Name: semi-automated phenotypic analysis of functional 3d spheroid cell cultures
Uploaded: 2023-08-18T13:10:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures at JoVE.com

Лаборатория Sidoli выражает благодарность Фонду исследования лейкемии (грант Холлиса Браунштейна для новых исследователей), AFAR (премия Sagol Network GerOmics), Deerfield (премия Xseed), Relay Therapeutics, Merck и офису директора NIH (1S10OD030286-01).

<ol>
	<li>Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture+systems:+advantages+and+applications.">3D cell culture systems: advantages and applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).</li><li>Nirmalanandhan, V. S., Duren, A., Hendricks, P., Vielhauer, G., Sittampalam, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+anticancer+agents+in+a+three-dimensional+cell+culture+model.">Activity of anticancer agents in a three-dimensional cell culture model.</a> Assay and Drug Development Technologies. 8 (5), 581-590 (2010).</li><li>Erickson, I. E., Huang, A. H., Chung, C., Li, R. T., Burdick, J. A., Mauck, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+maturation+and+structure-function+relationships+in+mesenchymal+stem+cell-+and+chondrocyte-seeded+hydrogels.">Differential maturation and structure-function relationships in mesenchymal stem cell- and chondrocyte-seeded hydrogels.</a> Tissue Engineering Part A. 15 (5), 1041-1052 (2009).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation.">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biology. 10 (29), (2012).</li><li>Liu, J., Abate, W., Xu, J., Corry, D., Kaul, B., Jackson, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroid+cultures+of+A549+and+HepG2+cells+exhibit+different+lipopolysaccharide+(LPS)+receptor+expression+and+LPS-induced+cytokine+response+compared+with+monolayer+cultures.">Three-dimensional spheroid cultures of A549 and HepG2 cells exhibit different lipopolysaccharide (LPS) receptor expression and LPS-induced cytokine response compared with monolayer cultures.</a> Innate Immunity. 17 (3), 245-255 (2011).</li><li>Khafaga, A. F., Mousa, S. A., Aleya, L., Abdel-Daim, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+(3D)+cell+culture:+a+valuable+step+in+advancing+treatments+for+human+hepatocellular+carcinoma.">Three-dimensional (3D) cell culture: a valuable step in advancing treatments for human hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Cell International. 22 (1), 243 (2022).</li><li>Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocellular+carcinoma.">Hepatocellular carcinoma.</a> The Lancet. 362 (9399), 1907-1917 (2003).</li><li>Sia, D., Llovet, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+cancer:+Translating+'-omics'+results+into+precision+medicine+for+hepatocellular+carcinoma.">Liver cancer: Translating '-omics' results into precision medicine for hepatocellular carcinoma.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 14 (10), 571-572 (2017).</li><li>Tang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+cell+biology+model+of+human+hepatocellular+carcinoma+in+vitro.">A three-dimensional cell biology model of human hepatocellular carcinoma in vitro.</a> Tumour Biology. 32 (3), 469-479 (2011).</li><li>van Zijl, F., Mikulits, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatospheres:+Three+dimensional+cell+cultures+resemble+physiological+conditions+of+the+liver.">Hepatospheres: Three dimensional cell cultures resemble physiological conditions of the liver.</a> World Journal of Hepatology. 2 (1), 1-7 (2010).</li><li>Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+as+an+in+vitro+platform+for+cancer+and+stem+cell+modeling.">Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling.</a> World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).</li><li>Wrzesinski, K., Fey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+and+the+recovery+of+physiological+functionality+in+3D+cultures+in+micro-bioreactors.">Metabolic reprogramming and the recovery of physiological functionality in 3D cultures in micro-bioreactors.</a> Bioengineering(Basel, Switzerland). 5 (1), 22 (2018).