Name: semi-automated phenotypic analysis of functional 3d spheroid cell cultures
Uploaded: 2023-08-18T13:10:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures at JoVE.com

Sidoli-laboratoriet anerkender taknemmeligt Leukæmi Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics award), Deerfield (Xseed award), Relay Therapeutics, Merck og NIH Office of the Director (1S10OD030286-01).

<ol>
	<li>Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture+systems:+advantages+and+applications.">3D cell culture systems: advantages and applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).</li><li>Nirmalanandhan, V. S., Duren, A., Hendricks, P., Vielhauer, G., Sittampalam, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+anticancer+agents+in+a+three-dimensional+cell+culture+model.">Activity of anticancer agents in a three-dimensional cell culture model.</a> Assay and Drug Development Technologies. 8 (5), 581-590 (2010).</li><li>Erickson, I. E., Huang, A. H., Chung, C., Li, R. T., Burdick, J. A., Mauck, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+maturation+and+structure-function+relationships+in+mesenchymal+stem+cell-+and+chondrocyte-seeded+hydrogels.">Differential maturation and structure-function relationships in mesenchymal stem cell- and chondrocyte-seeded hydrogels.</a> Tissue Engineering Part A. 15 (5), 1041-1052 (2009).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation.">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biology. 10 (29), (2012).</li><li>Liu, J., Abate, W., Xu, J., Corry, D., Kaul, B., Jackson, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroid+cultures+of+A549+and+HepG2+cells+exhibit+different+lipopolysaccharide+(LPS)+receptor+expression+and+LPS-induced+cytokine+response+compared+with+monolayer+cultures.">Three-dimensional spheroid cultures of A549 and HepG2 cells exhibit different lipopolysaccharide (LPS) receptor expression and LPS-induced cytokine response compared with monolayer cultures.</a> Innate Immunity. 17 (3), 245-255 (2011).</li><li>Khafaga, A. F., Mousa, S. A., Aleya, L., Abdel-Daim, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+(3D)+cell+culture:+a+valuable+step+in+advancing+treatments+for+human+hepatocellular+carcinoma.">Three-dimensional (3D) cell culture: a valuable step in advancing treatments for human hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Cell International. 22 (1), 243 (2022).</li><li>Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocellular+carcinoma.">Hepatocellular carcinoma.</a> The Lancet. 362 (9399), 1907-1917 (2003).</li><li>Sia, D., Llovet, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+cancer:+Translating+'-omics'+results+into+precision+medicine+for+hepatocellular+carcinoma.">Liver cancer: Translating '-omics' results into precision medicine for hepatocellular carcinoma.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 14 (10), 571-572 (2017).</li><li>Tang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+cell+biology+model+of+human+hepatocellular+carcinoma+in+vitro.">A three-dimensional cell biology model of human hepatocellular carcinoma in vitro.</a> Tumour Biology. 32 (3), 469-479 (2011).</li><li>van Zijl, F., Mikulits, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatospheres:+Three+dimensional+cell+cultures+resemble+physiological+conditions+of+the+liver.">Hepatospheres: Three dimensional cell cultures resemble physiological conditions of the liver.</a> World Journal of Hepatology. 2 (1), 1-7 (2010).</li><li>Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+as+an+in+vitro+platform+for+cancer+and+stem+cell+modeling.">Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling.</a> World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).</li><li>Wrzesinski, K., Fey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+and+the+recovery+of+physiological+functionality+in+3D+cultures+in+micro-bioreactors.">Metabolic reprogramming and the recovery of physiological functionality in 3D cultures in micro-bioreactors.</a> Bioengineering(Basel, Switzerland). 5 (1), 22 (2018).