Name: semi-automated phenotypic analysis of functional 3d spheroid cell cultures
Uploaded: 2023-08-18T13:10:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures at JoVE.com

Het Sidoli-lab is dankbaar voor de Leukemia Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics award), Deerfield (Xseed award), Relay Therapeutics, Merck en het NIH Office of the Director (1S10OD030286-01).

<ol>
	<li>Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture+systems:+advantages+and+applications.">3D cell culture systems: advantages and applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).</li><li>Nirmalanandhan, V. S., Duren, A., Hendricks, P., Vielhauer, G., Sittampalam, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+anticancer+agents+in+a+three-dimensional+cell+culture+model.">Activity of anticancer agents in a three-dimensional cell culture model.</a> Assay and Drug Development Technologies. 8 (5), 581-590 (2010).</li><li>Erickson, I. E., Huang, A. H., Chung, C., Li, R. T., Burdick, J. A., Mauck, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+maturation+and+structure-function+relationships+in+mesenchymal+stem+cell-+and+chondrocyte-seeded+hydrogels.">Differential maturation and structure-function relationships in mesenchymal stem cell- and chondrocyte-seeded hydrogels.</a> Tissue Engineering Part A. 15 (5), 1041-1052 (2009).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation.">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biology. 10 (29), (2012).</li><li>Liu, J., Abate, W., Xu, J., Corry, D., Kaul, B., Jackson, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroid+cultures+of+A549+and+HepG2+cells+exhibit+different+lipopolysaccharide+(LPS)+receptor+expression+and+LPS-induced+cytokine+response+compared+with+monolayer+cultures.">Three-dimensional spheroid cultures of A549 and HepG2 cells exhibit different lipopolysaccharide (LPS) receptor expression and LPS-induced cytokine response compared with monolayer cultures.</a> Innate Immunity. 17 (3), 245-255 (2011).</li><li>Khafaga, A. F., Mousa, S. A., Aleya, L., Abdel-Daim, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+(3D)+cell+culture:+a+valuable+step+in+advancing+treatments+for+human+hepatocellular+carcinoma.">Three-dimensional (3D) cell culture: a valuable step in advancing treatments for human hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Cell International. 22 (1), 243 (2022).</li><li>Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocellular+carcinoma.">Hepatocellular carcinoma.</a> The Lancet. 362 (9399), 1907-1917 (2003).</li><li>Sia, D., Llovet, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+cancer:+Translating+'-omics'+results+into+precision+medicine+for+hepatocellular+carcinoma.">Liver cancer: Translating '-omics' results into precision medicine for hepatocellular carcinoma.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 14 (10), 571-572 (2017).</li><li>Tang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+cell+biology+model+of+human+hepatocellular+carcinoma+in+vitro.">A three-dimensional cell biology model of human hepatocellular carcinoma in vitro.</a> Tumour Biology. 32 (3), 469-479 (2011).</li><li>van Zijl, F., Mikulits, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatospheres:+Three+dimensional+cell+cultures+resemble+physiological+conditions+of+the+liver.">Hepatospheres: Three dimensional cell cultures resemble physiological conditions of the liver.</a> World Journal of Hepatology. 2 (1), 1-7 (2010).</li><li>Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+as+an+in+vitro+platform+for+cancer+and+stem+cell+modeling.">Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling.</a> World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).</li><li>Wrzesinski, K., Fey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+and+the+recovery+of+physiological+functionality+in+3D+cultures+in+micro-bioreactors.">Metabolic reprogramming and the recovery of physiological functionality in 3D cultures in micro-bioreactors.</a> Bioengineering(Basel, Switzerland). 5 (1), 22 (2018).</li><li>Breslin, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+The+missing+link+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: The missing link in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).</li><li>Kapalczynska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D+cell+cultures+-+a+comparison+of+different+types+of+cancer+cell+cultures.">2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures.</a> Archives of Medical Science: AMS. 14 (4), 910-919 (2018).</li><li>Wrzesinski, K., Frandsen, H. S., Calitz, C., Gouws, C., Korzeniowska, B., Fey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinostat+3D+cell+culture:+Protocols+for+the+preparation+and+functional+analysis+of+highly+reproducible,+large,+uniform+spheroids+and+organoids.">Clinostat 3D cell culture: Protocols for the preparation and functional analysis of highly reproducible, large, uniform spheroids and organoids.</a> Methods in Molecular Biology. 2273, 17-62 (2021).</li><li>Joseph-Chowdhury, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+level+quantification+of+histone+post-translational+modifications+in+a+3D+cell+culture+model+of+hepatic+tissue.">Global level quantification of histone post-translational modifications in a 3D cell culture model of hepatic tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 183, 63606 (2022).</li><li>Wrzesinski, K., Fey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=After+trypsinisation,+3D+spheroids+of+C3A+hepatocytes+need+18+days+to+re-establish+similar+levels+of+key+physiological+functions+to+those+seen+in+the+liver.">After trypsinisation, 3D spheroids of C3A hepatocytes need 18 days to re-establish similar levels of key physiological functions to those seen in the liver.</a> Toxicology Research. 2, 123-135 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Bindea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClueGO:+a+Cytoscape+plug-in+to+decipher+functionally+grouped+gene+ontology+and+pathway+annotation+networks.">ClueGO: a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks.</a> Bioinformatics. 25 (8), 1091-1093 (2009).</li><li>Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenomics:+The+next+challenge.">Phenomics: The next challenge.</a> Nature Reviews. Genetics. 11 (12), 855-866 (2010).</li><li>Gonneaud, A., Asselin, C., Boudreau, F., Boisvert, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+organoids+by+proteomics.">Phenotypic analysis of organoids by proteomics.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li><li>Avelino, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics+of+3D+cell+culture:+A+useful+tool+to+validate+culture+of+spheroids+and+organoids.">Mass spectrometry-based proteomics of 3D cell culture: A useful tool to validate culture of spheroids and organoids.</a> SLAS Discovery. 27 (3), 167-174 (2022).</li><li>Chiang, J., McManus, L. M., MitchellIn, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liver physiology: Metabolism and Detoxification. Pathobiology of Human Disease. , 1770-1782 (2014).</li><li>Begriche, K., Massart, J., Robin, M. A., Borgne-Sanchez, A., Fromenty, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-induced+toxicity+on+mitochondria+and+lipid+metabolism:+Mechanistic+diversity+and+deleterious+consequences+for+the+liver.">Drug-induced toxicity on mitochondria and lipid metabolism: Mechanistic diversity and deleterious consequences for the liver.</a> Journal of Hepatology. 54 (4), 773-794 (2011).</li><li>Fey, S. J., Korzeniowska, B., Wrzesinski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+to+and+recovery+from+treatment+in+human+liver-mimetic+clinostat+spheroids:+a+model+for+assessing+repeated-dose+drug+toxicity.">Response to and recovery from treatment in human liver-mimetic clinostat spheroids: a model for assessing repeated-dose drug toxicity.</a> Toxicology Research. 9 (4), 379-389 (2020).</li><li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+image+analysis+software+tools+for+exploring+and+understanding+big+image+data+from+cell-based+assays.">Phenotypic image analysis software tools for exploring and understanding big image data from cell-based assays.</a> Cell Systems. 6 (6), 636-653 (2018).</li></ol>

