Name: semi-automated phenotypic analysis of functional 3d spheroid cell cultures
Uploaded: 2023-08-18T13:10:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures at JoVE.com

מעבדת סידולי מודה לקרן לחקר לוקמיה (מענק מחקר חוקר חדש ע"ש הוליס בראונשטיין), AFAR (פרס גרומיקס של רשת סגול), דירפילד (פרס Xseed), Relay Therapeutics, Merck ומשרד המנהל של NIH (1S10OD030286-01).

<ol>
	<li>Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture+systems:+advantages+and+applications.">3D cell culture systems: advantages and applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).</li><li>Nirmalanandhan, V. S., Duren, A., Hendricks, P., Vielhauer, G., Sittampalam, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+anticancer+agents+in+a+three-dimensional+cell+culture+model.">Activity of anticancer agents in a three-dimensional cell culture model.</a> Assay and Drug Development Technologies. 8 (5), 581-590 (2010).</li><li>Erickson, I. E., Huang, A. H., Chung, C., Li, R. T., Burdick, J. A., Mauck, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+maturation+and+structure-function+relationships+in+mesenchymal+stem+cell-+and+chondrocyte-seeded+hydrogels.">Differential maturation and structure-function relationships in mesenchymal stem cell- and chondrocyte-seeded hydrogels.</a> Tissue Engineering Part A. 15 (5), 1041-1052 (2009).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation.">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biology. 10 (29), (2012).</li><li>Liu, J., Abate, W., Xu, J., Corry, D., Kaul, B., Jackson, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroid+cultures+of+A549+and+HepG2+cells+exhibit+different+lipopolysaccharide+(LPS)+receptor+expression+and+LPS-induced+cytokine+response+compared+with+monolayer+cultures.">Three-dimensional spheroid cultures of A549 and HepG2 cells exhibit different lipopolysaccharide (LPS) receptor expression and LPS-induced cytokine response compared with monolayer cultures.</a> Innate Immunity. 17 (3), 245-255 (2011).</li><li>Khafaga, A. F., Mousa, S. A., Aleya, L., Abdel-Daim, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+(3D)+cell+culture:+a+valuable+step+in+advancing+treatments+for+human+hepatocellular+carcinoma.">Three-dimensional (3D) cell culture: a valuable step in advancing treatments for human hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Cell International. 22 (1), 243 (2022).</li><li>Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocellular+carcinoma.">Hepatocellular carcinoma.</a> The Lancet. 362 (9399), 1907-1917 (2003).</li><li>Sia, D., Llovet, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+cancer:+Translating+'-omics'+results+into+precision+medicine+for+hepatocellular+carcinoma.">Liver cancer: Translating '-omics' results into precision medicine for hepatocellular carcinoma.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 14 (10), 571-572 (2017).</li><li>Tang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+cell+biology+model+of+human+hepatocellular+carcinoma+in+vitro.">A three-dimensional cell biology model of human hepatocellular carcinoma in vitro.</a> Tumour Biology. 32 (3), 469-479 (2011).</li><li>van Zijl, F., Mikulits, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatospheres:+Three+dimensional+cell+cultures+resemble+physiological+conditions+of+the+liver.">Hepatospheres: Three dimensional cell cultures resemble physiological conditions of the liver.</a> World Journal of Hepatology. 2 (1), 1-7 (2010).</li><li>Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+as+an+in+vitro+platform+for+cancer+and+stem+cell+modeling.">Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling.</a> World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).</li><li>Wrzesinski, K., Fey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+and+the+recovery+of+physiological+functionality+in+3D+cultures+in+micro-bioreactors.">Metabolic reprogramming and the recovery of physiological functionality in 3D cultures in micro-bioreactors.</a> Bioengineering(Basel, Switzerland). 5 (1), 22 (2018).</li><li>Breslin, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+The+missing+link+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: The missing link in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).</li><li>Kapalczynska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D+cell+cultures+-+a+comparison+of+different+types+of+cancer+cell+cultures.">2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures.</a> Archives of Medical Science: AMS. 14 (4), 910-919 (2018).</li><li>Wrzesinski, K., Frandsen, H. S., Calitz, C., Gouws, C., Korzeniowska, B., Fey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinostat+3D+cell+culture:+Protocols+for+the+preparation+and+functional+analysis+of+highly+reproducible,+large,+uniform+spheroids+and+organoids.">Clinostat 3D cell culture: Protocols for the preparation and functional analysis of highly reproducible, large, uniform spheroids and organoids.</a> Methods in Molecular Biology. 2273, 17-62 (2021).</li><li>Joseph-Chowdhury, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+level+quantification+of+histone+post-translational+modifications+in+a+3D+cell+culture+model+of+hepatic+tissue.">Global level quantification of histone post-translational modifications in a 3D cell culture model of hepatic tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 183, 63606 (2022).</li><li>Wrzesinski, K., Fey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=After+trypsinisation,+3D+spheroids+of+C3A+hepatocytes+need+18+days+to+re-establish+similar+levels+of+key+physiological+functions+to+those+seen+in+the+liver.">After trypsinisation, 3D spheroids of C3A hepatocytes need 18 days to re-establish similar levels of key physiological functions to those seen in the liver.</a> Toxicology Research. 2, 123-135 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Bindea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClueGO:+a+Cytoscape+plug-in+to+decipher+functionally+grouped+gene+ontology+and+pathway+annotation+networks.">ClueGO: a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks.</a> Bioinformatics. 25 (8), 1091-1093 (2009).</li><li>Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenomics:+The+next+challenge.">Phenomics: The next challenge.</a> Nature Reviews. Genetics. 11 (12), 855-866 (2010).</li><li>Gonneaud, A., Asselin, C., Boudreau, F., Boisvert, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+organoids+by+proteomics.">Phenotypic analysis of organoids by proteomics.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li><li>Avelino, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics+of+3D+cell+culture:+A+useful+tool+to+validate+culture+of+spheroids+and+organoids.">Mass spectrometry-based proteomics of 3D cell culture: A useful tool to validate culture of spheroids and organoids.</a> SLAS Discovery. 27 (3), 167-174 (2022).</li><li>Chiang, J., McManus, L. M., MitchellIn, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liver physiology: Metabolism and Detoxification. Pathobiology of Human Disease. , 1770-1782 (2014).</li><li>Begriche, K., Massart, J., Robin, M. A., Borgne-Sanchez, A., Fromenty, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-induced+toxicity+on+mitochondria+and+lipid+metabolism:+Mechanistic+diversity+and+deleterious+consequences+for+the+liver.">Drug-induced toxicity on mitochondria and lipid metabolism: Mechanistic diversity and deleterious consequences for the liver.</a> Journal of Hepatology. 54 (4), 773-794 (2011).</li><li>Fey, S. J., Korzeniowska, B., Wrzesinski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+to+and+recovery+from+treatment+in+human+liver-mimetic+clinostat+spheroids:+a+model+for+assessing+repeated-dose+drug+toxicity.">Response to and recovery from treatment in human liver-mimetic clinostat spheroids: a model for assessing repeated-dose drug toxicity.</a> Toxicology Research. 9 (4), 379-389 (2020).</li><li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+image+analysis+software+tools+for+exploring+and+understanding+big+image+data+from+cell-based+assays.">Phenotypic image analysis software tools for exploring and understanding big image data from cell-based assays.</a> Cell Systems. 6 (6), 636-653 (2018).</li></ol>