</li><li>Breslin, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+The+missing+link+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: The missing link in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).</li><li>Kapalczynska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D+cell+cultures+-+a+comparison+of+different+types+of+cancer+cell+cultures.">2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures.</a> Archives of Medical Science: AMS. 14 (4), 910-919 (2018).</li><li>Wrzesinski, K., Frandsen, H. S., Calitz, C., Gouws, C., Korzeniowska, B., Fey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinostat+3D+cell+culture:+Protocols+for+the+preparation+and+functional+analysis+of+highly+reproducible,+large,+uniform+spheroids+and+organoids.">Clinostat 3D cell culture: Protocols for the preparation and functional analysis of highly reproducible, large, uniform spheroids and organoids.</a> Methods in Molecular Biology. 2273, 17-62 (2021).</li><li>Joseph-Chowdhury, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+level+quantification+of+histone+post-translational+modifications+in+a+3D+cell+culture+model+of+hepatic+tissue.">Global level quantification of histone post-translational modifications in a 3D cell culture model of hepatic tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 183, 63606 (2022).</li><li>Wrzesinski, K., Fey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=After+trypsinisation,+3D+spheroids+of+C3A+hepatocytes+need+18+days+to+re-establish+similar+levels+of+key+physiological+functions+to+those+seen+in+the+liver.">After trypsinisation, 3D spheroids of C3A hepatocytes need 18 days to re-establish similar levels of key physiological functions to those seen in the liver.</a> Toxicology Research. 2, 123-135 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Bindea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClueGO:+a+Cytoscape+plug-in+to+decipher+functionally+grouped+gene+ontology+and+pathway+annotation+networks.">ClueGO: a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks.</a> Bioinformatics. 25 (8), 1091-1093 (2009).</li><li>Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenomics:+The+next+challenge.">Phenomics: The next challenge.</a> Nature Reviews. Genetics. 11 (12), 855-866 (2010).</li><li>Gonneaud, A., Asselin, C., Boudreau, F., Boisvert, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+organoids+by+proteomics.">Phenotypic analysis of organoids by proteomics.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li><li>Avelino, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics+of+3D+cell+culture:+A+useful+tool+to+validate+culture+of+spheroids+and+organoids.">Mass spectrometry-based proteomics of 3D cell culture: A useful tool to validate culture of spheroids and organoids.</a> SLAS Discovery. 27 (3), 167-174 (2022).</li><li>Chiang, J., McManus, L. M., MitchellIn, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liver physiology: Metabolism and Detoxification. Pathobiology of Human Disease. , 1770-1782 (2014).</li><li>Begriche, K., Massart, J., Robin, M. A., Borgne-Sanchez, A., Fromenty, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-induced+toxicity+on+mitochondria+and+lipid+metabolism:+Mechanistic+diversity+and+deleterious+consequences+for+the+liver.">Drug-induced toxicity on mitochondria and lipid metabolism: Mechanistic diversity and deleterious consequences for the liver.</a> Journal of Hepatology. 54 (4), 773-794 (2011).</li><li>Fey, S. J., Korzeniowska, B., Wrzesinski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+to+and+recovery+from+treatment+in+human+liver-mimetic+clinostat+spheroids:+a+model+for+assessing+repeated-dose+drug+toxicity.">Response to and recovery from treatment in human liver-mimetic clinostat spheroids: a model for assessing repeated-dose drug toxicity.</a> Toxicology Research. 9 (4), 379-389 (2020).</li><li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+image+analysis+software+tools+for+exploring+and+understanding+big+image+data+from+cell-based+assays.">Phenotypic image analysis software tools for exploring and understanding big image data from cell-based assays.</a> Cell Systems. 6 (6), 636-653 (2018).</li></ol>