</li><li>Breslin, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+The+missing+link+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: The missing link in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).</li><li>Kapalczynska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D+cell+cultures+-+a+comparison+of+different+types+of+cancer+cell+cultures.">2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures.</a> Archives of Medical Science: AMS. 14 (4), 910-919 (2018).</li><li>Wrzesinski, K., Frandsen, H. S., Calitz, C., Gouws, C., Korzeniowska, B., Fey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinostat+3D+cell+culture:+Protocols+for+the+preparation+and+functional+analysis+of+highly+reproducible,+large,+uniform+spheroids+and+organoids.">Clinostat 3D cell culture: Protocols for the preparation and functional analysis of highly reproducible, large, uniform spheroids and organoids.</a> Methods in Molecular Biology. 2273, 17-62 (2021).</li><li>Joseph-Chowdhury, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+level+quantification+of+histone+post-translational+modifications+in+a+3D+cell+culture+model+of+hepatic+tissue.">Global level quantification of histone post-translational modifications in a 3D cell culture model of hepatic tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 183, 63606 (2022).</li><li>Wrzesinski, K., Fey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=After+trypsinisation,+3D+spheroids+of+C3A+hepatocytes+need+18+days+to+re-establish+similar+levels+of+key+physiological+functions+to+those+seen+in+the+liver.">After trypsinisation, 3D spheroids of C3A hepatocytes need 18 days to re-establish similar levels of key physiological functions to those seen in the liver.</a> Toxicology Research. 2, 123-135 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Bindea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClueGO:+a+Cytoscape+plug-in+to+decipher+functionally+grouped+gene+ontology+and+pathway+annotation+networks.">ClueGO: a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks.</a> Bioinformatics. 25 (8), 1091-1093 (2009).</li><li>Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenomics:+The+next+challenge.">Phenomics: The next challenge.</a> Nature Reviews. Genetics. 11 (12), 855-866 (2010).</li><li>Gonneaud, A., Asselin, C., Boudreau, F., Boisvert, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+organoids+by+proteomics.">Phenotypic analysis of organoids by proteomics.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li><li>Avelino, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics+of+3D+cell+culture:+A+useful+tool+to+validate+culture+of+spheroids+and+organoids.">Mass spectrometry-based proteomics of 3D cell culture: A useful tool to validate culture of spheroids and organoids.</a> SLAS Discovery. 27 (3), 167-174 (2022).</li><li>Chiang, J., McManus, L. M., MitchellIn, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liver physiology: Metabolism and Detoxification. Pathobiology of Human Disease. , 1770-1782 (2014).</li><li>Begriche, K., Massart, J., Robin, M. A., Borgne-Sanchez, A., Fromenty, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-induced+toxicity+on+mitochondria+and+lipid+metabolism:+Mechanistic+diversity+and+deleterious+consequences+for+the+liver.">Drug-induced toxicity on mitochondria and lipid metabolism: Mechanistic diversity and deleterious consequences for the liver.</a> Journal of Hepatology. 54 (4), 773-794 (2011).</li><li>Fey, S. J., Korzeniowska, B., Wrzesinski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+to+and+recovery+from+treatment+in+human+liver-mimetic+clinostat+spheroids:+a+model+for+assessing+repeated-dose+drug+toxicity.">Response to and recovery from treatment in human liver-mimetic clinostat spheroids: a model for assessing repeated-dose drug toxicity.</a> Toxicology Research. 9 (4), 379-389 (2020).</li><li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+image+analysis+software+tools+for+exploring+and+understanding+big+image+data+from+cell-based+assays.">Phenotypic image analysis software tools for exploring and understanding big image data from cell-based assays.</a> Cell Systems. 6 (6), 636-653 (2018).</li></ol>

