物的半自动表型分析

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell ...

该协议演示了如何生长高度可重复的球状体，并展示了如何进行蛋白质组学实验以表征3D结构的生物学功能。我们的 3D 培养物可以在同一生物反应器中同时产生数百个生物重复，而 LC-MS 方法可以在单个实验中测量数千种蛋白质的丰度。演示该程序的是来自实验室的博士后斯蒂芬妮·斯特兰斯基（Stephanie Stransky）。首先，服用HepG2 / C3A和THLE-3细胞的悬浮液。计数细胞数量并在完全生长培养基中稀释细胞悬液，以获得最大体积为1.5毫升的100万个细胞。用0.5毫升生长培养基洗涤超低附着点24孔圆底板的孔，并以3， 000g离心5分钟。将细胞悬液转移到平板上，并以 120g 离心 3 分钟。然后，孵育板以启动球状体形成。接下来，在转移球体之前 24 小时平衡生物反应器，方法是使用带有长针的 10 毫升注射器向湿度室中填充 25 毫升无菌水，用 9 毫升生长培养基填充细胞室。然后，将生物反应器放入 37 摄氏度的 3D 培养箱中 24 小时，加入 5% 二氧化碳。使用一毫升宽孔吸头轻轻地上下移液球体，将它们从超低连接板上拆下，然后转移到组织培养皿中。为了捕获任何剩余的球状体，用0.5毫升预热的生长培养基洗涤板并将它们转移到培养皿中。使用光学显微镜，评估球体的大小、致密度和圆度，以选择充分形成的球体。将选定的球状体转移到装有 5 毫升新鲜生长培养基的平衡生物反应器中。然后，用新鲜的生长培养基填充整个生物反应器。将生物反应器放置在 3D 培养箱中，并使用控制单元调整转速。每两到三天用 10 毫升新鲜培养基替换 10 毫升旧的生长培养基。每次更换介质后更改转速。将球状体培养 15 天，并将它们分装在两个新鲜的生物反应器中。打开安装在平板电脑上的 3D 应用程序，选择生物反应器，然后捕获图像。作为替代方案，在生物反应器后面放置黑色背景，并确保没有光线反射到细胞室上。尽可能靠近生物反应器捕获图像。然后，通过使用连接到长针的注射器通过顶部端口从生物反应器中取出五毫升培养基来收集球状体。确保球体下降到生物反应器的底部中心。现在，打开前端口并使用一毫升宽的孔尖端收集球体。将这些球体转移到微量离心管中，以 500g 离心 5 分钟，然后处理培养基。通过加入 200 微升 HBSS 以除去 FBS 来洗涤球状体。之后，以500g离心5分钟，弃去上清液。然后，将球状颗粒快速浸入液氮中冷冻，并将冷冻颗粒储存在零下 80 摄氏度直至进一步加工。为了裂解细胞，取一管收集的球状体并将它们重悬于25微升的5%SDS中。通过上下移液使沉淀均质化。接下来，溶解 1 微克样品和 10 微升 0.1% 三氯乙酸。提取蛋白质并清洁样品后，设置MS采集方法，从鉴定的肽信号中生成MS/MS谱图。然后，将板转移到纳升液相色谱自动进样器中。在 Orbitrap 中将完整的 MS 扫描设置为 300 比 1， 100 质荷比。将分辨率调整为120000，并将自动增益控制目标设置为125。然后，在 Orbitrap 中设置 MS/MS，顺序隔离窗口为 50 质荷比。将自动增益控制目标瞄准 400，并将更高的能量碰撞解离能量设置为 30。根据球状体的活力分析，腺苷酸激酶的水平升高至第17天，导致约7%的细胞死亡。之后，死亡率降至 5% 以下此外，对第一主成分的分析揭示了球状体样品和平坦细胞培养物之间的明显区别。蛋白质组学分析表明，THLE-3 和 HepG2/C3A 球状体具有反映肝功能的相似特征。此外，与扁平细胞相比，球状体显示出两种金属硫蛋白亚型的过表达。功能分组网络显示 HepG2/C3A 和 THLE-3 球体中碳水化合物代谢过程的基因本体富集。为避免生长培养基溢出，当细胞室充满液体时，请勿打开或关闭前端口。该协议中描述的样品制备和分析可用于使用2D和3D方法探索细胞培养物的蛋白质组以及组织样品。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

质谱法和基于发光的-途径表征阶段我代谢能力的<em&gt;体外</em&gt;细胞培养

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

科研

生物化学

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

检测和可视化DNA损伤诱导的蛋白质复合物悬浮细胞培养使用邻近连接测定

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

细菌显示文库的半自动化筛选肽亲和试剂的发现与分离结果分析

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

人视网膜解剖与 RPE-脉络膜的蛋白质组分析

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

改进的小鼠骨骼肌染色质沉淀的协议

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

从茶中提取的新建细胞悬浮培养基中六种系统杀虫剂的代谢研究(山茶西宁西斯L.叶

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

一次人气道上皮细胞气道表面液体 pH 值的实时、半自动荧光测量

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

单分子鱼的转录活性等位基因单细胞分析

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

无细胞生产蛋白脂质体，用于功能分析和靶向膜蛋白的抗体开发

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

通过代谢标记和薄层色谱分析 糖浆 中中性脂质合成

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...