Helle Sedighi Frandsen er ansat som forsker hos CelVivo ApS, producenten af ClinoStar systemet. Karoline Mikkelsen er erhvervs-ph.d.-studerende ansat hos CelVivo ApS og udfører sit ph.d.-studie på SDU, Odense, Danmark. Alle andre forfattere har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Forståelse af biologien bag tredimensionelle (3D) cellulære strukturer er ekstremt vigtig for en mere omfattende viden om deres funktionaliteter. Der er en stigende interesse for at bruge 3D-modeller til at studere kompleks biologi og udføre toksicitetsscreening. Ved dyrkning af celler i 3D er der mange faktorer, der skal overvejes, herunder den fænotypiske vurdering af modelsystemet. En fænotype defineres som en gruppe observerbare egenskaber ved en bestemt organisme, såsom morfologi, adfærd, fysiologiske og biokemiske egenskaber20.
I denne protokol demonstrerer vi, hvordan proteomiske eksperimenter kan udføres fra nogle få sfæroider og kan bruges til at overvåge den typiske leverfænotype. Massespektrometri er blevet en omfattende anvendt metode til 3D-cellekarakterisering, hvilket muliggør undersøgelse af en række biologiske spørgsmål 12,16,21,22. Til en omfattende proteomanalyse anbefales det at anvende mindst 20 μg proteinudgangsmateriale, hvorfra 1 μg injiceres i massespektrometeret. Det er vigtigt at nævne, at tilføjelse af mindre prøve kan føre til tab af følsomhed, og tilføjelse af mere vil gradvist forværre kvaliteten af kromatografien og i sidste ende føre til blokering af kolonnen. I denne undersøgelse viste vi, at HepG2/C3A- og THLE-3-sfæroider er beriget med vigtige proteiner fra glykolyse og TCA-cyklus, som er specifikke leverveje og er kritiske for at opretholde blodsukkerniveauet og for energiproduktion23,24. Faktisk giver massespektrometrianalyse ikke kun information på proteinniveau, men tillader også undersøgelse af protein posttranslationelle modifikationer, som tidligere vist af vores gruppe16.
Et andet aspekt, der skal overvejes i 3D-fænotypiske undersøgelser, er antallet og størrelsen af sfæroider. Udover at gøre eksperimenter mere reproducerbare, er det vigtigt at tælle antallet af sfæroider og bestemme deres størrelse for at bestemme, hvornår kulturen skal opdeles i flere bioreaktorer, da antallet af 3D-strukturer i et fartøj kan påvirke sfæroidernes størrelse og metaboliske aktivitetsniveauer. Det er dog vigtigt at fremhæve, at antallet og størrelsen af sfæroider afhænger af cellelinjen, startantallet af celler, opdelingsprocessen og tidspunktet for indsamling. Detaljer om HepG2 / C3A sfærisk kultur, såsom antal celler pr. Sfæroider, proteinindhold og størrelse som funktion af alder, blev leveret af Fey, Korzeniowska og Wrzesinski25. For nøjagtig og vellykket analyse ved hjælp af den halvautomatiske metode, der er beskrevet her, er det mest kritiske trin et godt sfæroidbillede. For nemheds skyld kan billedet tages med en telefon eller tablet, men opløsningen skal holdes så høj som muligt. Da billeder er hurtige at erhverve, tillader de store screeningseksperimenter at visualisere specifikke fænotypiske træk eller undersøge reaktioner på lægemiddelbehandling. På grund af det stigende antal cellebaserede analyser er der derfor udviklet en række open source-software i løbet af de sidste 10 år til billedanalyse26. I denne protokol beskriver vi et halvautomatisk system, der bruger softwaren FIJI18 til at tælle og måle sfæroidernes størrelse. Vi præsenterede scripts (simple programmeringskommandoer) for at definere en sekvens af algoritmiske operationer, der kan anvendes på en billedsamling, hvilket gør analysen til en nem og hurtig proces. Afhængigt af sfæroidens karakteristika bør der imidlertid anvendes en manuel måling. For eksempel, hvis sfæroiderne er for gennemskinnelige, vil FIJI-scriptet være upræcist. Forresten er et af de vigtigste kriterier for, at denne metode fungerer, sfæroidernes kompakthed. Denne egenskab vil bidrage til en mere forbedret farvekontrast mellem sfæroiderne og baggrunden, hvilket er nødvendigt for, at metoden skal være nøjagtig.
Sammenfattende blev der udover at præsentere en metode til dyrkning af højreproducerbare sfæroider også beskrevet et semiautomatiseret system kombineret med fænotypisk karakterisering via billedoptagelse og proteomics. Vi forventer, at denne værktøjskasse til analyse af 3D-celler bliver mere robust med fuldautomatisk billedanalysesoftware og næste generations massespektrometre.