Хелле Седиги Франдсен работает научным сотрудником в компании CelVivo ApS, производителе системы ClinoStar. Каролина Миккельсен - аспирант в области промышленности, работающая в CelVivo ApS и получающая докторскую степень в SDU, Оденсе, Дания. Все остальные авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов.

Понимание биологии, лежащей в основе трехмерных (3D) клеточных структур, чрезвычайно важно для более полного понимания их функциональных возможностей. Растет интерес к использованию 3D-моделей для изучения сложной биологии и проведения скрининга токсичности. При культивировании клеток в 3D необходимо учитывать множество факторов, в том числе фенотипическую оценку модельной системы. Фенотип определяется как группа наблюдаемых характеристик конкретного организма, таких как морфология, поведение, физиологические и биохимические свойства20.
В этом протоколе мы демонстрируем, как эксперименты по протеомике могут быть проведены на нескольких сфероидах и могут быть использованы для мониторинга типичного фенотипа печени. Масс-спектрометрия стала широко применяемым методом для 3D-характеризации клеток, позволяющим исследовать различные биологические вопросы 12,16,21,22. Для комплексного анализа протеома рекомендуется использовать не менее 20 мкг белкового исходного материала, из которого 1 мкг вводят в масс-спектрометр. Важно отметить, что добавление меньшего количества образца может привести к потере чувствительности, а добавление большего количества постепенно ухудшит качество хроматографии и в конечном итоге приведет к блокировке колонки. В этом исследовании мы показали, что сфероиды HepG2/C3A и THLE-3 обогащены важными белками гликолиза и цикла TCA, которые являются специфическими путями печени и имеют решающее значение для поддержания уровня глюкозы в крови и для производства энергии23,24. На самом деле, масс-спектрометрический анализ дает не только информацию на белковом уровне, но и позволяет исследовать посттрансляционные модификации белков, как это было показано ранее нашей группой16.
Еще одним аспектом, который следует учитывать в 3D-фенотипических исследованиях, является количество и размер сфероидов. Помимо повышения воспроизводимости экспериментов, подсчет количества сфероидов и определение их размера имеют важное значение для определения того, когда следует разделить культуру на несколько биореакторов, поскольку количество трехмерных структур в сосуде может повлиять на размер сфероидов и уровень метаболической активности. Однако важно подчеркнуть, что количество и размер сфероидов зависят от клеточной линии, начального количества клеток, процесса расщепления и времени сбора. Подробная информация о культуре сфероидов HepG2/C3A, такая как количество клеток в сфероидах, содержание белка и размер в зависимости от возраста, была предоставлена Феем, Коженевской и Вжесински25. Для точного и успешного анализа с использованием полуавтоматического метода, описанного здесь, наиболее важным шагом является получение хорошей картинки сфероидов. Для простоты снимок можно сделать с помощью телефона или планшета, но его разрешение должно быть максимально высоким. Поскольку изображения быстро получаются, они позволяют проводить крупномасштабные скрининговые эксперименты для визуализации конкретных фенотипических особенностей или изучения реакции на медикаментозное лечение. В связи с увеличением числа клеточных анализов за последние 10 лет был разработан ряд программного обеспечения с открытым исходным кодом для анализа изображений26. В этом протоколе мы описываем полуавтоматическую систему, использующую программное обеспечение FIJI18 для подсчета и измерения размеров сфероидов. Мы представили скрипты (простые команды программирования) для определения последовательности алгоритмических операций, которые могут быть применены к коллекции изображений, что делает анализ простым и быстрым процессом. Однако, в зависимости от характеристики сфероида, следует использовать ручное измерение. Например, если сфероиды слишком полупрозрачные, шрифт FIJI будет неточным. Кстати, одним из важнейших критериев для работы этого метода является компактность сфероидов. Эта характеристика будет способствовать более усиленному цветовому контрасту между сфероидами и фоном, что необходимо для точности метода.
Таким образом, помимо представления методологии выращивания высоковоспроизводимых сфероидов, была также описана полуавтоматическая система в сочетании с фенотипической характеристикой с помощью захвата изображений и протеомики. Мы ожидаем, что этот набор инструментов для анализа 3D-клеток станет более надежным благодаря полностью автоматизированному программному обеспечению для анализа изображений и масс-спектрометрам следующего поколения.

