Name: semi-automated phenotypic analysis of functional 3d spheroid cell cultures
Uploaded: 2023-08-18T13:10:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures at JoVE.com

Sedoli-labbet är tacksamma för Leukemia Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics Award), Deerfield (Xseed award), Relay Therapeutics, Merck och NIH Office of the Director (1S10OD030286-01).

<ol>
	<li>Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture+systems:+advantages+and+applications.">3D cell culture systems: advantages and applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).</li><li>Nirmalanandhan, V. S., Duren, A., Hendricks, P., Vielhauer, G., Sittampalam, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+anticancer+agents+in+a+three-dimensional+cell+culture+model.">Activity of anticancer agents in a three-dimensional cell culture model.</a> Assay and Drug Development Technologies. 8 (5), 581-590 (2010).</li><li>Erickson, I. E., Huang, A. H., Chung, C., Li, R. T., Burdick, J. A., Mauck, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+maturation+and+structure-function+relationships+in+mesenchymal+stem+cell-+and+chondrocyte-seeded+hydrogels.">Differential maturation and structure-function relationships in mesenchymal stem cell- and chondrocyte-seeded hydrogels.</a> Tissue Engineering Part A. 15 (5), 1041-1052 (2009).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation.">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biology. 10 (29), (2012).</li><li>Liu, J., Abate, W., Xu, J., Corry, D., Kaul, B., Jackson, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroid+cultures+of+A549+and+HepG2+cells+exhibit+different+lipopolysaccharide+(LPS)+receptor+expression+and+LPS-induced+cytokine+response+compared+with+monolayer+cultures.">Three-dimensional spheroid cultures of A549 and HepG2 cells exhibit different lipopolysaccharide (LPS) receptor expression and LPS-induced cytokine response compared with monolayer cultures.</a> Innate Immunity. 17 (3), 245-255 (2011).</li><li>Khafaga, A. F., Mousa, S. A., Aleya, L., Abdel-Daim, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+(3D)+cell+culture:+a+valuable+step+in+advancing+treatments+for+human+hepatocellular+carcinoma.">Three-dimensional (3D) cell culture: a valuable step in advancing treatments for human hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Cell International. 22 (1), 243 (2022).</li><li>Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocellular+carcinoma.">Hepatocellular carcinoma.</a> The Lancet. 362 (9399), 1907-1917 (2003).</li><li>Sia, D., Llovet, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+cancer:+Translating+'-omics'+results+into+precision+medicine+for+hepatocellular+carcinoma.">Liver cancer: Translating '-omics' results into precision medicine for hepatocellular carcinoma.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 14 (10), 571-572 (2017).</li><li>Tang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+cell+biology+model+of+human+hepatocellular+carcinoma+in+vitro.">A three-dimensional cell biology model of human hepatocellular carcinoma in vitro.</a> Tumour Biology. 32 (3), 469-479 (2011).</li><li>van Zijl, F., Mikulits, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatospheres:+Three+dimensional+cell+cultures+resemble+physiological+conditions+of+the+liver.">Hepatospheres: Three dimensional cell cultures resemble physiological conditions of the liver.</a> World Journal of Hepatology. 2 (1), 1-7 (2010).</li><li>Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+as+an+in+vitro+platform+for+cancer+and+stem+cell+modeling.">Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling.</a> World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).</li><li>Wrzesinski, K., Fey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+and+the+recovery+of+physiological+functionality+in+3D+cultures+in+micro-bioreactors.">Metabolic reprogramming and the recovery of physiological functionality in 3D cultures in micro-bioreactors.</a> Bioengineering(Basel, Switzerland). 5 (1), 22 (2018).