הלה סדיגי פראנדסן מועסקת כמדענית מחקר בחברת CelVivo ApS, יצרנית מערכת ClinoStar. קרולין מיקלסן היא דוקטורנטית תעשייתית המועסקת ב- CelVivo ApS ומבצעת את עבודת הדוקטורט שלה ב- SDU, אודנסה, דנמרק. לכל שאר המחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

הבנת הביולוגיה שמאחורי מבנים תאיים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) חשובה ביותר לידע מקיף יותר על תפקודם. יש עניין גובר בשימוש במודלים תלת-ממדיים לחקר ביולוגיה מורכבת וביצוע סינון רעילות. בעת טיפוח תאים בתלת ממד יש לקחת בחשבון גורמים רבים, כולל הערכה פנוטיפית של מערכת המודל. פנוטיפ מוגדר כקבוצה של מאפיינים נצפים של אורגניזם מסוים, כגון מורפולוגיה, התנהגות, תכונות פיזיולוגיות וביוכימיות20.
בפרוטוקול זה, אנו מדגימים כיצד ניתן לבצע ניסויים בפרוטאומיקה מכמה ספרואידים וניתן להשתמש בהם כדי לעקוב אחר פנוטיפ הכבד הטיפוסי. ספקטרומטריית מסות הפכה לשיטה מיושמת באופן נרחב לאפיון תאים תלת-ממדיים, ומאפשרת לחקור מגוון שאלות ביולוגיות12,16,21,22. לניתוח פרוטאום מקיף, מומלץ להשתמש לפחות ב-20 מיקרוגרם של חומר מוצא חלבוני, שממנו מוזרק 1 מיקרוגרם לספקטרומטר המסות. חשוב לציין כי הוספת פחות דגימה עלולה להוביל לאובדן רגישות, והוספת דגימה נוספת תחמיר בהדרגה את איכות הכרומטוגרפיה ובסופו של דבר תוביל לחסימת העמודה. במחקר זה, הראינו כי הספרואידים HepG2/C3A ו- THLE-3 מועשרים בחלבונים חשובים ממחזור גליקוליזה ו- TCA, שהם מסלולי כבד ספציפיים והם קריטיים לשמירה על רמות הגלוקוז בדם ולייצור אנרגיה23,24. למעשה, ניתוח ספקטרומטריית מסות מספק לא רק מידע ברמת החלבון, אלא גם מאפשר חקירה של שינויים לאחר תרגום חלבון, כפי שהוצג קודם לכן על ידי הקבוצה שלנו16.
היבט נוסף שיש לקחת בחשבון במחקרים פנוטיפיים תלת ממדיים הוא מספר וגודל הספרואידים. מלבד הפיכת הניסויים לניתנים יותר לשחזור, ספירת מספר הספרואידים וקביעת גודלם חיונית כדי לקבוע מתי לפצל את התרבית למספר ביוריאקטורים, שכן מספר המבנים התלת-ממדיים בתוך כלי יכול להשפיע על גודל הספרואידים ועל רמות הפעילות המטבולית. עם זאת, חשוב להדגיש כי מספר וגודל הספרואידים תלויים בקו התא, מספר התאים ההתחלתי, תהליך הפיצול וזמן האיסוף. פרטים על תרבית ספרואידים HepG2/C3A, כגון מספר התאים לכל ספרואידים, תכולת חלבונים וגודל כפונקציה של גיל, סופקו על ידי פיי, קורז'ניובסקה וז'סינסקי25. לניתוח מדויק ומוצלח בשיטה החצי-אוטומטית המתוארת כאן, השלב הקריטי ביותר הוא תמונה טובה של הספרואידים. לשם הפשטות, התמונה יכולה להילקח עם טלפון או טאבלט, אבל הרזולוציה שלה צריך להישמר גבוה ככל האפשר. מכיוון שתמונות ניתנות להשגה במהירות, הן מאפשרות לניסויי סינון בקנה מידה גדול לדמיין תכונות פנוטיפיות ספציפיות או לחקור תגובות לטיפול תרופתי. לכן, בשל המספר ההולך וגדל של בדיקות מבוססות תאים, פותחו במהלך 10 השנים האחרונות מספר תוכנות קוד פתוח לניתוח תמונה26. בפרוטוקול זה, אנו מתארים מערכת חצי אוטומטית המשתמשת בתוכנה FIJI18 כדי לספור ולמדוד את גודל הספרואידים. הצגנו סקריפטים (פקודות תכנות פשוטות) כדי להגדיר רצף של פעולות אלגוריתמיות שניתן להחיל על אוסף תמונות, מה שהופך את הניתוח לתהליך קל ומהיר. עם זאת, בהתאם למאפיין של הספרואידים, יש להשתמש במדידה ידנית. לדוגמה, אם הספרואידים שקופים מדי, כתב FIJI יהיה לא מדויק. אגב, אחד הקריטריונים החשובים ביותר עבור שיטה זו לעבוד הוא קומפקטיות של spheroids. מאפיין זה יתרום לניגודיות צבעים משופרת יותר בין הספרואידים לבין הרקע, דבר הכרחי כדי שהשיטה תהיה מדויקת.
לסיכום, מלבד הצגת מתודולוגיה לגידול ספרואידים בעלי יכולת שחזור גבוהה, תוארה גם מערכת חצי אוטומטית בשילוב אפיון פנוטיפי באמצעות לכידת תמונה ופרוטאומיקה. אנו מצפים שארגז כלים זה לניתוח תאים תלת-ממדיים יהפוך לחזק יותר עם תוכנת ניתוח תמונה אוטומטית מלאה וספקטרומטרים של מסות מהדור הבא.