Было доказано, что культуры клеток in vitro необходимы и бесценны для создания фундаментальных знаний в биологии. Большая часть научных знаний в биологии и, в частности, в раке пришла из двухмерной системы культивирования, которая представляет собой клетки, растущие в монослое. Несмотря на то, что двухмерная культура является доминирующей системой культивирования клеток, она имеет много недостатков, которые потенциально могут задушить дальнейший биологический прогресс. Например, в 2D-культурах отсутствуют межклеточные взаимодействия, важные для клеточной сигнализации и пролиферации1. На сегодняшний день было показано, что 3D-системы культивирования лучше моделируют дифференцировку, реакцию на лекарственные препараты, опухолевую инвазию и биологию 2,3,4,5. 3D-моделирование злокачественных опухолей особенно актуально в связи со старением населения и смертностью от рака. Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) является одной из ведущих причин смертности, связанной с раком, во всем мире и часто имеет ужасный прогноз6. Известно, что ГЦК имеет низкую частоту излечения, плохую реакцию на лекарственные препараты и высокую частоту рецидивов 6,7,8. Было разработано несколько 3D-моделей нормальной печени и ГЦК, которые имитируют физиологию in vivo нормальной и злокачественной ткани печени 9,10.
Некоторые из современных 3D-систем включают в себя жидкие накладки, биореакторы, гидрогель, каркасы и 3D-печатные конструкции. Сфероиды, генерируемые в биореакторах, обладают уникальными преимуществами, поскольку они имитируют распределение питательных веществ в опухоли, газообмен и пролиферацию/покой клеток11. Биореакторы особенно подходят для моделей рака из-за их простоты использования, большой масштабируемости, диффузии питательных веществ и доступности11. Кроме того, биореакторы позволяют проводить эксперименты с высокой пропускной способностью, большей воспроизводимостью и меньшим количеством человеческих ошибок. Биореактор, использованный в этом исследовании, уникален тем, что он имитирует систему пониженной гравитации, которая сводит к минимуму разрушительные силы сдвига, применяемые в типичных биореакторах, что обеспечивает лучшую воспроизводимость12. Всенаправленная гравитация и уменьшение сил сдвига позволяют клеткам развиваться более физиологическим образом. В качестве доказательства можно привести то, что клетки HepG2/C3A, выращенные по этой методике, развивают сферические органеллы, которые продуцируют in vivo уровни АТФ, аденилаткиназы, мочевины и холестерина13,14. Кроме того, медикаментозное лечение в этой 3D-системе является более продвинутым и автоматизированным по сравнению с 2D-культурами. В 2D-культурах медикаментозное лечение часто должно иметь короткий временной курс из-за необходимости трипсинизации и поддержания здоровья клеток. Тем не менее, в нашем случае мы можем проводить длительную медикаментозную обработку сфероидов без необходимости нарушать структуру и физиологию клеток. Таким образом, переход от 2D к 3D культурам необходим для лучшего моделирования биологических явлений in vivo и дальнейшего научного развития.
В данной работе представлена методология выращивания высоковоспроизводимых сфероидов (рис. 1 и рис. 2) и показана полуавтоматическая система фенотипической характеристики 3D-структур (рис. 3). На уровне изображения приведена информация о подсчете и измерении площади сфероидов (рис. 3). Используя методы масс-спектрометрии, мы показываем, как протеомика может быть использована для оценки конкретных биологических функций (рис. 4). Собирая и анализируя эти данные, мы надеемся улучшить понимание биологии, лежащей в основе 3D-систем клеточных культур.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>2239480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1481754</td>
			<td>Luer lock tip, graduated to 12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L wide bore pipet tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14222703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L wide bore pipet tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14222730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Orochem filter plate</td>
			<td>Orochem&#160;</td>
			<td>OF1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well skirted plate</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-96-FS-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well vacuum manifold</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAVM0960R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6141-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bronchial Epithelial Cell Growth Medium (BEGM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture grade water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-055-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoReactor</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bioreactor for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoStar incubator</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>CO2 incubator for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT17205CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elplasia 24-well round bottom ultra-low attachment plate containing microwells</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>28905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT21022CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hEGF</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell vios 160i</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>51033557</td>
			<td>CO2 incubator for 2D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W5-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25015CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25025CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB Resin 30 &#181;m</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td>
			<td>High resolution mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAULA microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT3002CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerkinElmer Victor X2 multilabel microplate reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH paper</td>
			<td>Hydrion</td>
			<td>93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoetanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A260-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette gun</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z666467 (Milipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil-Pur resin</td>
			<td>MSWIL</td>
			<td>R13.AQ.003</td>
			<td>120 &#197; pore size, C18-AQ phase, 3 &#956;M bead size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V511A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator (96-well plates)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15308325</td>
			<td>Savant SPD1010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile hood</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>1375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile serological pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S-trap</td>
			<td>Protifi</td>
			<td>C02-micro-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle (18 G)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14817100</td>
			<td>3&#34; length, 0.05&#34; diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>28904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z258415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated phenotypic analysis of functional 3d spheroid cell cultures