Helle Sedighi Frandsen is werkzaam als onderzoekswetenschapper bij CelVivo ApS, de producent van het ClinoStar-systeem. Karoline Mikkelsen is een industriële Ph.D. student werkzaam bij CelVivo ApS en voert haar Ph.D. studie aan SDU, Odense, Denemarken. Alle andere auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Het begrijpen van de biologie achter driedimensionale (3D) cellulaire structuren is uiterst belangrijk voor een uitgebreidere kennis van hun functionaliteiten. Er is een groeiende belangstelling voor het gebruik van 3D-modellen voor het bestuderen van complexe biologie en het uitvoeren van toxiciteitsscreening. Bij het kweken van cellen in 3D moet met veel factoren rekening worden gehouden, waaronder de fenotypische beoordeling van het modelsysteem. Een fenotype wordt gedefinieerd als een groep waarneembare kenmerken van een specifiek organisme, zoals morfologie, gedrag, fysiologische en biochemische eigenschappen20.
In dit protocol laten we zien hoe proteomics-experimenten kunnen worden uitgevoerd met enkele sferoïden en kunnen worden gebruikt om het typische leverfenotype te monitoren. Massaspectrometrie is een veelgebruikte methode geworden voor 3D-celkarakterisering, waardoor een verscheidenheid aan biologische vragen kan worden onderzocht 12,16,21,22. Voor een uitgebreide proteoomanalyse wordt aanbevolen om ten minste 20 μg eiwituitgangsmateriaal te gebruiken, waarvan 1 μg in de massaspectrometer wordt geïnjecteerd. Het is belangrijk om te vermelden dat het toevoegen van minder monster kan leiden tot verlies van gevoeligheid, en het toevoegen van meer monster zou de kwaliteit van de chromatografie geleidelijk verslechteren en uiteindelijk leiden tot blokkering van de kolom. In deze studie toonden we aan dat de HepG2/C3A- en THLE-3-sferoïden verrijkt zijn met belangrijke eiwitten uit de glycolyse- en TCA-cyclus, die specifieke leverroutes zijn en van cruciaal belang zijn voor het handhaven van de bloedglucosespiegels en voor de energieproductie23,24. In feite levert massaspectrometrie-analyse niet alleen informatie op eiwitniveau op, maar maakt het ook mogelijk om posttranslationele modificaties van eiwitten te onderzoeken, zoals eerder aangetoond door onze groep16.
Een ander aspect waarmee rekening moet worden gehouden in fenotypische 3D-studies is het aantal en de grootte van sferoïden. Naast het reproduceerbaarder maken van experimenten, is het tellen van het aantal sferoïden en het bepalen van hun grootte essentieel om te bepalen wanneer de cultuur in meerdere bioreactoren moet worden gesplitst, aangezien het aantal 3D-structuren in een vat van invloed kan zijn op de grootte en metabolische activiteitsniveaus van sferoïden. Het is echter belangrijk om te benadrukken dat het aantal en de grootte van sferoïden afhangen van de cellijn, het startaantal cellen, het splitsingsproces en het tijdstip van verzameling. Details van HepG2/C3A-sferoïde cultuur, zoals het aantal cellen per sferoïden, eiwitgehalte en grootte als functie van de leeftijd, werden verstrekt door Fey, Korzeniowska en Wrzesinski25. Voor een nauwkeurige en succesvolle analyse met behulp van de semi-geautomatiseerde methode die hier wordt beschreven, is de meest kritische stap een goed beeld van sferoïden. Voor de eenvoud kan de foto worden gemaakt met een telefoon of tablet, maar de resolutie moet zo hoog mogelijk worden gehouden. Omdat beelden snel te verkrijgen zijn, maken ze grootschalige screeningsexperimenten mogelijk om specifieke fenotypische kenmerken te visualiseren of reacties op medicamenteuze behandeling te onderzoeken. Daarom is er, vanwege het toenemende aantal celgebaseerde assays, de afgelopen 10 jaar een aantal open-source software ontwikkeld voor beeldanalyse26. In dit protocol beschrijven we een semi-geautomatiseerd systeem dat de software FIJI18 gebruikt om de grootte van sferoïden te tellen en te meten. We presenteerden scripts (eenvoudige programmeercommando's) om een reeks algoritmische bewerkingen te definiëren die kunnen worden toegepast op een beeldverzameling, waardoor de analyse een eenvoudig en snel proces wordt. Afhankelijk van de karakteristiek van de sferoïde moet echter een handmatige meting worden uitgevoerd. Als de sferoïden bijvoorbeeld te doorschijnend zijn, zal het FIJI-script onnauwkeurig zijn. Trouwens, een van de belangrijkste criteria om deze methode te laten werken, is de compactheid van de sferoïden. Deze eigenschap zal bijdragen aan een beter kleurcontrast tussen de sferoïden en de achtergrond, wat nodig is om de methode nauwkeurig te laten zijn.
Samenvattend werd naast het presenteren van een methodologie voor het kweken van hoogreproduceerbare sferoïden, ook een semi-geautomatiseerd systeem beschreven in combinatie met fenotypische karakterisering via beeldopname en proteomics. We verwachten dat deze toolbox voor het analyseren van 3D-cellen robuuster zal worden met volledig geautomatiseerde beeldanalysesoftware en massaspectrometers van de volgende generatie.