</li><li>Breslin, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+The+missing+link+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: The missing link in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).</li><li>Kapalczynska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D+cell+cultures+-+a+comparison+of+different+types+of+cancer+cell+cultures.">2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures.</a> Archives of Medical Science: AMS. 14 (4), 910-919 (2018).</li><li>Wrzesinski, K., Frandsen, H. S., Calitz, C., Gouws, C., Korzeniowska, B., Fey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinostat+3D+cell+culture:+Protocols+for+the+preparation+and+functional+analysis+of+highly+reproducible,+large,+uniform+spheroids+and+organoids.">Clinostat 3D cell culture: Protocols for the preparation and functional analysis of highly reproducible, large, uniform spheroids and organoids.</a> Methods in Molecular Biology. 2273, 17-62 (2021).</li><li>Joseph-Chowdhury, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+level+quantification+of+histone+post-translational+modifications+in+a+3D+cell+culture+model+of+hepatic+tissue.">Global level quantification of histone post-translational modifications in a 3D cell culture model of hepatic tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 183, 63606 (2022).</li><li>Wrzesinski, K., Fey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=After+trypsinisation,+3D+spheroids+of+C3A+hepatocytes+need+18+days+to+re-establish+similar+levels+of+key+physiological+functions+to+those+seen+in+the+liver.">After trypsinisation, 3D spheroids of C3A hepatocytes need 18 days to re-establish similar levels of key physiological functions to those seen in the liver.</a> Toxicology Research. 2, 123-135 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Bindea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClueGO:+a+Cytoscape+plug-in+to+decipher+functionally+grouped+gene+ontology+and+pathway+annotation+networks.">ClueGO: a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks.</a> Bioinformatics. 25 (8), 1091-1093 (2009).</li><li>Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenomics:+The+next+challenge.">Phenomics: The next challenge.</a> Nature Reviews. Genetics. 11 (12), 855-866 (2010).</li><li>Gonneaud, A., Asselin, C., Boudreau, F., Boisvert, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+organoids+by+proteomics.">Phenotypic analysis of organoids by proteomics.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li><li>Avelino, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics+of+3D+cell+culture:+A+useful+tool+to+validate+culture+of+spheroids+and+organoids.">Mass spectrometry-based proteomics of 3D cell culture: A useful tool to validate culture of spheroids and organoids.</a> SLAS Discovery. 27 (3), 167-174 (2022).</li><li>Chiang, J., McManus, L. M., MitchellIn, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liver physiology: Metabolism and Detoxification. Pathobiology of Human Disease. , 1770-1782 (2014).</li><li>Begriche, K., Massart, J., Robin, M. A., Borgne-Sanchez, A., Fromenty, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-induced+toxicity+on+mitochondria+and+lipid+metabolism:+Mechanistic+diversity+and+deleterious+consequences+for+the+liver.">Drug-induced toxicity on mitochondria and lipid metabolism: Mechanistic diversity and deleterious consequences for the liver.</a> Journal of Hepatology. 54 (4), 773-794 (2011).</li><li>Fey, S. J., Korzeniowska, B., Wrzesinski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+to+and+recovery+from+treatment+in+human+liver-mimetic+clinostat+spheroids:+a+model+for+assessing+repeated-dose+drug+toxicity.">Response to and recovery from treatment in human liver-mimetic clinostat spheroids: a model for assessing repeated-dose drug toxicity.</a> Toxicology Research. 9 (4), 379-389 (2020).</li><li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+image+analysis+software+tools+for+exploring+and+understanding+big+image+data+from+cell-based+assays.">Phenotypic image analysis software tools for exploring and understanding big image data from cell-based assays.</a> Cell Systems. 6 (6), 636-653 (2018).</li></ol>