Представлен протокол, описывающий свойства и преимущества использования автономного клиностат-инкубатора для выращивания, обработки и мониторинга 3D-клеточных культур. Клиностат имитирует среду, в которой клетки могут собираться в высоковоспроизводимые сфероиды с низкими силами сдвига и активной диффузией питательных веществ. Мы демонстрируем, что как раковым, так и нераковым гепатоцитам (клеточным линиям HepG2/C3A и THLE-3) требуется 3 недели роста, прежде чем они достигнут функциональности, сопоставимой с клетками печени. Этот протокол подчеркивает удобство использования инкубаторов для 3D-клеток с камерами, отслеживающими рост клеток, поскольку снимки могут быть сделаны для подсчета и измерения сфероидов после обработки. Мы описываем сравнение клеточных линий THLE-3 и HepG2/C3A, показывая, как можно выращивать нераковые клеточные линии, а также иммортализировать раковые клетки. Мы демонстрируем и иллюстрируем, как эксперименты по протеомике могут быть проведены из нескольких сфероидов, которые могут быть собраны без нарушения клеточной сигнализации, т.е. без трипсинизации. Показано, что протеомный анализ может быть использован для мониторинга типичного для печени фенотипа метаболизма дыхательной цепи и продукции белков, участвующих в детоксикации металлов, и описана полуавтоматическая система для подсчета и измерения площади сфероида. В целом, протокол представляет собой набор инструментов, который включает в себя фенотипическую характеристику с помощью захвата изображений и конвейер протеомики для экспериментов на 3D-моделях клеточных культур.