תרביות תאים במבחנה הוכחו כהכרחיות ולא יסולא בפז בביסוס ידע בסיסי בביולוגיה. חלק גדול מההבנה המדעית בביולוגיה ובסרטן בפרט הגיע ממערכת התרבית הדו-ממדית, כלומר תאים הגדלים בשכבה חד-שכבתית. למרות שתרבית דו-ממדית הייתה מערכת תרביות התאים הדומיננטית, יש לה חסרונות רבים שעלולים לחנוק התקדמות ביולוגית נוספת. לדוגמה, תרביות דו-ממדיות חסרות אינטראקציות תא-תא החשובות לאיתות ולהתרבות של תאים1. עד כה, מערכות תרבית תלת-ממדיות הוכחו כמודלים טובים יותר של בידול, תגובה לתרופות, פלישת גידולים וביולוגיה 2,3,4,5. מידול תלת ממדי של סרטן ממאיר חיוני במיוחד בשל העלייה באוכלוסייה המזדקנת והתמותה מסרטן. קרצינומה הפטוצלולרית (HCC) היא אחד הגורמים המובילים לתמותה הקשורה לסרטן ברחבי העולם, ולעתים קרובות יש לה פרוגנוזה תהומית6. HCC ידוע כבעל שיעור ריפוי נמוך, תגובה לקויה לתרופות ושיעור גבוה של הופעה חוזרת 6,7,8. פותחו מספר מודלים תלת-ממדיים עבור כבד תקין ו-HCC המחקים את הפיזיולוגיה של רקמת כבד תקינה וממאירה 9,10.
חלק מהמערכות התלת-ממדיות הנוכחיות כוללות שכבות-על נוזליות, ביוריאקטורים, הידרוג'ל, פיגומים ומבנים מודפסים בתלת-ממד. ספרואידים הנוצרים בביוריאקטורים מספקים באופן ספציפי יתרונות ייחודיים מכיוון שהם מחקים את התפלגות הגידול של חשיפה לחומרי מזון, חילופי גזים והתפשטות תאים/ שקט 11. ביוריאקטורים מתאימים במיוחד למודלים של סרטן בשל קלות השימוש בהם, מדרגיות גדולה, דיפוזיה תזונתית ונגישות11. בנוסף, ביוריאקטורים יכולים לאפשר ניסויים בתפוקה גבוהה, יכולת שחזור גבוהה יותר והפחתת טעויות אנוש. הביוריאקטור המשמש במחקר זה ייחודי משום שהוא מדמה מערכת של כבידה מופחתת, אשר ממזערת כוחות גזירה משבשים המופעלים בביוריאקטורים טיפוסיים ומאפשרת שחזור טוב יותר12. כוח הכבידה הרב-כיווני וההפחתה בכוחות הגזירה מאפשרים לתאים להתפתח באופן פיזיולוגי יותר. כראיה, תאי HepG2/C3A הגדלים תחת מתודולוגיה זו מפתחים אברונים כדוריים המייצרים רמות in vivo של ATP, אדנילט קינאז, אוריאה וכולסטרול13,14. בנוסף, הטיפולים התרופתיים במערכת תלת ממדית זו מתקדמים ואוטומטיים יותר בהשוואה לתרביות דו-ממדיות. בתרביות דו-ממדיות, טיפולים תרופתיים חייבים לעתים קרובות להיות במסלול זמן קצר בשל הצורך טריפסיניזציה ושמירה על בריאות התא. עם זאת, במקרה שלנו, אנו יכולים לבצע טיפולים תרופתיים ארוכי טווח של ספרואידים ללא צורך לשבש את המבנה והפיזיולוגיה של התאים. לכן, המעבר מתרבויות דו-ממדיות לתלת-ממדיות הוא הכרחי כדי למדל טוב יותר תופעות ביולוגיות in vivo והתפתחות מדעית נוספת.
מאמר זה מציג מתודולוגיה לגידול ספרואידים בעלי יכולת שחזור גבוהה (איור 1 ואיור 2) ומראה מערכת חצי-אוטומטית לאפיון פנוטיפית של מבנים תלת-ממדיים (איור 3). ברמת התמונה אנו מספקים מידע על ספירה ומדידה של שטח הספרואידים (איור 3). באמצעות שימוש בשיטות ספקטרומטריית מסות, אנו מראים כיצד ניתן להשתמש בפרוטאומיקה כדי להעריך תפקודים ביולוגיים מסוימים (איור 4). על ידי איסוף וניתוח נתונים אלה, אנו מקווים לשפר את ההבנה של הביולוגיה שמאחורי מערכות תרביות תאים תלת-ממדיות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>2239480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1481754</td>
			<td>Luer lock tip, graduated to 12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L wide bore pipet tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14222703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L wide bore pipet tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14222730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Orochem filter plate</td>
			<td>Orochem&#160;</td>
			<td>OF1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well skirted plate</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-96-FS-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well vacuum manifold</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAVM0960R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6141-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bronchial Epithelial Cell Growth Medium (BEGM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture grade water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-055-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoReactor</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bioreactor