Helle Sedighi Frandsen är anställd som forskare på CelVivo ApS, tillverkaren av ClinoStar-systemet. Karoline Mikkelsen är industridoktorand anställd på CelVivo ApS och utför sin doktorandstudie vid SDU, Odense, Danmark. Alla andra författare har inga konkurrerande ekonomiska intressen.

Att förstå biologin bakom tredimensionella (3D) cellulära strukturer är oerhört viktigt för en mer omfattande kunskap om deras funktioner. Det finns ett växande intresse för att använda 3D-modeller för att studera komplex biologi och utföra toxicitetsscreening. När man odlar celler i 3D måste många faktorer beaktas, inklusive den fenotypiska bedömningen av modellsystemet. En fenotyp definieras som en grupp observerbara egenskaper hos en specifik organism, såsom morfologi, beteende, fysiologiska och biokemiska egenskaper20.
I detta protokoll visar vi hur proteomikexperiment kan utföras från ett fåtal sfäroider och kan användas för att övervaka den typiska leverfenotypen. Masspektrometri har blivit en i stor utsträckning tillämpad metod för 3D-cellkarakterisering, vilket gör det möjligt att undersöka en mängd olika biologiska frågor 12,16,21,22. För en omfattande proteomanalys rekommenderas att använda minst 20 μg proteinutgångsmaterial, från vilket 1 μg injiceras i masspektrometern. Det är viktigt att nämna att om man lägger till mindre prov kan det leda till förlust av känslighet, och att lägga till mer skulle gradvis försämra kromatografens kvalitet och så småningom leda till att kolonnen blockeras. I denna studie visade vi att sfäroiderna HepG2/C3A och THLE-3 är berikade med viktiga proteiner från glykolys och TCA-cykeln, som är specifika levervägar och är avgörande för att upprätthålla blodsockernivåerna och för energiproduktion23,24. Faktum är att masspektrometrianalys inte bara ger information på proteinnivå utan också möjliggör undersökning av proteiners posttranslationella modifieringar, som tidigare visats av vår grupp16.
En annan aspekt som ska beaktas i 3D-fenotypiska studier är antalet och storleken på sfäroider. Förutom att göra experimenten mer reproducerbara är det viktigt att räkna antalet sfäroider och bestämma deras storlek för att avgöra när kulturen ska delas upp i flera bioreaktorer, eftersom antalet 3D-strukturer i ett kärl kan påverka sfäroidernas storlek och metaboliska aktivitetsnivåer. Det är dock viktigt att betona att antalet och storleken på sfäroider beror på cellinjen, startantalet celler, delningsprocessen och insamlingstiden. Detaljer om HepG2/C3A-sfäroidkulturen, såsom antal celler per sfäroid, proteininnehåll och storlek som en funktion av ålder, tillhandahölls av Fey, Korzeniowska och Wrzesinski25. För noggrann och framgångsrik analys med den halvautomatiska metoden som beskrivs här är det mest kritiska steget en bra sfäroidbild. För enkelhetens skull kan bilden tas med en telefon eller surfplatta, men upplösningen bör hållas så hög som möjligt. Eftersom bilder är snabba att få fram möjliggör de storskaliga screeningexperiment för att visualisera specifika fenotypiska egenskaper eller undersöka svar på läkemedelsbehandling. Därför, på grund av det ökande antalet cellbaserade analyser, har ett antal programvaror med öppen källkod utvecklats under de senaste 10 åren för bildanalys26. I detta protokoll beskriver vi ett halvautomatiskt system som använder programvaran FIJI18 för att räkna och mäta sfäroidernas storlek. Vi presenterade skript (enkla programmeringskommandon) för att definiera en sekvens av algoritmiska operationer som kan tillämpas på en bildsamling, vilket gör analysen till en enkel och snabb process. Beroende på sfäroidens egenskaper bör dock en manuell mätning användas. Till exempel, om sfäroiderna är för genomskinliga, kommer FIJI-skriptet att vara oprecist. Förresten, ett av de viktigaste kriterierna för att denna metod ska fungera är sfäroidernas kompakthet. Denna egenskap kommer att bidra till en mer förbättrad färgkontrast mellan sfäroiderna och bakgrunden, vilket är nödvändigt för att metoden ska vara korrekt.
Sammanfattningsvis, förutom att presentera en metodik för att odla högreproducerbara sfäroider, beskrevs också ett halvautomatiserat system i kombination med fenotypisk karakterisering via bildtagning och proteomik. Vi förväntar oss att denna verktygslåda för analys av 3D-celler kommer att bli mer robust med helautomatisk programvara för bildanalys och nästa generations masspektrometrar.