Het is bewezen dat in-vitrocelculturen noodzakelijk en van onschatbare waarde zijn voor het vestigen van fundamentele kennis in de biologie. Veel van het wetenschappelijke begrip in de biologie en kanker in het bijzonder is afkomstig van het 2D-kweeksysteem, dat wil zeggen cellen die in een monolaag groeien. Hoewel 2D-kweek het dominante celkweeksysteem is geweest, heeft het veel nadelen die verdere biologische vooruitgang kunnen verstikken. 2D-culturen missen bijvoorbeeld cel-celinteracties die belangrijk zijn voor celsignalering en proliferatie1. Tot op heden is aangetoond dat 3D-kweeksystemen differentiatie, geneesmiddelrespons, tumorinvasie en biologie beter modelleren 2,3,4,5. 3D-modellering van kwaadaardige kankers is vooral van vitaal belang vanwege de toename van de vergrijzing van de bevolking en de sterfte aan kanker. Hepatocellulair carcinoom (HCC) is wereldwijd een van de belangrijkste oorzaken van kankergerelateerde sterfte en heeft vaak een erbarmelijke prognose6. Van HCC is bekend dat het een laag genezingspercentage, een slechte respons op geneesmiddelen en een hoog recidiefpercentage heeft 6,7,8. Er zijn verschillende 3D-modellen voor normale lever en HCC ontwikkeld die de fysiologie van in vivo normaal en kwaadaardig leverweefsel nabootsen 9,10.
Sommige van de huidige 3D-systemen omvatten vloeibare overlays, bioreactoren, hydrogel, steigers en 3D-geprinte structuren. Sferoïden die in bioreactoren worden gegenereerd, bieden specifiek unieke voordelen omdat ze de tumorverdeling van blootstelling aan voedingsstoffen, gasuitwisseling en celproliferatie/rust nabootsen11. Bioreactoren zijn vooral geschikt voor kankermodellen vanwege hun gebruiksgemak, grote schaalbaarheid, diffusie van voedingsstoffen en toegankelijkheid11. Bovendien kunnen bioreactoren experimenten met een hoge doorvoer, een grotere reproduceerbaarheid en minder menselijke fouten mogelijk maken. De bioreactor die in deze studie wordt gebruikt, is uniek omdat hij een systeem van verminderde zwaartekracht simuleert, waardoor storende schuifkrachten die worden toegepast in typische bioreactoren worden geminimaliseerd, waardoor een betere reproduceerbaarheid mogelijk is12. De omnidirectionele zwaartekracht en vermindering van de schuifkrachten zorgen ervoor dat de cellen zich op een meer fysiologische manier kunnen ontwikkelen. Als bewijs ontwikkelen HepG2/C3A-cellen die volgens deze methodologie worden gekweekt bolvormige organellen die in vivo niveaus van ATP, adenylaatkinase, ureum en cholesterol produceren13,14. Bovendien zijn medicamenteuze behandelingen in dit 3D-systeem geavanceerder en geautomatiseerd in vergelijking met 2D-culturen. In 2D-culturen moeten medicamenteuze behandelingen vaak een kort tijdsverloop hebben vanwege de noodzaak om te trypsiniseren en de gezondheid van cellen te behouden. Toch kunnen we in ons geval langdurige medicamenteuze behandelingen van sferoïden uitvoeren zonder de structuur en fysiologie van de cellen te hoeven verstoren. Daarom is een verschuiving van 2D- naar 3D-culturen nodig om biologische fenomenen in vivo beter te modelleren en de wetenschappelijke ontwikkeling te bevorderen.
Dit artikel presenteert een methodologie voor het kweken van sterk reproduceerbare sferoïden (Figuur 1 en Figuur 2) en toont een semi-geautomatiseerd systeem om fenotypische 3D-structuren te karakteriseren (Figuur 3). Op beeldniveau geven we informatie over het tellen en meten van het oppervlak van sferoïden (Figuur 3). Door gebruik te maken van massaspectrometriemethoden laten we zien hoe proteomics kan worden gebruikt om specifieke biologische functies te beoordelen (Figuur 4). Door deze gegevens te verzamelen en te analyseren, hopen we het begrip van de biologie achter 3D-celkweeksystemen te verbeteren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>2239480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1481754</td>
			<td>Luer lock tip, graduated to 12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L wide bore pipet tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14222703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L wide bore pipet tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14222730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Orochem filter plate</td>
			<td>Orochem&#160;</td>
			<td>OF1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well skirted plate</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-96-FS-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well vacuum manifold</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAVM0960R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6141-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bronchial Epithelial Cell Growth Medium (BEGM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture grade water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-055-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoReactor</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bioreactor for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoStar incubator</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>CO2 incubator for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT17205CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elplasia 24-well round bottom ultra-low attachment plate containing microwells</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>28905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT21022CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hEGF</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell vios 160i</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>51033557</td>
			<td>CO2 incubator for 2D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W5-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25015CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25025CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB Resin 30 &#181;m</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td>
			<td>High resolution mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAULA microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT3002CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerkinElmer Victor X2 multilabel microplate reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH paper</td>
			<td>Hydrion</td>
			<td>93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoetanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A260-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette gun</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z666467 (Milipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil-Pur resin</td>
			<td>MSWIL</td>
			<td>R13.AQ.003</td>
			<td>120 &#197; pore size, C18-AQ phase, 3 &#956;M bead size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V511A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator (96-well plates)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15308325</td>
			<td>Savant SPD1010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile hood</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>1375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile serological pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S-trap</td>
			<td>Protifi</td>
			<td>C02-micro-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle (18 G)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14817100</td>
			<td>3&#34; length, 0.05&#34; diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>28904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z258415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated phenotypic analysis of functional 3d spheroid cell cultures