В этом протоколе мы описываем свойства инновационного безстрессового 3D-клеточного инкубатора, системы, разработанной специально для культивирования 3D-сфероидов (рис. 2). Оптимизирован протокол 3D-культивирования клеточных линий THLE-3 и HepG2/C3A. Описанный здесь протокол прост в использовании и обеспечивает воспроизводимость и экономичное культивирование > 100 сфероидов на биореактор. Попадая в биореактор, сфероиды обрабатываются аналогично клеткам, содержащимся в 2D-культуре. Оптимальные условия роста достигаются за счет замены сред два-три раза в неделю (рис. 2B) и регулировки скорости вращения в соответствии с ростом и размером сфероидов (рис. 2C). Эта система, в которой 3D-сфероиды культивируются во вращающихся биореакторах (рис. 2E, F), обеспечивает оптимальную среду роста для 3D-структур, подвергая сфероид равной и очень низкой сдвиговой силе.
Ранее мы показали, как сфероиды могут быть использованы для анализа модификации хроматина16. Здесь мы подробно продемонстрируем, как получить сфероиды печени и как можно проводить эксперименты по протеомике для анализа полного протеома (рис. 1). Вкратце, протокол был инициирован с использованием плоских клеток THLE-3 или HepG2/C3A до тех пор, пока культура не достигла 80% слияния. Для культивирования клеток в виде сфероидов около 2000 клеток помещали в сверхнизкую пластину крепления, содержащую микролунки, чтобы позволить им самоагрегироваться, а затем сформированные сфероиды переносили в биореактор (рис. 1А). Несмотря на то, что они функционально активны через 3 недели в культуре,как было продемонстрировано ранее, мы показываем результаты сфероидов, собранных после 36 дней в культуре для этого протокола. После сбора сфероиды раскручивались, а гранулы и надосадочная жидкость хранились для анализа. Жизнеспособность клеток оценивали по надосадочной жидкости для количественного определения аденилаткиназы, высвобождаемой поврежденными клетками, как описано ранее17. Клеточные белки выделяли из клеточной гранулы, а полный протеом анализировали с помощью масс-спектрометрии высокого разрешения (рис. 1B).
Этот протокол также демонстрирует полуавтоматический метод подсчета сфероидов (рис. 3A) с использованием общедоступной программы обработки изображений FIJI (Fiji Is Just ImageJ)18. Для анализа необходимо сделать качественный снимок сфероида, а также учесть некоторые параметры, упомянутые в разделе 5. Затем, после подготовки картинки к анализу, для подсчета сфероидов используется макроскрипт (Supplementary File 1). Макрос сначала создает папку с именем FIJI Spheroids counting, внутри папки, в которой находятся изображения сфероидов. В этой папке сохраняется вся информация из анализа; Это включает в себя изображение сфероидов, которые были подсчитаны, с идентификационным номером на каждом сфероиде. Он также включает в себя файл Excel, называемый подсчетом сфероидов. Этот файл содержит площадь пикселя и идентификационный номер для каждого подсчитанного сфероида. Данные, соответствующие одной анализируемой картинке, представлены в каждой вкладке файла. Вкладка помечена в соответствии с названием анализируемой картинки. Поскольку размер сфероида может быть нарушен многими факторами, в том числе количеством структур в сосуде и медикаментозной обработкой, также важно контролировать площадь их поверхности (планиметрию). Сценарий макроса, представленный здесь (Дополнительный файл 2), работает путем измерения черных областей, которые соответствуют сфероидам на рисунке (рис. 3B). Выходные данные собираются в файле под названием planimetry.xlsx, который содержит измеренную площадь, периметр и диаметр каждого сфероида. Существует также измерение, называемое Ферет, используемое для вычисления диаметра. Feret — самый длинный возможный диаметр, а minFeret — самый короткий. Диаметр является средним из этих двух. Внутри выходной папки, помимо файла planimetry.xlsx, есть также изображение сфероидов, которые были измерены.
Прежде чем перейти к анализу протеома, была проведена оценка жизнеспособности сфероидов во времени культивирования. Уровни АК повышаются до 17-го дня, достигая примерно 7% клеточной гибели, а затем гибель снижается до уровня ниже 5% (рис. 4А), что согласуется с ранее опубликованной работой17. Этот протокол также показывает полный анализ протеома для мониторинга фенотипа клеток. Во-первых, сравнивали протеомы плоских клеток и сфероидов THLE-3 и HepG2/C3A. При анализе первого главного компонента (ПК1) видно, что существует строгое разделение образцов сфероидов от плоских клеточных культур, и представляется, что корреляция типов клеток (THLE-3 и HepG2/C3A) не имеет значения (рис. 4B). Несмотря на то, что сфероиды THLE-3 и HepG2/C3A не группируются вместе, они имеют схожие профили, согласующиеся с функцией печени. В этом