for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoStar incubator</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>CO2 incubator for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT17205CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elplasia 24-well round bottom ultra-low attachment plate containing microwells</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>28905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT21022CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hEGF</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell vios 160i</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>51033557</td>
			<td>CO2 incubator for 2D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W5-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25015CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25025CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB Resin 30 &#181;m</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td>
			<td>High resolution mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAULA microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT3002CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerkinElmer Victor X2 multilabel microplate reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH paper</td>
			<td>Hydrion</td>
			<td>93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoetanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A260-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette gun</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z666467 (Milipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil-Pur resin</td>
			<td>MSWIL</td>
			<td>R13.AQ.003</td>
			<td>120 &#197; pore size, C18-AQ phase, 3 &#956;M bead size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V511A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator (96-well plates)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15308325</td>
			<td>Savant SPD1010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile hood</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>1375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile serological pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S-trap</td>
			<td>Protifi</td>
			<td>C02-micro-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle (18 G)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14817100</td>
			<td>3&#34; length, 0.05&#34; diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>28904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z258415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated phenotypic analysis of functional 3d spheroid cell cultures

אנו מציגים פרוטוקול המתאר את התכונות והיתרונות של שימוש באינקובטור קלינוסטט עצמאי לגידול, טיפול וניטור תרביות תאים תלת ממדיות. הקלינוסטט מחקה סביבה שבה תאים יכולים להתאסף כספרואידים בעלי יכולת שכפול גבוהה עם כוחות גזירה נמוכים ודיפוזיה של חומרי מזון פעילים. אנו מראים כי הן הפטוציטים הסרטניים והן הפטוציטים שאינם סרטניים (קווי תאים HepG2/C3A ו-THLE-3) דורשים 3 שבועות של גדילה לפני השגת תפקודים דומים לתאי כבד. פרוטוקול זה מדגיש את הנוחות של שימוש באינקובטורים לתאים תלת ממדיים עם מצלמות המנטרות את גדילת התא, שכן ניתן לצלם תמונות כדי לספור ולמדוד ספרואידים בעת הטיפול. אנו מתארים את ההשוואה בין קווי תאים THLE-3 ו- HepG2/C3A, ומראים כיצד ניתן לגדל קווי תאים לא סרטניים כמו גם תאים סרטניים אימורטליים. אנו מדגימים ומדגימים כיצד ניתן לבצע ניסויים בפרוטאומיקה מכמה ספרואידים, שניתן לאסוף מבלי להפריע לאיתות התא, כלומר ללא צורך בטריפסיניזציה. אנו מראים כי ניתוח פרוטאומיקה יכול לשמש לניטור פנוטיפ הכבד הטיפוסי של חילוף החומרים בשרשרת הנשימה וייצור חלבונים המעורבים בניקוי רעלים ממתכות ולתאר מערכת חצי-אוטומטית לספירה ומדידה של שטח הספרואיד. בסך הכל, הפרוטוקול מציג ארגז כלים הכולל אפיון פנוטיפי באמצעות לכידת תמונה וצינור פרוטאומיקה לניסויים במודלים תלת ממדיים של תרביות תאים.