In vitro-cellkulturer har visat sig vara nödvändiga och ovärderliga för att etablera grundläggande kunskap inom biologi. Mycket av den vetenskapliga förståelsen inom biologi och cancer specifikt har kommit från 2D-odlingssystemet, det vill säga celler som växer i ett monolager. Även om 2D-odling har varit det dominerande cellodlingssystemet har det många nackdelar som potentiellt kan kväva ytterligare biologiska framsteg. Till exempel saknar 2D-kulturer cell-cellinteraktioner som är viktiga för cellsignalering och proliferation1. Hittills har 3D-odlingssystem visat sig bättre modellera differentiering, läkemedelsrespons, tumörinvasion och biologi 2,3,4,5. 3D-modellering av maligna cancerformer är särskilt viktigt på grund av ökningen av den åldrande befolkningen och cancerdödligheten. Hepatocellulärt karcinom (HCC) är en av de främsta orsakerna till cancerrelaterad dödlighet i världen och har ofta en urusel prognos. HCC är känt för att ha en låg läkningsfrekvens, dåligt läkemedelssvar och hög återfallsfrekvens 6,7,8. Flera 3D-modeller för normal lever och HCC har utvecklats som efterliknar fysiologin hos in vivo normal och malign levervävnad 9,10.
Några av de nuvarande 3D-systemen inkluderar vätskeöverlägg, bioreaktorer, hydrogel, ställningar och 3D-printade strukturer. Sfäroider som genereras i bioreaktorer ger specifikt unika fördelar eftersom de efterliknar tumörfördelning av näringsexponering, gasutbyte och cellproliferation/vila11. Bioreaktorer är särskilt lämpliga för cancermodeller på grund av deras användarvänlighet, stora skalbarhet, näringsdiffusion och tillgänglighet11. Dessutom kan bioreaktorer möjliggöra experiment med hög genomströmning, större reproducerbarhet och minskade mänskliga fel. Bioreaktorn som används i denna studie är unik eftersom den simulerar ett system med reducerad gravitation, vilket minimerar störande skjuvkrafter som appliceras i typiska bioreaktorer vilket möjliggör bättre reproducerbarhet12. Den rundstrålande gravitationen och minskningen av skjuvkrafterna gör det möjligt för cellerna att utvecklas på ett mer fysiologiskt sätt. Som bevis utvecklar HepG2/C3A-celler som odlas enligt denna metod sfäriska organeller som producerar in vivo-nivåer av ATP, adenylatkinas, urea och kolesterol13,14. Dessutom är läkemedelsbehandlingar i detta 3D-system mer avancerade och automatiserade i jämförelse med 2D-kulturer. I 2D-kulturer måste läkemedelsbehandlingar ofta ha ett kort tidsförlopp på grund av behovet av att trypsinisera och upprätthålla cellhälsan. Men i vårt fall kan vi utföra långsiktiga läkemedelsbehandlingar av sfäroider utan att behöva störa cellernas struktur och fysiologi. Därför är ett skifte från 2D- till 3D-kulturer nödvändigt för att bättre modellera biologiska fenomen in vivo och främja vetenskaplig utveckling.
Denna artikel presenterar en metod för odling av högreproducerbara sfäroider (Figur 1 och Figur 2) och visar ett halvautomatiskt system för att fenotypiskt karakterisera 3D-strukturer (Figur 3). På bildnivå ger vi information om hur man räknar och mäter sfäroidernas area (figur 3). Genom att använda masspektrometrimetoder visar vi hur proteomik kan användas för att bedöma specifika biologiska funktioner (Figur 4). Genom att samla in och analysera dessa data hoppas vi kunna förbättra förståelsen för biologin bakom 3D-cellodlingssystem.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>2239480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1481754</td>
			<td>Luer lock tip, graduated to 12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L wide bore pipet tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14222703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L wide bore pipet tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14222730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Orochem filter plate</td>
			<td>Orochem&#160;</td>
			<td>OF1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well skirted plate</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-96-FS-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well vacuum manifold</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAVM0960R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6141-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bronchial Epithelial Cell Growth Medium (BEGM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture grade water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-055-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoReactor</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bioreactor for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClinoStar incubator</td>
			<td>CelVivo</td>
			<td>N/A</td>
			<td>CO2 incubator for 3D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT17205CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elplasia 24-well round bottom ultra-low attachment plate containing microwells</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>28905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT21022CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hEGF</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell vios 160i</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>51033557</td>
			<td>CO2 incubator for 2D cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W5-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1149-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25015CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT25025CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB Resin 30 &#181;m</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td>
			<td>High resolution mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAULA microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT3002CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerkinElmer Victor X2 multilabel microplate reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH paper</td>
			<td>Hydrion</td>
			<td>93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoetanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A260-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette gun</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z666467 (Milipore Sigma)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>75-217-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil-Pur resin</td>
			<td>MSWIL</td>
			<td>R13.AQ.003</td>
			<td>120 &#197; pore size, C18-AQ phase, 3 &#956;M bead size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V511A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator (96-well plates)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15308325</td>
			<td>Savant SPD1010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile hood</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>1375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile serological pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S-trap</td>
			<td>Protifi</td>
			<td>C02-micro-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle (18 G)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14817100</td>
			<td>3&#34; length, 0.05&#34; diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>28904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z258415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated phenotypic analysis of functional 3d spheroid cell cultures