We presenteren een protocol dat de eigenschappen en voordelen beschrijft van het gebruik van een standalone clinostat-incubator voor het kweken, behandelen en monitoren van 3D-celculturen. De clinostat bootst een omgeving na waarin cellen zich kunnen assembleren als zeer reproduceerbare sferoïden met lage schuifkrachten en actieve diffusie van voedingsstoffen. We tonen aan dat zowel kanker- als niet-kankerhepatocyten (HepG2/C3A- en THLE-3-cellijnen) 3 weken groei nodig hebben voordat ze functionaliteiten bereiken die vergelijkbaar zijn met levercellen. Dit protocol benadrukt het gemak van het gebruik van incubators voor 3D-cellen met camera's die de celgroei bewaken, aangezien snapshots kunnen worden gemaakt om sferoïden tijdens de behandeling te tellen en te meten. We beschrijven de vergelijking van THLE-3- en HepG2/C3A-cellijnen en laten zien hoe niet-kankercellijnen kunnen worden gekweekt en onsterfelijke kankercellen. We demonstreren en illustreren hoe proteomics-experimenten kunnen worden uitgevoerd op basis van een paar sferoïden, die kunnen worden verzameld zonder de celsignalering te verstoren, d.w.z. dat er geen trypsinisatie nodig is. We laten zien dat proteomics-analyse kan worden gebruikt om het typische leverfenotype van het metabolisme van de ademhalingsketen en de productie van eiwitten die betrokken zijn bij metaalontgifting te monitoren en beschrijven een semi-geautomatiseerd systeem om het gebied van de sferoïde te tellen en te meten. Al met al presenteert het protocol een toolbox die bestaat uit een fenotypische karakterisering via beeldopname en een proteomics-pijplijn om te experimenteren met 3D-celkweekmodellen.