In vitro cellekulturer har vist sig at være nødvendige og uvurderlige for at etablere grundlæggende viden inden for biologi. Meget af den videnskabelige forståelse inden for biologi og kræft er specifikt kommet fra 2D-kultursystemet, det vil sige celler, der vokser i et monolag. Selvom 2D-kultur har været det dominerende cellekultursystem, har det mange ulemper, der potentielt kan kvæle yderligere biologiske fremskridt. For eksempel mangler 2D-kulturer celle-celle-interaktioner, der er vigtige for cellesignalering og spredning1. Til dato har 3D-kultursystemer vist sig at forbedre modeldifferentiering, lægemiddelrespons, tumorinvasion og biologi 2,3,4,5. 3D-modellering af ondartede kræftformer er især afgørende på grund af stigningen i den aldrende befolkning og kræftdødeligheden. Hepatocellulært karcinom (HCC) er en af de førende årsager til kræftrelateret dødelighed på verdensplan og har ofte en afgrundsdyb prognose6. HCC er kendt for at have en lav hærdningshastighed, dårlig lægemiddelrespons og høj gentagelseshastighed 6,7,8. Der er udviklet flere 3D-modeller for normal lever og HCC, der efterligner fysiologien af in vivo normalt og ondartet levervæv 9,10.
Nogle af de nuværende 3D-systemer inkluderer væskeoverlejringer, bioreaktorer, hydrogel, stilladser og 3D-printede strukturer. Sfæroider genereret i bioreaktorer giver specifikt unikke fordele, fordi de efterligner tumorfordeling af næringseksponering, gasudveksling og celleproliferation / hviletilstand11. Bioreaktorer er især velegnede til kræftmodeller på grund af deres brugervenlighed, store skalerbarhed, næringsstofdiffusion og tilgængelighed11. Derudover kan bioreaktorer give mulighed for eksperimenter med høj kapacitet, større reproducerbarhed og nedsat menneskelig fejl. Bioreaktoren, der anvendes i denne undersøgelse, er unik, fordi den simulerer et system med reduceret tyngdekraft, hvilket minimerer forstyrrende forskydningskræfter, der anvendes i typiske bioreaktorer, hvilket giver mulighed for bedre reproducerbarhed12. Den omnidirektionelle tyngdekraft og reduktion i forskydningskræfter gør det muligt for cellerne at udvikle sig på en mere fysiologisk måde. Som bevis udvikler HepG2 / C3A-celler dyrket under denne metode sfæriske organeller, der producerer in vivo-niveauer af ATP, adenylatkinase, urinstof og kolesterol13,14. Derudover er lægemiddelbehandlinger i dette 3D-system mere avancerede og automatiserede sammenlignet med 2D-kulturer. I 2D-kulturer skal lægemiddelbehandlinger ofte have et kort tidsforløb på grund af behovet for at trypsinisere og opretholde cellesundhed. Men i vores tilfælde kan vi udføre langsigtede lægemiddelbehandlinger af sfæroider uden behov for at forstyrre cellernes struktur og fysiologi. Derfor er et skift fra 2D- til 3D-kulturer nødvendigt for bedre at kunne modellere in vivo-biologiske fænomener og yderligere videnskabelig udvikling.
Dette papir præsenterer en metode til dyrkning af højreproducerbare sfæroider (figur 1 og figur 2) og viser et halvautomatiseret system til fænotypisk karakterisering af 3D-strukturer (figur 3). På billedniveau giver vi information om tælling og måling af sfæroiders areal (figur 3). Ved hjælp af massespektrometrimetoder viser vi, hvordan proteomics kan bruges til at vurdere specifikke biologiske funktioner (figur 4). Ved at indsamle og analysere disse data håber vi at forbedre forståelsen af biologien bag 3D-cellekultursystemer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>2239480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1481754</td>
			<td>Luer lock tip, graduated to 12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L wide bore pipet tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14222703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L wide bore pipet tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14222730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Orochem filter plate</td>
			<td>Orochem&#160;</td>
			<td>OF1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well skirted plate</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-96-FS-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well vacuum manifold</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAVM0960R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6141-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bronchial Epithelial Cell Growth Medium (BEGM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture grade water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-055-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoReactor</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bioreactor for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoStar incubator</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>CO2 incubator for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT17205CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elplasia 24-well round bottom ultra-low attachment plate containing microwells</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>28905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT21022CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hEGF</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell vios 160i</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>51033557</td>
			<td>CO2 incubator for 2D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W5-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25015CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25025CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB Resin 30 &#181;m</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td>
			<td>High resolution mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAULA microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT3002CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerkinElmer Victor X2 multilabel microplate reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH paper</td>
			<td>Hydrion</td>
			<td>93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoetanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A260-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette gun</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z666467 (Milipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil-Pur resin</td>
			<td>MSWIL</td>
			<td>R13.AQ.003</td>
			<td>120 &#197; pore size, C18-AQ phase, 3 &#956;M bead size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V511A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator (96-well plates)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15308325</td>
			<td>Savant SPD1010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile hood</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>1375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile serological pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S-trap</td>
			<td>Protifi</td>
			<td>C02-micro-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle (18 G)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14817100</td>
			<td>3&#34; length, 0.05&#34; diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>28904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z258415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated phenotypic analysis of functional 3d spheroid cell cultures