Vi presenterar ett protokoll som beskriver egenskaperna och fördelarna med att använda en fristående klinostatinkubator för odling, behandling och övervakning av 3D-cellkulturer. Klinostaten efterliknar en miljö där celler kan samlas som mycket reproducerbara sfäroider med låga skjuvkrafter och aktiv näringsdiffusion. Vi visar att både cancer och icke-cancerhepatocyter (HepG2/C3A och THLE-3 cellinjer) kräver 3 veckors tillväxt innan de uppnår funktioner jämförbara med leverceller. Detta protokoll belyser bekvämligheten med att använda inkubatorer för 3D-celler med kameror som övervakar celltillväxten, eftersom ögonblicksbilder kan tas för att räkna och mäta sfäroider vid behandling. Vi beskriver jämförelsen av THLE-3 och HepG2/C3A cellinjer och visar hur icke-cancerösa cellinjer kan odlas såväl som odödliga cancerceller. Vi demonstrerar och illustrerar hur proteomikexperiment kan utföras från ett fåtal sfäroider, som kan samlas in utan störande cellsignalering, dvs ingen trypsinisering krävs. Vi visar att proteomikanalys kan användas för att övervaka den typiska leverfenotypen för metabolism i andningskedjan och produktionen av proteiner som är involverade i metallavgiftning och beskriver ett halvautomatiskt system för att räkna och mäta sfäroidens area. Sammantaget presenterar protokollet en verktygslåda som består av en fenotypisk karakterisering via bildtagning och en proteomikpipeline för att experimentera på 3D-cellodlingsmodeller.