בפרוטוקול הזה אנו מתארים את המאפיינים של אינקובטור תאי תלת-ממד חדשני ללא לחץ, מערכת שתוכננה במיוחד לגידול ספרואידים תלת-ממדיים (איור 2). ביצענו אופטימיזציה של הפרוטוקול לתרבית תלת-ממדית של קווי תאים THLE-3 ו-HepG2/C3A. הפרוטוקול המתואר כאן פשוט לשימוש ומאפשר שחזור וגידול חסכוני של > 100 ספרואידים לכל ביוריאקטור. ברגע שהם מגיעים לביוריאקטור, הספרואידים מטופלים באופן דומה לתאים הנשמרים בתרבית דו-ממדית. תנאי גדילה אופטימליים מושגים על-ידי החלפת המדיה פעמיים עד שלוש בשבוע (איור 2B) והתאמת מהירות הסיבוב בהתאם לגדילה ולגודל של הספרואידים (איור 2C). המערכת הזו, שבה ספרואידים תלת-ממדיים מתורבתים בביוריאקטורים מסתובבים (איור 2E,F), מספקת סביבת גידול אופטימלית למבנים תלת-ממדיים על-ידי חשיפת הספרואידים לכמות שווה ונמוכה מאוד של כוח גזירה.
הראינו בעבר כיצד ניתן להשתמש בספרואידים לניתוח שינוי כרומטין16. כאן אנו מדגימים בפירוט כיצד להשיג ספרואידים בכבד וכיצד ניתן לערוך ניסויים בפרוטאומיקה לצורך ניתוח הפרוטאום המלא (איור 1). בקצרה, הפרוטוקול החל על ידי שימוש בתאים שטוחים THLE-3 או HepG2/C3A עד שהתרבית הגיעה למפגש של 80%. כדי להשתמש בתאי תרבית כספרואידים, כ-2,000 תאים צופו בלוח התקשרות נמוך במיוחד שהכיל מיקרו-בארות כדי לאפשר להם לצבור את עצמם, ולאחר מכן, ספרואידים שנוצרו הועברו לביוריאקטור (איור 1A). למרות שהם פעילים מבחינה תפקודית לאחר 3 שבועות בתרבית, כפי שהודגם בעבר17, אנו מראים תוצאות מספרואידים שנאספו לאחר 36 ימים בתרבית עבור פרוטוקול זה. לאחר האיסוף, ספרואידים סובבו כלפי מטה, וגם גלולה וגם סופרנאטנט אוחסנו לניתוח. כדאיות התא הוערכה מהסופרנאטנט לכימות אדנילט קינאז המשתחרר על ידי תאים פגומים, כפי שתואר קודם לכן17. חלבונים תאיים הופקו מכדורית התא, והפרוטאום המלא נותח על-ידי ספקטרומטריית מסות ברזולוציה גבוהה (איור 1B).
פרוטוקול זה גם מדגים שיטה חצי-אוטומטית לספירת ספרואידים (איור 3A) באמצעות תוכנת עיבוד התמונה הציבורית FIJI (Fiji Is Just ImageJ)18. יש לקחת תמונה באיכות טובה של הספרואיד לצורך הניתוח, ויש לקחת בחשבון כמה פרמטרים כאמור בסעיף 5. לאחר מכן, לאחר הכנת התמונה לניתוח, נעשה שימוש בסקריפט מאקרו (קובץ משלים 1) לספירת הספרואידים. המאקרו פועל על-ידי יצירת תיקייה בשם FIJI Spheroids counting, בתוך התיקיה שבה ממוקמות התמונות הספרואידים. בתיקיה זו, כל המידע מהניתוח נשמר; זה כולל תמונה של הספרואידים שנספרו, עם מספר תעודת זהות על כל ספרואידים. הוא כולל גם קובץ אקסל שנקרא ספירה ספרואידית. קובץ זה מכיל את אזור הפיקסלים ואת מספר הזיהוי של כל ספרואיד שנספר. הנתונים המתאימים לתמונה מנותחת אחת מוצגים בכל כרטיסיה של הקובץ. הכרטיסייה מסומנת לפי שם התמונה המנותחת. מכיוון שגודל הספרואיד יכול להיפגע על ידי גורמים רבים, כולל מספר המבנים בתוך כלי הדם וטיפול תרופתי, חשוב גם לעקוב אחר שטח הפנים שלהם (פלנימטריה). סקריפט המאקרו המוצג כאן (קובץ משלים 2) פועל על-ידי מדידת האזורים השחורים, המתאימים לכדוריות בתמונה (איור 3B). הפלט נאסף בקובץ שנקרא planimetry.xlsx, המכיל את השטח הנמדד, ההיקף והקוטר של כל ספרואיד. יש גם מדידה בשם Feret, המשמשת לחישוב הקוטר. Feret הוא הקוטר הארוך ביותר האפשרי, בעוד minFeret הוא הקצר ביותר. הקוטר הוא הממוצע של שני אלה. בתוך תיקיית הפלט, מלבד קובץ הפלנימטריה.xlsx, יש גם תמונה של הספרואידים שנמדדו.
לפני שנמשיך לניתוח הפרוטאום, הוערכה הכדאיות של הספרואידים לאורך זמן התרבית. רמות AK עולות עד היום ה-17 ומגיעות לכ-7% ממקרי המוות של תאים, ואז המוות יורד לרמות מתחת ל-5% (איור 4A), בהתאם לעבודה17 שפורסמה בעבר. פרוטוקול זה מציג גם את ניתוח הפרוטאום המלא לניטור פנוטיפ התא. ראשית, הושוו הפרוטאומים של התאים השטוחים THLE-3 ו-HepG2/C3A והספרואידים. על-ידי ניתוח המרכיב העיקרי הראשון (PC1), ברור שיש הפרדה קפדנית של דגימות ספרואידים מתרביות תאים שטוחים, ונראה שהמתאם של סוג התא (THLE-3 ו-HepG2/C3A) אינו רלוונטי (איור 4B). למרות שספרואידים THLE-3 ו-HepG2/C3A אינם מתקבצים יחד, הם חולקים פרופילים דומים התואמים את תפקודי הכבד. אנו מדגימים בפרוטוקול זה את הדוגמה של מטלותיונינים, שיש להם תפקיד בניקוי