Vi præsenterer en protokol, der beskriver egenskaberne og fordelene ved at bruge en selvstændig clinostat-inkubator til dyrkning, behandling og overvågning af 3D-cellekulturer. Clinostaten efterligner et miljø, hvor celler kan samles som meget reproducerbare sfæroider med lave forskydningskræfter og aktiv næringsdiffusion. Vi demonstrerer, at både kræft og ikke-kræft hepatocytter (HepG2 / C3A og THLE-3 cellelinjer) kræver 3 ugers vækst før opnåelse af funktionaliteter, der kan sammenlignes med leverceller. Denne protokol fremhæver bekvemmeligheden ved at bruge inkubatorer til 3D-celler med kameraer, der overvåger cellevæksten, da snapshots kan tages for at tælle og måle sfæroider ved behandling. Vi beskriver sammenligningen af THLE-3 og HepG2/C3A cellelinjer, der viser, hvordan ikke-kræftcellelinjer kan dyrkes såvel som udødeliggjorte kræftceller. Vi demonstrerer og illustrerer, hvordan proteomiske eksperimenter kan udføres fra nogle få sfæroider, som kan indsamles uden forstyrrende cellesignalering, dvs. ingen trypsinisering kræves. Vi viser, at proteomics-analyse kan bruges til at overvåge den typiske leverfænotype af respirationskædemetabolisme og produktionen af proteiner, der er involveret i metalafgiftning og beskrive et semi-automatiseret system til at tælle og måle sfæroidens område. Alt i alt præsenterer protokollen en værktøjskasse, der omfatter en fænotypisk karakterisering via billedoptagelse og en proteomics-pipeline til at eksperimentere med 3D-cellekulturmodeller.