In dit protocol beschrijven we de eigenschappen van een innovatieve stressvrije 3D-celincubator, een systeem dat speciaal is ontworpen voor het kweken van 3D-sferoïden (Figuur 2). We optimaliseerden het protocol voor het 3D-kweken van THLE-3- en HepG2/C3A-cellijnen. Het hier beschreven protocol is eenvoudig te gebruiken en maakt de reproduceerbaarheid en kosteneffectieve kweek van > 100 sferoïden per bioreactor mogelijk. Eenmaal in de bioreactor worden sferoïden op dezelfde manier behandeld als cellen die in 2D-kweek worden onderhouden. Optimale groeiomstandigheden worden bereikt door de media twee tot drie keer per week te verwisselen (Figuur 2B) en de rotatiesnelheid aan te passen aan de groei en grootte van sferoïden (Figuur 2C). Dit systeem, waarbij 3D-sferoïden worden gekweekt in roterende bioreactoren (Figuur 2E,F), biedt een optimale groeiomgeving voor 3D-structuren door sferoïde bloot te stellen aan een gelijke en zeer lage hoeveelheid schuifkracht.
We hebben eerder laten zien hoe sferoïden kunnen worden gebruikt voor de analyse van chromatinemodificatie16. Hier demonstreren we in detail hoe leversferoïden kunnen worden verkregen en hoe proteomics-experimenten kunnen worden uitgevoerd voor de analyse van het volledige proteoom (Figuur 1). In het kort werd het protocol geïnitieerd door gebruik te maken van THLE-3 of HepG2/C3A platte cellen totdat de kweek 80% confluentie bereikte. Om cellen als sferoïden te kweken, werden ongeveer 2.000 cellen geplateerd in een ultralage bevestigingsplaat met microwells om ze in staat te stellen zichzelf te aggregeren, en vervolgens werden gevormde sferoïden overgebracht naar een bioreactor (Figuur 1A). Hoewel ze functioneel actief zijn na 3 weken in kweek, zoals eerder aangetoond17, laten we resultaten zien van sferoïden die na 36 dagen in kweek zijn verzameld voor dit protocol. Na het verzamelen werden sferoïden naar beneden gesponnen en werden zowel pellet als supernatans opgeslagen voor analyse. De levensvatbaarheid van de cellen werd beoordeeld aan de hand van het supernatans voor de kwantificering van adenylaatkinase dat vrijkomt door beschadigde cellen, zoals eerder beschreven17. Cellulaire eiwitten werden geëxtraheerd uit de celpellet en het volledige proteoom werd geanalyseerd door middel van massaspectrometrie met hoge resolutie (Figuur 1B).
Dit protocol demonstreert ook een semi-geautomatiseerde methode voor het tellen van sferoïden (Figuur 3A) met behulp van het openbare beeldverwerkingsprogramma FIJI (Fiji Is Just ImageJ)18. Voor de analyse moet een foto van goede kwaliteit van het sferoïde worden gemaakt en er moet rekening worden gehouden met enkele parameters zoals vermeld in rubriek 5. Vervolgens, na het voorbereiden van de foto voor analyse, wordt een macroscript (aanvullend bestand 1) gebruikt voor het tellen van de sferoïden. De macro werkt door eerst een map te maken met de naam FIJI Spheroids counting, in de map waar de sferoïde foto's zich bevinden. In deze map wordt alle informatie uit de analyse opgeslagen; dit omvat een foto van de sferoïden die zijn geteld, met een ID-nummer op elke sferoïde. Het bevat ook een Excel-bestand met de naam sferoïde tellen. Dit bestand bevat het pixelgebied en het ID-nummer voor elke sferoïde die is geteld. De gegevens die overeenkomen met één geanalyseerde afbeelding worden weergegeven in elk tabblad van het bestand. Het tabblad is gelabeld op basis van de naam van de geanalyseerde afbeelding. Aangezien de grootte van de sferoïde kan worden aangetast door vele factoren, waaronder het aantal structuren in een bloedvat en medicamenteuze behandeling, is het ook belangrijk om hun oppervlak te controleren (planimetrie). Het macroscript dat hier wordt gepresenteerd (aanvullend bestand 2) werkt door de zwarte gebieden te meten, die overeenkomen met sferoïden in de afbeelding (Figuur 3B). De uitvoer wordt verzameld in een bestand met de naam planimetrie.xlsx, dat het gemeten gebied, de omtrek en de diameter van elke sferoïde bevat. Er is ook een meting genaamd Feret, die wordt gebruikt om de diameter te berekenen. Feret heeft de langst mogelijke diameter, terwijl minFeret de kortste is. De diameter is het gemiddelde van deze twee. In de uitvoermap bevindt zich, naast het planimetrie.xlsx bestand, ook een foto van de sferoïden die zijn gemeten.