רעלים ממתכות המבוצע על ידי הכבד. זיהינו בניתוח הפרוטאומיקה 2 איזופורמים המבוטאים יתר על המידה בספרואידים בהשוואה לתאים שטוחים (MT1E ו-MT1X) (איור 4C). אנו מראים גם את העשרת האונטולוגיה הגנטית (GO) של שני קווי התאים שגדלו כספרואידים. התהליך המטבולי של פחמימות, הכולל את מחזור החומצה הטריקרבוקסילית (מחזור TCA), שרשרת הובלת האלקטרונים (נשימה תאית) ומטבוליזם של פירובט, הוא מונח שכיח ומועשר הן בספרואידים HepG2/C3A והן ב-THLE-3 (איור 4D,E). ניקוי רעלים מתאים, חומצות שומן ומטבוליזם של כולסטרול הם תפקידים נוספים המועשרים בשני הספרואידים. יחד, תפקודים אלה ידועים כחיוניים לתפקוד הכבד.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig01.jpg"> איור 1: זרימת עבודה עבור תרבית ספרואידים והכנת דגימה . (A) גישה ניסיונית תלת-ממדית לתרבית תאים. תרביות תאים שטוחות במפגש הרצוי עברו טריפסינזציה ונזרעו על צלחת חיבור נמוכה במיוחד 24 בארות המכילה מיקרו-בארות, שבה התאים מתאספים בעצמם לספרואידים. לאחר 24 שעות, ספרואידים הועברו לביוריאקטור וטופחו עד שהם מוכנים לניתוח. (B) לאחר האיסוף, כדוריות היו גלולות ואוחסנו הן כדוריות והן סופרנאטנט תרבית עד לעיבוד. חלבוני היסטונים16ושאינם היסטונים חולצו, עוכלו לפפטידים ונותחו על ידי ספקטרומטריית מסות ברזולוציה גבוהה. קבצים גולמיים שהתקבלו מספקטרומטריית המסות נבדקו מול מסד הנתונים האנושי, והנתונים עובדו עוד יותר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig02v2.jpg"> איור 2: מערכת תלת-ממדית של תרביות תאים . (A) חלקי ביוריאקטורים. הביוריאקטור מורכב מתא חילופי גזים ולחות המכיל חרוזי מים ותא תא הניתן לפתיחה עם שני תקעים להחלפת מדיה ואיסוף ספרואידים. (B) חילופי מדיה של ביוריאקטור. הביוריאקטור מלא ב -10 מ"ל של מצע צמיחה באמצעות מזרק עם מחט. (C) אפליקציית בקרת המערכת. ניתן לשלוט במהירות הסיבוב, רמת CO2, טמפרטורה, יומן אזעקה ופונקציות אחרות באמצעות יחידת הבקרה. (ד) הצבת הביוריאקטור באינקובטור התלת-ממדי. לכל ביוריאקטור יש מנוע מקושר שיכול לסובב את הביוריאקטור באיטיות. (E) ביוריאקטור בתנועה עם מהירות (סל"ד) הנשלטת על ידי טבליה (C). המהירות (סל"ד) מותאמת בהתאם לגודל הספרואידים. (F) ביוריאקטורים בתוך אינקובטור תלת-ממדי. החממה התלת-ממדית יכולה להכיל עד 6 ביוריאקטורים בשליטה אישית. התמונה באדיבות ג'ייסון טורס צילום. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig02largev2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig03.jpg"> איור 3: אפיון פנוטיפי של ספרואידים באמצעות לכידת תמונה . (A) ספירה ספרואידית חצי-אוטומטית. לאחר צילום תמונות של הספרואידים בביוריאקטור, התמונה מוכנה לניתוח בפיג'י. כל ספרואיד נספר, ולכל אחד מהם ניתן מספר תעודת זהות. נעשה שימוש במאקרו, והתוצאות מוצגות ומציגות את המזהה של הספרואיד שנספר, את התווית (שם התמונה שנותחה) ואת האזור (מספר הפיקסלים שנספרו בספרואיד). (B) קביעה פלנימטרית של שטח ספרואידי. באמצעות מאקרו נקבעים השטח, ההיקף והקוטר של ספרואיד מסוים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig04.jpg"> איור 4: ניתוח פרוטאום של ספרואידים בכבד . (A) הכדאיות של ספרואידים חושבה בהתבסס על שחרור אדנילט קינאז (AK) על תרבית סופרנטנט. התוצאות הן אמצעי לנקודות נתונים כפולות ± SD. (B) ניתוח רכיבים עיקרי (PCA) בוצע כדי להשוות את הפרוטאום של תאים שטוחים THLE-3 ו- HepG2/C3A וספרואידים. (C) שפע יחסי של מטלותיונינים, שהם חלבונים המבוטאים על-ידי הכבד האנושי. הנתונים מיוצגים כאמצעים ± SEM. (D) רשת מקובצת פונקציונלית מציגה העשרת GO עבור ספרואידים HepG2/C3A ו-(E) ספרואידים THLE-3, כאשר רק התווית של המונח המשמעותי ביותר לכל קבוצה מוצגת. הרשת נבנתה באמצעות ClueGo19. גודל הצומת מייצג את המונח משמעות העשרה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
קובץ משלים 1: סקריפט מאקרו לספירה ספרואידית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 2: מאקרו לקביעה פלנימטרית של ספרואידים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/Supplementary%20File%202.docx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures at JoVE.com

Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures

אנו מציגים פרוטוקול לגידול ספרואידים בעלי יכולת שחזור גבוהה ואפיונם הפנוטיפי באמצעות לכידת תמונה ופרוטאומיקה.

ניתוח פנוטיפי חצי אוטומטי של תרביות תאים ספרואידים תלת-ממדיים פונקציונליים

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell ...

פרוטוקול זה מדגים כיצד לגדל ספרואידים בעלי יכולת שחזור גבוהה ומראה כיצד ניתן לבצע ניסויים פרוטאומיים כדי לאפיין את הפונקציה הביולוגית של מבנים תלת-ממדיים. התרבית התלת-ממדית שלנו יכולה לייצר בו זמנית מאות עותקים ביולוגיים משוכפלים באותו ביוריאקטור, וגישת LC-MS יכולה למדוד את השפע של אלפי חלבונים בניסוי יחיד. מי שתדגים את ההליך תהיה סטפני סטרנסקי, פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה.כדי להתחיל, קח את התרחיף של תאי HepG2/C3A ו- THLE-3. ספרו את מספר התאים ודללו את תרחיף התא במצע גדילה מלא כדי להשיג מיליון תאים בנפח מרבי של 1.5 מיליליטר. לשטוף את הבארות של מצורף נמוך במיוחד, צלחת תחתונה עגולה 24 היטב עם 0.5 מיליליטר של מדיה צמיחה צנטריפוגה ב 3, 000 גרם במשך חמש דקות.מעבירים את מתלה התא לצלחת וצנטריפוגות אותו למשך שלוש דקות במשקל 120 גרם. לאחר מכן, לדגור על הצלחת כדי ליזום היווצרות ספרואידים. לאחר מכן, אזנו את הביוריאקטור 24 שעות לפני העברת הספרואידים על ידי מילוי תא הלחות ב -25 מיליליטר מים סטריליים ואת תא התא בתשעה מיליליטר של מצע גידול באמצעות מזרק 10 מיליליטר עם מחט ארוכה.לאחר מכן, הניחו את הביוריאקטור באינקובטור תלת ממדי למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. מקציפים בעדינות את הספרואידים מעלה ומטה באמצעות קצוות ברוחב מיליליטר אחד כדי לנתק אותם מצלחת החיבור הנמוכה במיוחד ולהעביר אותם לצלחת תרבית רקמות. כדי ללכוד את כל הספרואידים שנותרו, שטפו את הצלחת עם 0.5 מיליליטר של מצע צמיחה שחומם מראש והעבירו אותם לצלחת התרבית.באמצעות מיקרוסקופ אור, להעריך את הגודל, קומפקטיות, מעוגלות של spheroids כדי לבחור את אלה שנוצרו כראוי. העבירו את הספרואיד שנבחר לביוריאקטור המאזן המלא בחמישה מיליליטר של מצע גידול טרי. לאחר מכן, מלאו את כל הביוריאקטור במצע גידול טרי.מקם את הביוריאקטור באינקובטור התלת-ממדי והתאם את מהירות הסיבוב באמצעות יחידת הבקרה. החלף 10 מיליליטר של מצע צמיחה ישן עם 10 מיליליטר של מדיה טרייה כל יומיים-שלושה. שנה את מהירות הסיבוב בכל פעם לאחר החלפת המדיה.תרביתו את הספרואידים במשך 15 יום וחלקו אותם בין שני ביוריאקטורים טריים. פתח את אפליקציית התלת-ממד המותקנת בטאבלט, בחר את הביוריאקטור וצלם את התמונה. כחלופה, מקמו רקע שחור מאחורי הביוריאקטור וודאו שלא מוחזר אור על תא התא.צלם את התמונה קרוב ככל האפשר לביוריאקטור. לאחר מכן, אספו ספרואידים על ידי הסרת חמישה מיליליטר של מדיה מהביוריאקטור באמצעות מזרק המחובר למחט ארוכה דרך היציאה העליונה. ודא שהספרואידים יורדים למרכז התחתון של הביוריאקטור.כעת, פתחו את היציאה הקדמית ואספו את הספרואידים באמצעות קצה נשא ברוחב מיליליטר. מעבירים את הספרואידים האלה לצינורות מיקרו צנטריפוגות, צנטריפוגות במשקל 500 גרם למשך חמש דקות, ומשליכים את המדיה. לשטוף את הספרואיד על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של HBSS כדי להסיר את FBS.לאחר מכן, לבצע צנטריפוגה ב 500g במשך חמש דקות ולהשליך את supernatant. לאחר מכן, טבלו את כדורית הספרואיד במהירות בחנקן נוזלי כדי להקפיא אותה ואחסנו את הגלולה הקפואה במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לעיבוד נוסף. כדי ליזה את התאים, לקחת צינור של spheroids שנאספו ולהשעות אותם מחדש ב 25 מיקרוליטר של 5% SDS.