I denne protokol beskriver vi egenskaberne ved en innovativ stressfri 3D-celleinkubator, et system designet specielt til dyrkning af 3D-sfæroider (figur 2). Vi optimerede protokollen til 3D-dyrkning af THLE-3 og HepG2/C3A cellelinjer. Den her beskrevne protokol er enkel at bruge og giver mulighed for reproducerbarhed og omkostningseffektiv dyrkning af > 100 sfæroider pr. Bioreaktor. En gang i bioreaktoren behandles sfæroider på samme måde som celler, der opretholdes i 2D-kultur. Optimale vækstbetingelser opnås ved at udskifte mediet to til tre gange om ugen (figur 2B) og justere rotationshastigheden i henhold til sfæroidernes vækst og størrelse (figur 2C). Dette system, hvor 3D-sfæroider dyrkes i roterende bioreaktorer (figur 2E, F), giver et optimalt vækstmiljø for 3D-strukturer ved at udsætte sfæroid for en lige og meget lav mængde forskydningskraft.
Vi har tidligere vist, hvordan sfæroider kan bruges til analyse af kromatinmodifikation16. Her demonstrerer vi detaljeret, hvordan man opnår leversfæroider, og hvordan proteomiske eksperimenter kan udføres til analyse af det fulde proteom (figur 1). Kort fortalt blev protokollen initieret ved hjælp af THLE-3 eller HepG2 / C3A flade celler, indtil kulturen nåede 80% sammenløb. Til dyrkning af celler som sfæroider blev ca. 2.000 celler belagt i en ultralav fastgørelsesplade indeholdende mikrobrønde for at give dem mulighed for selvaggregere, og derefter blev dannede sfæroider overført til en bioreaktor (figur 1A). Selvom de er funktionelt aktive efter 3 uger i kultur, som tidligere demonstreret17, viser vi resultater fra sfæroider indsamlet efter 36 dage i kultur for denne protokol. Efter indsamling blev sfæroider spundet ned, og både pellet og supernatant blev opbevaret til analyse. Cellelevedygtigheden blev vurderet ud fra supernatanten til kvantificering af adenylatkinase frigivet af beskadigede celler, som beskrevet tidligere17. Cellulære proteiner blev ekstraheret fra cellepelleten, og det fulde proteom blev analyseret ved massespektrometri med høj opløsning (figur 1B).
Denne protokol demonstrerer også en halvautomatisk metode til optælling af sfæroider (figur 3A) ved hjælp af det offentlige billedbehandlingsprogram FIJI (Fiji Is Just ImageJ)18. Der bør tages et billede af sfæroiden af god kvalitet til analysen, og nogle parametre bør overvejes som nævnt i afsnit 5. Derefter, efter at billedet er forberedt til analyse, bruges et makroscript (supplerende fil 1) til at tælle sfæroiderne. Makroen fungerer ved først at lave en mappe kaldet FIJI Spheroids counting, inde i den mappe, hvor sfæroidbillederne er placeret. I denne mappe gemmes alle oplysninger fra analysen; dette inkluderer et billede af de sfæroider, der blev talt, med et ID-nummer på hver sfæroide. Det indeholder også en Excel-fil kaldet sfærisk tælling. Denne fil indeholder pixelområdet og id-nummeret for hver kugleform, der blev talt. De data, der svarer til et analyseret billede, præsenteres i hver fane i filen. Fanen er mærket i henhold til navnet på det analyserede billede. Da sfærisk størrelse kan forringes af mange faktorer, herunder antallet af strukturer i et fartøj og lægemiddelbehandling, er det også vigtigt at overvåge deres overfladeareal (planimetry). Makroscriptet, der præsenteres her (supplerende fil 2), fungerer ved at måle de sorte områder, der svarer til sfæroider i billedet (figur 3B). Outputtet samles i en fil kaldet planimetry.xlsx, som indeholder det målte areal, omkreds og diameter af hver sfæroide. Der er også en måling kaldet Feret, der bruges til at beregne diameteren. Feret er den længst mulige diameter, mens minFeret er den korteste. Diameteren er gennemsnittet af disse to. Inde i outputmappen er der udover planimetry.xlsx filen også et billede af de sfæroider, der blev målt.
Før vi gik videre til proteomanalysen, blev sfæroidernes levedygtighed evalueret over dyrkningstid. Niveauer af AK stiger op til dag 17 og når ca. 7% af celledød, og derefter falder døden til niveauer under 5% (figur 4A), hvilket er i overensstemmelse med tidligere offentliggjort arbejde17. Denne protokol viser også den fulde proteomanalyse til overvågning af cellefænotypen. For det første blev proteomerne af THLE-3 og HepG2 / C3A flade celler og sfæroider sammenlignet. Ved at analysere den første hovedkomponent (PC1) er det tydeligt, at der er en streng adskillelse af sfæroidprøver fra flade cellekulturer, og det ser ud til, at korrelationen mellem celletype (THLE-3 og HepG2 / C3A) ikke er relevant (figur 4B). Selvom THLE-3 og HepG2 / C3A sfæroider ikke