Alvorens over te gaan tot de proteoomanalyse, werd de levensvatbaarheid van sferoïden geëvalueerd in de loop van de kweektijd. Niveaus van AK nemen toe tot dag 17, tot ongeveer 7% van de celdood, en vervolgens neemt de dood af tot niveaus van minder dan 5% (Figuur 4A), wat in overeenstemming is met eerder gepubliceerd werk17. Dit protocol toont ook de volledige proteoomanalyse voor het monitoren van het celfenotype. Ten eerste werden de proteomen van THLE-3 en HepG2/C3A platte cellen en sferoïden vergeleken. Door de eerste hoofdcomponent (PC1) te analyseren, is het duidelijk dat er een strikte scheiding is van sferoïde monsters van platte celculturen, en het lijkt erop dat de correlatie van celtype (THLE-3 en HepG2/C3A) niet relevant is (Figuur 4B). Hoewel THLE-3- en HepG2/C3A-sferoïden niet samenklonteren, delen ze vergelijkbare profielen die consistent zijn met de leverfunctie. We demonstreren in dit protocol het voorbeeld van metallothioneïnen, die een rol spelen bij metaalontgifting door de lever. We identificeerden in de proteomics-analyse 2 isovormen die tot overexpressie werden gebracht in sferoïden in vergelijking met platte cellen (MT1E en MT1X) (Figuur 4C). We tonen ook de Gene Ontology (GO) verrijking van beide cellijnen gekweekt als sferoïden. Het koolhydraatmetabolische proces, dat de tricarbonzuurcyclus (TCA-cyclus), de elektronentransportketen (cellulaire ademhaling) en het pyruvaatmetabolisme omvat, is een veel voorkomende term en is verrijkt met zowel HepG2/C3A- als THLE-3-sferoïden (Figuur 4D,E). Cellulaire ontgifting, vetzuur- en cholesterolmetabolisme zijn andere functies die in beide sferoïden zijn verrijkt. Het is bekend dat deze functies samen cruciaal zijn voor de leverfunctie.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig01.jpg"> Figuur 1: Workflow voor sferoïdenkweek en monstervoorbereiding . (A) Experimentele aanpak van 3D-celcultuur. Platte celculturen bij de gewenste samenvloeiing werden trypsiniseerd en gezaaid op een ultralage hechting met 24 putjes die microwells bevatten, waar cellen zichzelf assembleren tot sferoïden. Na 24 uur werden sferoïden overgebracht naar een bioreactor en gekweekt totdat ze klaar zijn voor analyse. (B) Na het verzamelen werden sferoïden gepelleteerd en werden zowel pellets als kweeksupernatans opgeslagen tot verwerking. Histonen16en niet-histonen-eiwitten werden geëxtraheerd, verteerd tot peptiden en geanalyseerd met behulp van massaspectrometrie met hoge resolutie. Ruwe bestanden verkregen uit de massaspectrometrie werden doorzocht in de menselijke database en de gegevens werden verder verwerkt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig02v2.jpg"> Figuur 2: 3D-celkweeksysteem . (A) Onderdelen van de bioreactor. De bioreactor bestaat uit een gasuitwisselings- en bevochtigingskamer met waterparels en een te openen celkamer met twee pluggen voor media-uitwisseling en sferoïdenverzameling. (B) Uitwisseling van bioreactormedia. De bioreactor wordt gevuld met 10 ml groeimedia met behulp van een spuit met een naald. (C) De app voor systeembeheer. De rotatiesnelheid, het CO2-niveau, de temperatuur, het alarmlogboek en andere functionaliteiten kunnen worden geregeld met behulp van de besturingseenheid. (D) Het plaatsen van de bioreactor in de 3D-incubator. Elke bioreactor heeft een bijbehorende motor die de bioreactor langzaam kan laten draaien. (E) Bioreactor in beweging met het toerental (rpm) geregeld door een (C) tablet. Het toerental (rpm) wordt aangepast aan de grootte van de sferoïden. (F) Bioreactoren in de 3D-incubator. In de 3D-incubator passen maximaal 6 individueel aangestuurde bioreactoren. Foto met dank aan Jason Torres Photography. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig02largev2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig03.jpg"> Figuur 3: Fenotypische karakterisering van sferoïden via beeldopname . (A) Semi-geautomatiseerde telling van sferoïden. Na het maken van snapshots van de sferoïden in de bioreactor, wordt het beeld voorbereid voor analyse in FIJI. Elke sferoïde wordt geteld en voor elk van hen wordt een ID-nummer verstrekt. Er wordt een macro gebruikt en de resultaten worden weergegeven met de ID voor de getelde sferoïde, het label (naam van de afbeelding die is geanalyseerd) en het gebied (het aantal pixels dat in de sferoïde is geteld). (B) Planimetrische bepaling van het sferoïde oppervlak. Met behulp van een macro worden het gebied, de omtrek en de diameter van een specifieke sferoïde bepaald. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig04.jpg"> Figuur 4: Proteoomanalyse van leversferoïden . (A) De levensvatbaarheid van sferoïden werd berekend op basis van de afgifte van adenylaatkinase (AK) op kweeksupernatant. De resultaten zijn de middelen van dubbele datapunten ± SD. (B) Principal component analysis (PCA) werd uitgevoerd om het proteoom van THLE-3 en HepG2/C3A platte cellen en sferoïden te vergelijken. (C) Relatieve overvloed aan metallothioneïnen, dit zijn eiwitten die tot expressie worden gebracht door de menselijke lever. Gegevens worden weergegeven als middelen ± SEM. (D) Functioneel gegroepeerde netwerkverrijking toont GO-verrijking voor HepG2/C3A-sferoïden en (E) THLE-3-sferoïden, waarbij alleen het label van de meest significante term per groep wordt weergegeven. Het netwerk is aangelegd met behulp van ClueGo19. De grootte van de knoop vertegenwoordigt de betekenis van de term verrijking. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullend bestand 1: Macroscript voor het tellen van sferoïden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 2: Macro voor planimetrische bepaling van sferoïden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/Supplementary%20File%202.docx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures at JoVE.com

Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures

We presenteren een protocol voor het kweken van hoogreproduceerbare sferoïden en hun fenotypische karakterisering met behulp van beeldopname en proteomics.

Semi-geautomatiseerde fenotypische analyse van functionele 3D-sferoïde celculturen

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell ...

Dit protocol laat zien hoe zeer reproduceerbare sferoïden kunnen worden gekweekt en laat zien hoe proteomische experimenten kunnen worden uitgevoerd om de biologische functie van 3D-structuren te karakteriseren. Onze 3D-cultuur kan tegelijkertijd honderden biologische replicaten produceren in dezelfde bioreactor, en de LC-MS-benadering kan de overvloed van duizenden eiwitten in één experiment meten. De procedure wordt gedemonstreerd door Stephanie Stransky, een postdoc van het lab.Neem om te beginnen de suspensie van HepG2/C3A- en THLE-3-cellen. Tel het aantal cellen en verdun de celsuspensie in volledige groeimedia om 1 miljoen cellen te verkrijgen in een maximaal volume van 1,5 milliliter. Was de putjes van een ultralage opzetplaat, ronde bodemplaat met 24 putjes met 0,5 milliliter groeimedia en centrifugeer gedurende vijf minuten op 3.000 g.Breng de celsuspensie over op de plaat en centrifugeer deze gedurende drie minuten op 120 g. Incubeer vervolgens de plaat om de vorming van sferoïden te initiëren. Breng vervolgens de bioreactor 24 uur voor het overbrengen van de sferoïden in evenwicht door de vochtigheidskamer te vullen met 25 milliliter steriel water en de celkamer met negen milliliter groeimedia met behulp van een spuit van 10 milliliter met een lange naald.Plaats de bioreactor vervolgens 24 uur in een 3D-incubator bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Pipeteer de sferoïden voorzichtig op en neer met behulp van punten van één milliliter met een brede boring om ze los te maken van de ultralage bevestigingsplaat en over te brengen naar een weefselkweekschaaltje. Om eventuele resterende sferoïden op te vangen, wast u de plaat met 0,5 milliliter voorverwarmde groeimedia en brengt u deze over naar de kweekschaal.Evalueer met een lichtmicroscoop de grootte, compactheid en rondheid van de sferoïden om de sferoïden te selecteren die voldoende gevormd zijn. Breng de geselecteerde sferoïde over in de balancerende bioreactor gevuld met vijf milliliter verse groeimedia. Vul vervolgens de hele bioreactor met verse groeimedia.Plaats de bioreactor in de 3D-incubator en pas de rotatiesnelheid aan met behulp van de besturingseenheid. Vervang elke twee tot drie dagen 10 milliliter oude groeimedia door 10 milliliter verse media. Wijzig de rotatiesnelheid elke keer na het vervangen van de media.Kweek de sferoïden gedurende 15 dagen en verdeel ze over twee verse bioreactoren. Open de 3D-app die op de tablet is geïnstalleerd, selecteer de bioreactor en leg het beeld vast. Als alternatief kunt u een zwarte achtergrond achter de bioreactor plaatsen en ervoor zorgen dat er geen licht wordt weerkaatst op de celkamer.Leg het beeld zo dicht mogelijk bij de bioreactor vast. Verzamel vervolgens sferoïden door vijf milliliter media uit de bioreactor te verwijderen met behulp van een spuit die aan een lange naald door de bovenste poort is bevestigd. Zorg ervoor dat de sferoïden afdalen naar het onderste midden van de bioreactor.Open nu de voorste poort en verzamel de sferoïden met behulp van een punt van één milliliter met een brede boring. Breng deze sferoïden over in microcentrifugebuisjes, centrifugeer gedurende vijf minuten op 500 g en gooi de media weg. Was de sferoïde door 200 microliter HBSS toe te voegen om de FBS te verwijderen.Centrifugeer hierna gedurende vijf minuten op 500 g en gooi het supernatant weg. Dompel de sferoïde pellet vervolgens snel onder in vloeibare stikstof om deze in te vriezen en bewaar deze bevroren