I detta protokoll beskriver vi egenskaperna hos en innovativ stressfri 3D-cellinkubator, ett system designat speciellt för odling av 3D-sfäroider (Figur 2). Vi optimerade protokollet för 3D-odling av THLE-3 och HepG2/C3A-cellinjer. Protokollet som beskrivs här är enkelt att använda och möjliggör reproducerbarhet och kostnadseffektiv odling av > 100 sfäroider per bioreaktor. Väl i bioreaktorn behandlas sfäroider på samma sätt som celler som upprätthålls i 2D-odling. Optimala tillväxtförhållanden uppnås genom att byta ut mediet två till tre gånger i veckan (figur 2B) och justera rotationshastigheten efter sfäroidernas tillväxt och storlek (figur 2C). Detta system, där 3D-sfäroider odlas i roterande bioreaktorer (figur 2E,F), ger en optimal tillväxtmiljö för 3D-strukturer genom att exponera sfäroider för en lika stor och mycket låg skjuvkraft.
Vi har tidigare visat hur sfäroider kan användas för analys av kromatinmodifiering16. Här visar vi i detalj hur man får leversfäroider och hur proteomikexperiment kan utföras för analys av hela proteomet (Figur 1). I korthet initierades protokollet genom att använda THLE-3 eller HepG2/C3A platta celler tills odlingen nådde 80% sammanflöde. För att odla celler som sfäroider pläterades cirka 2 000 celler i en ultralåg fästplatta som innehöll mikrobrunnar för att de skulle kunna självaggregera, och sedan överfördes bildade sfäroider till en bioreaktor (Figur 1A). Även om de är funktionellt aktiva efter 3 veckor i odling, som tidigare visats17, visar vi resultat från sfäroider som samlats in efter 36 dagar i odling för detta protokoll. Efter insamlingen spanns sfäroider ner och både pellets och supernatant lagrades för analys. Cellviabiliteten bedömdes från supernatanten för kvantifiering av adenylatkinas som frisatts av skadade celler, som beskrivits tidigare17. Cellulära proteiner extraherades från cellpelleten och hela proteomet analyserades med högupplösande masspektrometri (Figur 1B).
Detta protokoll demonstrerar också en halvautomatisk metod för att räkna sfäroider (figur 3A) med hjälp av det offentliga bildbehandlingsprogrammet FIJI (Fiji Is Just ImageJ)18. En bild av god kvalitet på sfäroiden bör tas för analysen, och vissa parametrar bör beaktas som nämns i avsnitt 5. Sedan, efter att ha förberett bilden för analys, används ett makroskript (tilläggsfil 1) för att räkna sfäroiderna. Makrot fungerar genom att först göra en mapp som heter FIJI Spheroids counting, inuti mappen där sfäroidbilderna finns. I den här mappen sparas all information från analysen. Detta inkluderar en bild av de sfäroider som räknades, med ett ID-nummer på varje sfäroid. Den innehåller också en Excel-fil som heter sfäroidräkning. Den här filen innehåller pixelarean och ID-numret för varje sfäroid som räknades. Data som motsvarar en analyserad bild presenteras på varje flik i filen. Fliken är märkt enligt namnet på den analyserade bilden. Eftersom sfäroidernas storlek kan försämras av många faktorer, inklusive antalet strukturer i ett kärl och läkemedelsbehandling, är det också viktigt att övervaka deras yta (planimetri). Makroskriptet som presenteras här (tilläggsfil 2) fungerar genom att mäta de svarta områdena, som motsvarar sfäroider i bilden (figur 3B). Utdata samlas i en fil som heter planimetry.xlsx, som innehåller den uppmätta arean, omkretsen och diametern för varje sfäroid. Det finns också ett mått som kallas Feret, som används för att beräkna diametern. Feret är den längsta möjliga diametern, medan minFeret är den kortaste. Diametern är genomsnittet av dessa två. Inuti utdatamappen, förutom planimetry.xlsx -filen, finns det också en bild av sfäroiderna som mättes.
Innan man gick vidare till proteomanalysen utvärderades sfäroidernas livskraft över odlingstiden. Nivåerna av AK ökar fram till dag 17 och når cirka 7 % av celldöden, och sedan minskar döden till nivåer under 5 % (Figur 4A), vilket är i enlighet med tidigare publicerat arbete17. Detta protokoll visar också den fullständiga proteomanalysen för övervakning av cellfenotypen. För det första jämfördes proteomen hos THLE-3 och HepG2/C3A flatceller och sfäroider. Genom att analysera den första huvudkomponenten (PC1) är det uppenbart att det finns en strikt separation av sfäroidprover från platta cellkulturer, och det verkar som om korrelationen mellan celltyp (THLE-3 och HepG2/C3A) inte är relevant (Figur 4B). Även om THLE-3 och HepG2/C3A sfäroider inte klustrar ihop, delar