klynger sammen, deler de lignende profiler i overensstemmelse med leverfunktionen. Vi demonstrerer i denne protokol eksemplet på metallothioneiner, som har en rolle i metalafgiftning udført af leveren. Vi identificerede i proteomics-analysen 2 isoformer, der var overudtrykt i sfæroider sammenlignet med flade celler (MT1E og MT1X) (figur 4C). Vi viser også genontologi (GO) berigelse af begge cellelinjer dyrket som sfæroider. Den kulhydratmetaboliske proces, som omfatter tricarboxylsyrecyklussen (TCA-cyklus), elektrontransportkæden (cellulær respiration) og pyruvatmetabolisme, er et hyppigt udtryk og er beriget i både HepG2 / C3A og THLE-3 sfæroider (figur 4D, E). Cellulær afgiftning, fedtsyre og kolesterolmetabolisme er andre funktioner beriget i begge sfæroider. Sammen er disse funktioner kendt for at være afgørende for leverfunktionen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig01.jpg"> Figur 1: Arbejdsproces for sfæroidkultur og prøveforberedelse . (A) 3D-cellekultur eksperimentel tilgang. Fladcellekulturer ved ønsket sammenløb blev trypsiniseret og podet på en ultra-lav vedhæftning 24 brøndplade indeholdende mikrobrønde, hvor celler selv samles i sfæroider. Efter 24 timer blev sfæroider overført til en bioreaktor og dyrket, indtil de er klar til analyse. B) Efter indsamling pelleteres sfæroider, og både pellet og kultursupernatant opbevares indtil forarbejdning. Histoner16og ikke-histoner proteiner blev ekstraheret, fordøjet til peptider og analyseret ved massespektrometri med høj opløsning. Råfiler opnået fra massespektrometrien blev søgt mod den menneskelige database, og dataene blev yderligere behandlet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig02v2.jpg"> Figur 2: 3D-cellekultursystem . (A) Bioreaktordele. Bioreaktoren består af et gasudvekslings- og befugtningskammer indeholdende vandperler og et oplukkeligt cellekammer med to stik til medieudveksling og indsamling af sfæroider. B) Udveksling af bioreaktormedier. Bioreaktoren fyldes med 10 ml vækstmedier ved hjælp af en sprøjte med en nål. (C) Systemkontrolappen. Rotationshastighed, CO2-niveau, temperatur, alarmlog og andre funktioner kan styres ved hjælp af styreenheden. (D) Placering af bioreaktoren i 3D-inkubatoren. Hver bioreaktor har en tilhørende motor, som kan dreje bioreaktoren langsomt. E) Bioreaktor i bevægelse med den hastighed (rpm), der styres af en (C) tablet. Hastigheden (o / min) justeres i henhold til sfæroidernes størrelse. F) Bioreaktorer inde i de 3D-inkubator. 3D-inkubatoren kan rumme op til 6 individuelt styrede bioreaktorer. Foto udlånt af Jason Torres Photography. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig02largev2.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig03.jpg"> Figur 3: Fænotypisk karakterisering af sfæroider via billedoptagelse . (A) Halvautomatisk sfærisk tælling. Efter at have taget snapshots af sfæroiderne i bioreaktoren, forberedes billedet til analyse i FIJI. Hver sfærisk tælles, og der gives et ID-nummer for hver af dem. Der bruges en makro, og resultaterne vises, der viser id'et for den tællede sfæroide, etiketten (navnet på det billede, der blev analyseret) og området (antallet af pixel, der tælles i sfæroiden). B) Planimetrisk bestemmelse af kugleformet areal. Ved hjælp af en makro bestemmes arealet, omkredsen og diameteren af en bestemt sfæroide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig04.jpg"> Figur 4: Proteomanalyse af leversfæroider . (A) Sfæroider levedygtighed blev beregnet på grundlag af frigivelsen af adenylatkinase (AK) på kultursupernatant. Resultaterne er grundlaget for duplikerede datapunkter ± SD. (B) Hovedkomponentanalyse (PCA) blev udført for at sammenligne proteomet af THLE-3 og HepG2 / C3A flade celler og sfæroider. (C) Relativ forekomst af metallothioneiner, som er proteiner udtrykt af den menneskelige lever. Data er repræsenteret som midler ± SEM. (D) Funktionelt grupperet netværk viser GO-berigelse for HepG2/C3A-sfæroider og (E) THLE-3-sfæroider, hvor kun etiketten for det mest betydningsfulde udtryk pr. gruppe vises. Netværket blev konstrueret ved hjælp af ClueGo19. Nodestørrelsen repræsenterer udtrykket berigelsesbetydning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Supplerende fil 1: Makroscript til sfærisk tælling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende fil 2: Makro til planimetrisk bestemmelse af sfæroider. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/Supplementary%20File%202.docx" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures at JoVE.com

Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures

Vi præsenterer en protokol til dyrkning af højreproducerbare sfæroider og deres fænotypiske karakterisering ved hjælp af billedoptagelse og proteomics.

Halvautomatisk fænotypisk analyse af funktionelle 3D-sfæroidcellekulturer

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell ...

Denne protokol demonstrerer, hvordan man dyrker meget reproducerbare sfæroider og viser, hvordan proteomiske eksperimenter kan udføres for at karakterisere den biologiske funktion af 3D-strukturer. Vores 3D-kultur kan samtidig producere hundredvis af biologiske replikater i den samme bioreaktor, og LC-MS-tilgangen kan måle mængden af tusindvis af proteiner i et enkelt eksperiment. Stephanie Stransky, postdoc fra laboratoriet, demonstrerer proceduren.Til at begynde med skal du tage suspensionen af HepG2 / C3A og THLE-3 celler. Tæl antallet af celler og fortynd cellesuspensionen i komplette vækstmedier for at opnå 1 million celler i et maksimalt volumen på 1,5 ml. Vask brøndene i en ultra-lav fastgørelse, 24-brønd rund bundplade med 0,5 ml vækstmedier og centrifuger ved 3.000 g i fem minutter.Overfør cellesuspensionen til pladen, og centrifuger den i tre minutter ved 120 g. Inkuber derefter pladen for at indlede sfærisk dannelse. Derefter afbalanceres bioreaktoren 24 timer før overførsel af sfæroiderne ved at fylde fugtighedskammeret med 25 ml sterilt vand og cellekammeret med ni ml vækstmedier ved hjælp af en 10 ml sprøjte med en lang nål.Placer derefter bioreaktoren i en 3D-inkubator i 24 timer ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid. Rør forsigtigt sfæroiderne op og ned ved hjælp af en milliliter brede borespidser for at løsne dem fra den ultralave fastgørelsesplade og overføre dem til en vævskulturskål. For at fange eventuelle resterende sfæroider skal du vaske pladen med 0,5 ml forvarmede vækstmedier og overføre dem til kulturskålen.Brug et lysmikroskop til at evaluere størrelsen, kompaktiteten og rundheden af sfæroiderne for at vælge dem, der er tilstrækkeligt dannet. Overfør den valgte sfæroid til den ekvilibrerende bioreaktor fyldt med fem ml frisk vækstmedie. Fyld derefter hele bioreaktoren med friske vækstmedier.Placer bioreaktoren i 3D-inkubatoren, og juster rotationshastigheden ved hjælp af styreenheden. Udskift 10 ml gamle vækstmedier med 10 ml friske medier hver anden til tre dage. Skift rotationshastigheden hver gang efter udskiftning af mediet.Dyrk sfæroiderne i 15 dage og del dem mellem to friske bioreaktorer. Åbn den 3D-app, der er installeret på tabletten, vælg bioreaktoren, og tag billedet. Som et alternativ skal du placere en sort baggrund bag bioreaktoren og sikre, at intet lys reflekteres på cellekammeret.Tag billedet så tæt på bioreaktoren som muligt. Derefter samles sfæroider ved at fjerne fem milliliter medier fra bioreaktoren ved hjælp af en sprøjte fastgjort til en lang nål gennem den øverste port. Sørg for, at sfæroiderne falder ned til bioreaktorens nederste center.Åbn nu frontporten og saml sfæroiderne ved hjælp af en en milliliter bred borespids. Disse sfæroider overføres til mikrocentrifugeglas, centrifugeres ved 500 g i fem minutter, og bortskaffes mediet. Vask sfæroiden ved at tilsætte 200 mikroliter HBSS for at fjerne FBS.Derefter centrifugeres ved 500 g i fem minutter, og supernatanten kasseres. Derefter nedsænkes den sfæroidpille hurtigt i flydende nitrogen for at fryse den og opbevare denne frosne pellet ved minus 80 grader Celsius indtil videre behandling. For at lyse cellerne skal du tage et rør med indsamlede sfæroider og resuspendere dem i 25 mikroliter 5% SDS.Homogeniser pelleten ved pipettering op og ned. Derefter opløses et mikrogram prøver og 10 mikroliter 0,1% trichloreddikesyre. Efter ekstraktion af proteinet og rensning af prøverne skal du konfigurere MS-erhvervelsesmetoden til at generere MS / MS-spektrene fra de identificerede peptidsignaler.Overfør derefter pladen til nanoliter væskekromatografi autosampler. Indstil den fulde MS-scanning til 300 til 1.100 masse-til-opladningsforhold i Orbitrap. Juster opløsningen til 120000, og indstil målet for automatisk forstærkningskontrol til 125.Indstil derefter MS / MS i Orbitrap med et sekventielt isolationsvindue på 50 masse-til-opladningsforhold. Ret det automatiske forstærkningskontrolmål mod 400, og indstil en højere energikollisionsdissociationsenergi på 30. Ifølge levedygtighedsanalyse af sfæroider øges niveauerne af adenylatkinase indtil dag 17, hvilket resulterer i ca. 7% af celledød.Derefter falder dødeligheden til under 5%Desuden afslører en analyse af den første hovedkomponent en klar sondring mellem sfæroidprøver og flade cellekulturer. Den proteomiske analyse viste, at THLE-3 og HepG2/C3A sfæroider har lignende profiler, der afspejler leverfunktionen. Derudover viste sfæroiderne overekspression af to isoformer af metallothioneiner sammenlignet med flade celler.Funktionelt grupperede netværk viste genontologisk berigelse for kulhydratmetabolisk proces i HepG2/C3A og THLE-3 sfærer. For at undgå spild af vækstmedier må du ikke åbne eller lukke den forreste port, når cellekammeret er helt fyldt med væske. Prøveforberedelsen og analysen beskrevet i denne protokol kan bruges til at udforske proteomet af cellekultur ved hjælp af 2D- og 3D-metoder samt vævsprøver.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Massespektrometri og luminogent tilgange til Karakterisere Fase I Metabolisk Kompetenceudvikling af<em&gt; In vitro</em&gt; Cell Cultures

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Påvisning og visualisering af DNA-skader-inducerede proteinkomplekser i suspensionscellekulturer ved anvendelse af Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Semi-automatiske Biopanning af bakteriel Display biblioteker for peptid affinitet reagens opdagelse og analyse af resulterende isolater

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

Dissektion af menneskelige nethinde og RPE-choroidea proteom analyse

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

Forbedret protokol for kromatin Immunoprecipitation fra mus skeletmuskulatur

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Undersøgelse af metabolismen af seks systemiske insekticider i en nyetableret celle affjedrings kultur afledt af te (Camellia sinensis L.) Blade

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Real-time, semi-automatiseret fluorescerende måling af luftvejene overflade flydende pH af primære Human luftvejs epitelial celler

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Enkeltcelleanalyse af transskriptionsaktive alleler efter enkeltmolekyle FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Cellefri produktion af proteoliposomer til funktionel analyse og antistofudvikling rettet mod membranproteiner

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analyse af neutral lipidsyntese i Saccharomyces cerevisiae ved metabolisk mærkning og tyndt lag kromatografi

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...