pellet bij min 80 graden Celsius tot verdere verwerking. Om de cellen te lyseren, neemt u een buis met verzamelde sferoïden en resuspendeert u ze in 25 microliter 5%SDS.Homogeniseer de pellet door op en neer te pipetteren. Los vervolgens één microgram monsters en 10 microliter 0,1% trichloorazijnzuur op. Na het extraheren van het eiwit en het reinigen van de monsters, stelt u de MS-acquisitiemethode in om de MS/MS-spectra te genereren uit de geïdentificeerde peptidesignalen.Breng de plaat vervolgens over in de nanoliter vloeistofchromatografie autosampler. Stel de volledige MS-scan in op 300 tot 1.100 massa-tot-laadverhouding in de Orbitrap. Stel de resolutie in op 120000 en stel het doel van de automatische versterkingsregeling in op 125.Stel vervolgens MS/MS in de Orbitrap in met een sequentieel isolatievenster van 50 massa-tot-ladingsverhouding. Richt het doel van de automatische versterkingsregeling op 400 en stel een hogere energie in op de dissociatie-energie van 30. Volgens de levensvatbaarheidsanalyse van sferoïden nemen de niveaus van adenylaatkinase toe tot dag 17, wat resulteert in ongeveer 7% van de celdood.Daarna daalt het sterftecijfer tot onder de 5%Bovendien onthult een analyse van de eerste hoofdcomponent een duidelijk onderscheid tussen sferoïde monsters en platte celculturen. De proteomische analyse gaf aan dat THLE-3- en HepG2/C3A-sferoïden vergelijkbare profielen hebben die de leverfunctie weerspiegelen. Bovendien vertoonden de sferoïden overexpressie van twee isovormen van metallothioneïnen in vergelijking met platte cellen.Functioneel gegroepeerde netwerken toonden genontologische verrijking voor het koolhydraatmetabolische proces in HepG2/C3A- en THLE-3-sferen. Om te voorkomen dat groeimedia worden gemorst, mag u de voorste poort niet openen of sluiten wanneer de celkamer volledig gevuld is met vloeistof. De monstervoorbereiding en -analyse die in dit protocol worden beschreven, kunnen worden gebruikt om het proteoom van celkweek te onderzoeken met behulp van 2D- en 3D-methoden, evenals weefselmonsters.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Massaspectrometrie en luminogene gebaseerde benaderingen voor karakteriseren Fase I Metabolic competentie van<em&gt; In Vitro</em&gt; Cell Cultures

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Detectie en visualisatie van DNA-schade-geïnduceerde eiwitcomplexen in suspensiecellenculturen met behulp van de proximity-liggingsassay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Semi-automatische Biopanning van bacteriële Display bibliotheken voor Peptide affiniteit reagens detectie en analyse van de resulterende isolaten

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

Dissectie van menselijke netvlies en RPE-vaatvlies voor proteoom-analyse

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

Verbeterde Protocol voor chromatine Immunoprecipitation van muis skeletspieren

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Studie over het metabolisme van zes systemische insecticiden in een nieuw opgerichte cel schorsing cultuur afgeleid van thee (Camellia sinensis L.) Bladeren

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Real-time, semi-geautomatiseerde fluorescerende meting van de luchtweg oppervlak vloeibare pH van primaire menselijke luchtweg epitheelcellen

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Single cell analyse van transcriptioneel actieve allelen door single molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Celvrije productie van proteoliposomen voor functionele analyse en antilichaamontwikkeling gericht op membraaneiwitten

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analyse van neutrale lipidesynthese in Saccharomyces cerevisiae door metabole etikettering en dunne laagchromatografie

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...