הומוגניזציה של הגלולה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. לאחר מכן, להמיס מיקרוגרם אחד של דגימות ו 10 מיקרוליטר של 0.1% חומצה trichloroacetic. לאחר מיצוי החלבון וניקוי הדגימות, הגדר את שיטת רכישת הטרשת הנפוצה כדי ליצור את ספקטרום MS/MS מהאותות הפפטידים שזוהו.לאחר מכן, להעביר את הצלחת לתוך autosampler כרומטוגרפיה נוזלית ננוליטר. הגדר את סריקת MS המלאה ליחס מסה לטעינה של 300 ל- 1, 100 ב- Orbitrap. התאם את הרזולוציה ל- 120000 והגדר את יעד בקרת ההגבר האוטומטי ל- 125.לאחר מכן, הגדר MS/MS באורביטרפ עם חלון בידוד רציף של יחס מסה למטען של 50. כוונו את יעד בקרת ההגברה האוטומטית ל-400 והגדירו אנרגיית דיסוציאציה התנגשות אנרגטית גבוהה יותר של 30. על פי ניתוח כדאיות של ספרואידים, רמות אדנילט קינאז עולות עד היום ה -17, וכתוצאה מכך כ -7% מהמוות התאים.לאחר מכן, שיעור התמותה יורד אל מתחת ל-5% יתר על כן, ניתוח של המרכיב העיקרי הראשון מגלה הבחנה ברורה בין דגימות ספרואידים לבין תרביות תאים שטוחים. הניתוח הפרוטאומי הצביע על כך שלספרואידים THLE-3 ו- HepG2/C3A יש פרופילים דומים המשקפים את תפקוד הכבד. בנוסף, הספרואידים הראו ביטוי יתר של שני איזופורמים של מטלותיונינים בהשוואה לתאים שטוחים.רשתות מקובצות פונקציונלית הראו העשרה אונטולוגית גנטית לתהליך חילוף החומרים של פחמימות בכדורי HepG2/C3A ו-THLE-3. כדי למנוע שפיכת מצעי גדילה, אין לפתוח או לסגור את היציאה הקדמית כאשר תא התא מלא במלואו בנוזל. הכנת הדגימה וניתוחה המתוארים בפרוטוקול זה יכולים לשמש לחקר הפרוטאום של תרבית תאים בשיטות דו-ממדיות ותלת-ממדיות, כמו גם דגימות רקמות.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

ספקטרומטריית מסה וגישות מבוססי Luminogenic לאפיון שלב I מטבולית כשירות של<em&gt; במבחנה</em&gt; תא תרבויות

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

איתור ויזואליזציה של DNA הנזק- Induced חלבון קומפלקסים ההשעיה תא תרבויות באמצעות Assay קשירת הקרבה

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning חצי אוטומטי של התצוגה חיידקי ספריות פפטיד זיקה ריאגנט גילוי וניתוח של מבודד וכתוצאה מכך

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

דיסקציה של הרשתית האנושית ואת RPE-Choroid לניתוח פרוטיאומיה מבנית

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

פרוטוקול משופרת עבור כרומטין Immunoprecipitation של שרירי השלד העכבר

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

מחקר על חילוף החומרים של שישה קוטלי חרקים מערכתית החדש הוקמה התא תרבות ההשעיה נגזר תה (Camellia Sinensis L.) עלים

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

בזמן אמת, חצי אוטומטי מדידה פלורסנט של משטח נתיב האוויר הנוזלי של ה-pH העיקרי של תאים אפיתל דרכי האוויר האנושי

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

ניתוח תא יחיד של אללים פעילים בתעתיק על ידי מולקולה אחת FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

ייצור ללא תאים של פרוטאוליפוזומים לניתוח פונקציונלי ופיתוח נוגדנים המכוונים לחלבוני ממברנה

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

ניתוח של סינתזת שומנים נייטרלית ב cerevisiae Saccharomyces על ידי תיוג מטבולי כרומטוגרפיה שכבה דקה

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...