de liknande profiler som överensstämmer med leverfunktionen. Vi visar i detta protokoll exemplet med metallothioneiner, som har en roll i metallavgiftning som utförs av levern. Vi identifierade i proteomikanalysen 2 isoformer överuttryckta i sfäroider i jämförelse med platta celler (MT1E och MT1X) (Figur 4C). Vi visar också Gene Ontology (GO) anrikning av båda cellinjerna som odlas som sfäroider. Kolhydratmetabolismen, som omfattar trikarboxylsyracykeln (TCA-cykeln), elektrontransportkedjan (cellandning) och pyruvatmetabolism, är en frekvent term och är berikad med både HepG2/C3A- och THLE-3-sfäroider (Figur 4D,E). Cellulär avgiftning, fettsyra- och kolesterolmetabolism är andra funktioner som är berikade i båda sfäroiderna. Tillsammans är dessa funktioner kända för att vara avgörande för leverfunktionen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig01.jpg"> Figur 1: Arbetsflöde för sfäroidodling och provberedning . (A) Experimentell metod för 3D-cellodling. Platta cellkulturer vid önskat sammanflöde trypsiniserades och såddes på en ultralåg 24-brunnsplatta innehållande mikrobrunnar, där celler självorganiserar sig till sfäroider. Efter 24 timmar överfördes sfäroiderna till en bioreaktor och odlades tills de är redo för analys. (B) Efter insamlingen pelleterades sfäroider och både pellet- och kultursupernatanten lagrades fram till bearbetningen. Histon-16och icke-histonproteiner extraherades, smältes till peptider och analyserades med högupplösande masspektrometri. Råfiler erhållna från masspektrometrin genomsöktes mot den mänskliga databasen och data bearbetades vidare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig02v2.jpg"> Figur 2: 3D-cellodlingssystem . (A) Bioreaktordelar. Bioreaktorn består av en gasutbytes- och befuktningskammare som innehåller vattenpärlor och en öppningsbar cellkammare med två pluggar för medieutbyte och uppsamling av sfäroider. (B) Utbyte av bioreaktormedier. Bioreaktorn fylls med 10 ml odlingssubstrat med hjälp av en spruta med nål. (C) Appen för systemkontroll. Rotationshastigheten, CO2-nivån, temperaturen, larmloggen och andra funktioner kan styras med hjälp av styrenheten. D) Bioreaktorn placeras i 3D-inkubatorn. Varje bioreaktor har en tillhörande motor som kan snurra bioreaktorn långsamt. (E) Bioreaktor i rörelse med varvtalet (rpm) styrt av en (C) tablett. Hastigheten (rpm) justeras efter sfäroidernas storlek. (F) Bioreaktorer inuti de 3D-inkubatorn. 3D-inkubatorn rymmer upp till 6 individuellt styrda bioreaktorer. Foto med tillstånd av Jason Torres Photography. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig02largev2.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig03.jpg"> Figur 3: Fenotypisk karakterisering av sfäroider via bildtagning . (A) Halvautomatisk sfäroidräkning. Efter att ha tagit ögonblicksbilder av sfäroiderna i bioreaktorn förbereds bilden för analys i FIJI. Varje sfäroid räknas och ett ID-nummer anges för var och en av dem. Ett makro används och resultatet visas med ID för den räknade sfäroiden, etiketten (namnet på bilden som analyserades) och arean (antalet pixlar som räknas i sfäroiden). (B) Planimetrisk bestämning av sfäroidarean. Med hjälp av ett makro bestäms arean, omkretsen och diametern för en specifik sfäroid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig04.jpg"> Figur 4: Proteomanalys av leversfäroider. (A) Sfäroidernas viabilitet beräknades baserat på frisättningen av adenylatkinas (AK) på odlingssupernatant. Resultaten är medelvärdet av duplicerade datapunkter ± SD. (B) Principalkomponentanalys (PCA) utfördes för att jämföra proteomet hos THLE-3 och HepG2/C3A flata celler och sfäroider. C) Relativ förekomst av metallothioneiner, som är proteiner som uttrycks av levern hos människa. Data representeras som medel ± SEM. (D) Funktionellt grupperade nätverk visar GO-anrikning för HepG2/C3A-sfäroider och (E) THLE-3-sfäroider, där endast etiketten för den mest signifikanta termen per grupp visas. Nätverket konstruerades med hjälp av ClueGo19. Nodstorleken representerar termen berikningsbetydelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Tilläggsfil 1: Makroskript för sfäroidräkning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Tilläggsfil 2: Makro för sfäroid planimetrisk bestämning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/Supplementary%20File%202.docx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures at JoVE.com

Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures

Vi presenterar ett protokoll för odling av högreproducerbara sfäroider och deras fenotypiska karakterisering med hjälp av bildfångst och proteomik.

Halvautomatisk fenotypisk analys av funktionella 3D-sfäroidcellkulturer

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell ...

Detta protokoll visar hur man odlar mycket reproducerbara sfäroider och visar hur proteomikexperiment kan utföras för att karakterisera den biologiska funktionen hos 3D-strukturer. Vår 3D-kultur kan samtidigt producera hundratals biologiska replikat i samma bioreaktor, och LC-MS-metoden kan mäta förekomsten av tusentals proteiner i ett enda experiment. Stephanie Stransky, postdoktor från labbet, kommer att demonstrera proceduren.Till att börja med, ta suspensionen av HepG2/C3A- och THLE-3-celler. Räkna antalet celler och späd cellsuspensionen i komplett odlingssubstrat för att erhålla 1 miljon celler i en maximal volym av 1,5 milliliter. Tvätta brunnarna på en ultralåg, 24-håls rund bottenplatta med 0,5 milliliter odlingsmedium och centrifugera vid 3 000 g i fem minuter.Överför cellsuspensionen till plattan och centrifugera den i tre minuter vid 120 g. Inkubera sedan plattan för att initiera sfäroidbildning. Jämvikt sedan bioreaktorn 24 timmar innan sfäroiderna överförs genom att fylla fuktkammaren med 25 milliliter sterilt vatten och cellkammaren med nio milliliter odlingsmedia med en 10-milliliters spruta med en lång nål.Placera sedan bioreaktorn i en 3D-inkubator i 24 timmar vid 37 grader Celsius med 5 % koldioxid. Pipettera försiktigt sfäroiderna upp och ner med hjälp av en milliliter breda borrspetsar för att lossa dem från den ultralåga fästplattan och överföra dem till en vävnadsodlingsskål. För att fånga upp eventuella kvarvarande sfäroider, tvätta plattan med 0,5 ml förvärmt odlingsmedium och överför dem till odlingsskålen.Använd ett ljusmikroskop för att utvärdera sfäroidernas storlek, kompakthet och rundhet för att välja de som är tillräckligt formade. Överför den valda sfäroiden till den jämviktsbioreaktor fylld med fem milliliter färskt odlingsmedium. Fyll sedan hela bioreaktorn med färska odlingsmedier.Placera bioreaktorn i 3D-inkubatorn och justera rotationshastigheten med hjälp av styrenheten. Byt ut 10 milliliter gamla odlingsmedier mot 10 milliliter färska medier varannan till var tredje dag. Ändra rotationshastigheten varje gång efter att du har bytt ut materialet.Odla sfäroiderna i 15 dagar och dela dem i två färska bioreaktorer. Öppna 3D-appen som är installerad på surfplattan, välj bioreaktorn och ta bilden. Som ett alternativ, placera en svart bakgrund bakom bioreaktorn och se till att inget ljus reflekteras på cellkammaren.Ta bilden så nära bioreaktorn som möjligt. Samla sedan in sfäroider genom att ta bort fem milliliter media från bioreaktorn med hjälp av en spruta fäst vid en lång nål genom den övre porten. Se till att sfäroiderna går ner till bioreaktorns nedre mitt.Öppna nu den främre porten och samla upp sfäroiderna med en en milliliter bred borrspets. Överför dessa sfäroider till mikrocentrifugrör, centrifugera vid 500 g i fem minuter och kassera mediet. Tvätta sfäroiden genom att tillsätta 200 mikroliter HBSS för att ta bort FBS.Centrifugera sedan 500 g i fem minuter och kassera supernatanten. Sänk sedan ner sfäroidpelleten snabbt i flytande kväve för att frysa den och förvara denna frysta pellet vid minus 80 grader Celsius tills vidare bearbetning. För att lysera cellerna, ta ett rör med uppsamlade sfäroider och återsuspendera dem i 25 mikroliter 5% SDS.Homogenisera pelleten genom att pipettera upp och ner. Lös sedan upp ett mikrogram prover och 10 mikroliter 0,1 % triklorättiksyra. Efter att ha extraherat proteinet och rengjort proverna, ställ in MS-förvärvsmetoden för att generera MS/MS-spektra från de identifierade peptidsignalerna.Överför sedan plattan till nanolitervätskekromatografi autosampler. Ställ in hela MS-skanningen till 300 till 1, 100 massa-till-laddningsförhållande i Orbitrap. Justera upplösningen till 120000 och ställ in målet för automatisk förstärkningskontroll till 125.Ställ sedan in MS/MS i Orbitrap med ett sekventiellt isoleringsfönster på 50 massa-till-laddningsförhållande. Sikta det automatiska förstärkningskontrollmålet på 400 och ställ in en högre energikollisionsdissociationsenergi på 30. Enligt viabilitetsanalys av sfäroider ökar nivåerna av adenylatkinas fram till dag 17, vilket resulterar i cirka 7 % av celldöden.Därefter minskar dödligheten till under 5 %Dessutom visar en analys av den första huvudkomponenten en tydlig skillnad mellan sfäroidprover och plattcellskulturer. Den proteomiska analysen indikerade att THLE-3 och HepG2/C3A sfäroider har liknande profiler som återspeglar leverfunktionen. Dessutom visade sfäroiderna överuttryck av två isoformer av metallothioneiner jämfört med platta celler.Funktionellt grupperade nätverk visade genetisk ontologianrikning för kolhydratmetabolismen i HepG2/C3A- och THLE-3-sfärerna. För att undvika spill av tillväxtmedia, öppna eller stäng inte den främre porten när cellkammaren är helt fylld med vätska. Provberedningen och analysen som beskrivs i detta protokoll kan användas för att utforska proteomet i cellodling med hjälp av 2D- och 3D-metoder, såväl som vävnadsprover.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Masspektrometri och luminogent baserade metoder för att karaktärisera Fas I Metabolic kompetens<em&gt; In Vitro</em&gt; Cellkulturer

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Detektion och visualisering av DNA-skada-inducerad proteinkomplex i suspensionscellkulturer med användning av Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Halvautomatisk Biopanning bakteriell Display bibliotek för peptid affinitet reagens identifiering och analys av resulterande isolat

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

Dissektion av mänskliga näthinnan och RPE-åderhinnan för proteomiska analys

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

Förbättrat protokoll för kromatin Immunoprecipitation från mus skelettmuskulatur

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Studie om metabolismen av sex systemiska insekticider i en nyetablerad cell SUS pension kultur härledd från Tea (Camellia sinensis L.) Lämnar

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Real-Time, semi-automatiserad fluorescerande mätning av luftvägarna yta flytande pH i primära humana luftvägs epitelceller

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Encellsanalys av transkriptionellt aktiva alleler med enmolekylig FISK

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Cellfri produktion av proteoliposomer för funktionell analys och antikroppsutveckling riktad mot membranproteiner

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analys av neutral lipidsyntes i Sackaromyces cerevisiae av metabolisk märkning och tunnskiktskromatografi

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...