протоколе мы демонстрируем на примере металлотионеинов, которые играют роль в детоксикации металлов, осуществляемой печенью. При протеомном анализе мы идентифицировали 2 изоформы с избыточной экспрессией в сфероидах по сравнению с плоскими клетками (MT1E и MT1X) (рис. 4C). Мы также показываем обогащение генной онтологией (GO) обеих клеточных линий, выращенных в виде сфероидов. Процесс метаболизма углеводов, который включает в себя цикл трикарбоновых кислот (цикл ТСА), цепь переноса электронов (клеточное дыхание) и метаболизм пируватов, является частым термином и обогащен сфероидами HepG2/C3A и THLE-3 (рис. 4D, E). Клеточная детоксикация, метаболизм жирных кислот и холестерина являются другими функциями, обогащенными обоими сфероидами. Известно, что вместе эти функции имеют решающее значение для работы печени.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig01.jpg"> Рисунок 1: Рабочий процесс для культивирования сфероидов и пробоподготовки . (A) Экспериментальный подход к 3D-культуре клеток. Плоские клеточные культуры при желаемом слиянии трипсинизировали и высевали на 24-луночную планшет со сверхнизким присоединением, содержащую микролунки, где клетки самособираются в сфероиды. Через 24 ч сфероиды переносили в биореактор и культивировали до тех пор, пока они не были готовы к анализу. (B) После сбора сфероиды гранулировали, а пеллеты и культуральную надосадочную жидкость хранили до переработки. Гистоны16и негистонные белки экстрагировали, расщепляли в пептиды и анализировали с помощью масс-спектрометрии высокого разрешения. Необработанные файлы, полученные с помощью масс-спектрометрии, были найдены в базе данных человека, и данные были подвергнуты дальнейшей обработке. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig02v2.jpg"> Рисунок 2: 3D система клеточных культур . (А) Детали биореактора. Биореактор состоит из камеры газообмена и увлажнения, содержащей водяные шарики, и открывающейся камеры с двумя заглушками для обмена средами и сбора сфероидов. (B) Обмен средами в биореакторе. Биореактор заполняют 10 мл питательной среды с помощью шприца с иглой. (C) Приложение для управления системой. Скорость вращения, уровень CO2, температура, журнал аварийных сигналов и другие функции можно контролировать с помощью блока управления. (D) Помещение биореактора в 3D-инкубатор. Каждый биореактор имеет соответствующий двигатель, который может медленно вращать биореактор. (E) Биореактор в движении со скоростью (об/мин), контролируемой планшетом (C). Скорость (об/мин) регулируется в соответствии с размером сфероидов. (F) Биореакторы внутри 3D-инкубатора. 3D-инкубатор может вместить до 6 индивидуально управляемых биореакторов. Фото любезно предоставлено Jason Torres Photography. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig02largev2.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig03.jpg"> Рисунок 3: Фенотипическая характеристика сфероидов с помощью захвата изображений . (A) Полуавтоматический подсчет сфероидов. После получения снимков сфероидов в биореакторе изображение подготавливается к анализу в FIJI. Каждый сфероид подсчитывается, и для каждого из них присваивается идентификационный номер. Используется макрос, и отображаются результаты, показывающие идентификатор подсчитанного сфероида, метку (название изображения, которое было проанализировано) и область (количество пикселей, подсчитанных в сфероиде). (Б) Контурное определение площади сфероида. С помощью макроса определяется площадь, периметр и диаметр конкретного сфероида. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig04.jpg"> Рисунок 4: Протеомный анализ сфероидов печени. (А) Жизнеспособность сфероидов рассчитывали на основе высвобождения аденилаткиназы (АК) на культуре надосадочной жидкости. Результаты являются средством дублирования точек данных ± SD. (B) Для сравнения протеома плоских клеток и сфероидов THLE-3 и HepG2/C3A был проведен анализ главных компонент (PCA). (C) Относительное обилие металлотионеинов, которые представляют собой белки, экспрессируемые печенью человека. Данные представлены в виде средних значений ± SEM. (D) Функционально сгруппированная сеть показывает обогащение GO для сфероидов HepG2/C3A и (E) сфероидов THLE-3, где показана только метка наиболее значимого члена на группу. Сеть была построена с использованием ClueGo19. Размер узла представляет собой значение термина «обогащение». <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Дополнительный файл 1: Макроскрипт для подсчета сфероидов. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.</a>
Дополнительный файл 2: Макрос для контурного определения сфероидов. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/Supplementary%20File%202.docx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures at JoVE.com

Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures

Представлен протокол выращивания высоковоспроизводимых сфероидов и их фенотипическая характеристика с использованием захвата изображений и протеомики.

Полуавтоматический фенотипический анализ функциональных 3D культур сфероидных клеток

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell ...

Этот протокол демонстрирует, как выращивать высоковоспроизводимые сфероиды и показывает, как можно проводить протеомные эксперименты для характеристики биологической функции 3D-структур. Наша 3D-культура может одновременно производить сотни биологических репликаций в одном и том же биореакторе, а метод ЖХ-МС позволяет измерить содержание тысяч белков в одном эксперименте. Демонстрацию процедуры будет демонстрировать Стефани Странски, постдок из лаборатории.Для начала примите суспензию клеток HepG2/C3A и THLE-3. Подсчитывают количество клеток и разбавляют клеточную суспензию в полной питательной среде до получения 1 миллиона клеток в максимальном объеме 1,5 миллилитра. Промойте лунки сверхнизкой насадки, 24-луночной круглой нижней пластины с 0,5 миллилитрами питательной среды и центрифугой при 3 000 г в течение пяти минут.Переложите клеточную суспензию на планшет и центрифугируйте ее в течение трех минут при 120 г. Затем инкубируйте пластину, чтобы инициировать образование сфероида. Затем уравновешивают биореактор за 24 часа до переноса сфероидов, заполняя камеру влажности 25 миллилитрами стерильной воды и камеру клетки девятью миллилитрами питательной среды с помощью 10-миллилитрового шприца с длинной иглой.Затем поместите биореактор в 3D-инкубатор на 24 часа при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа. Осторожно пипетируйте сфероиды вверх и вниз с помощью наконечников шириной в один миллилитр, чтобы отсоединить их от сверхнизкой пластины для крепления и переместить в чашку для культуры тканей. Чтобы захватить оставшиеся сфероиды, промойте планшет 0,5 миллилитрами предварительно подогретой питательной среды и перенесите их в чашку для культивирования.С помощью светового микроскопа оцените размер, компактность и округлость сфероидов, чтобы выбрать те, которые имеют адекватную форму. Переместите выбранный сфероид в уравновешивающий биореактор, заполненный пятью миллилитрами свежей питательной среды. Затем заполните весь биореактор свежей питательной средой.Расположите биореактор в 3D-инкубаторе и отрегулируйте скорость вращения с помощью блока управления. Каждые два-три дня заменяйте 10 миллилитров старой питательной среды на 10 миллилитров свежей. Меняйте скорость вращения каждый раз после замены носителя.Культивируйте сфероиды в течение 15 дней и разделите их между двумя свежими биореакторами. Откройте 3D-приложение, установленное на планшете, выберите биореактор и сделайте снимок. В качестве альтернативы поместите черный фон позади биореактора и убедитесь, что свет не отражается на камере клетки.Сделайте снимок как можно ближе к биореактору. Затем соберите сфероиды, удалив пять миллилитров среды из биореактора с помощью шприца, прикрепленного к длинной игле через верхний порт. Убедитесь, что сфероиды опускаются к центру нижней части биореактора.Теперь откройте передний порт и соберите сфероиды с помощью наконечника шириной в один миллилитр. Переложите эти сфероиды в микроцентрифужные пробирки, центрифугируйте при 500 г в течение пяти минут и утилизируйте среду. Промойте сфероид, добавив 200 микролитров HBSS, чтобы удалить FBS.После этого проводят центрифугирование при 500г в течение пяти минут и выбросьте надосадочную жидкость. Затем быстро погрузите гранулу сфероида в жидкий азот, чтобы заморозить ее, и храните эту замороженную гранулу при температуре минус 80 градусов Цельсия до дальнейшей обработки. Чтобы лизировать клетки, возьмите пробирку с собранными сфероидами и ресуспендируйте их в 25 микролитрах 5%-ного SDS.Гомогенизируйте гранулы, пипетируя вверх и вниз. Далее растворяют один микрограмм образцов и 10 микролитров 0,1%-ной трихлоруксусной кислоты. После экстракции белка и очистки образцов настройте метод сбора МС для генерации спектров МС/МС из идентифицированных пептидных сигналов.Затем переложите планшет в нанолитровый автосамплер жидкостной хроматографии. Установите полное MS-сканирование на соотношение массы к заряду 300 к 1,100 в Orbitrap. Установите разрешение на 120000 и установите цель автоматической регулировки усиления на 125.Затем установите MS/MS в Orbitrap с последовательным окном изоляции с отношением массы к заряду 50. Наведите цель автоматической регулировки усиления на 400 и установите более высокую энергию диссоциации столкновения на 30. Согласно анализу жизнеспособности сфероидов, уровни аденилаткиназы увеличиваются до 17-го дня, что приводит примерно к 7% гибели клеток.После этого уровень смертности снижается до уровня ниже 5%Кроме того, анализ первого главного компонента выявляет четкое различие между сфероидными образцами и плоскоклеточными культурами. Протеомный анализ показал, что сфероиды THLE-3 и HepG2/C3A имеют схожие профили, отражающие функцию печени. Кроме того, сфероиды показали гиперэкспрессию двух изоформ металлотионеинов по сравнению с плоскими клетками.Функционально сгруппированные сети показали обогащение онтологией генов для углеводного метаболического процесса в сферах HepG2/C3A и THLE-3. Во избежание разлива питательной среды не открывайте и не закрывайте переднее отверстие, когда камера ячейки полностью заполнена жидкостью. Пробоподготовка и анализ, описанные в этом протоколе, могут быть использованы для исследования протеома клеточной культуры методами 2D и 3D, а также образцов тканей.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Масс-спектрометрия и люминогенные подходы, основанные на Охарактеризуйте Фазу I метаболических компетентности в<em&gt; In Vitro</em&gt; Клеточные культуры

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Обнаружение и визуализация ДНК-индуцированных белковых комплексов в суспензионных клеточных культурах с использованием анализа лигирования близости

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Полуавтоматическая Biopanning бактериальной отображения библиотек пептид сродство реагент обнаружения и анализа результате изолятов

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

Диссекции человека сетчатки и ПЭС Хориоидея протеомного анализа

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

Улучшенная протокол для иммунопреципитации Chromatin от мыши скелетных мышц

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Изучение метаболизма шести системных инсектицидов в недавно созданной культуре подвески клеток, полученных из чая(Камелия Sinensis L.) Листья

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

В режиме реального времени, полуавтоматические флуоресцентные измерения воздуха поверхности жидкости рН первичных человеческих дыхательных путей эпителиальных клеток

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Одноклеточный анализ транскрипционно активных аллелей одной молекулой FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Бесклеточная продукция протеолипосом для функционального анализа и разработки антител, нацеленных на мембранные белки

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Анализ синтеза нейтральных липидов в Saccharomyces cerevisiae методом метаболической маркировки и тонкослойной хроматографии

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...