Name: efficient vascularization of kidney organoids through intracelomic transplantation in chicken embryos
Uploaded: 2023-02-17T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Vascularization of Kidney Organoids through Intracelomic Transplantation in Chicken Embryos at JoVE.com

نشكر جورج غالاريس (LUMC ، ليدن ، هولندا) على مساعدته في حقن أجنة الدجاج. نحن نعترف بدعم ساسكيا فان دير وال ماس (قسم التشريح وعلم الأجنة ، LUMC ، ليدن ، هولندا) ، كوني فان مونستيرين (قسم التشريح وعلم الأجنة ، LUMC ، ليدن ، هولندا) ، مانون زورموند (LUMC ، ليدن ، هولندا) ، وآن ماري دي غراف (LUMC ، ليدن ، هولندا). M. Koning مدعوم من قبل 'Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC'. تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل صندوق جامعة ليدن "صندوق البروفيسور ياب دي جراف لينجلينج ويادهانرما" GWF2019-02. يتم دعم هذا العمل من قبل شركاء الطب التجديدي عبر الحدود (RegMedXB) و Health Holland ، أعلى قطاع علوم الحياة والصحة. يتم دعم C.W. van den Berg و T.J. Rabelink من قبل مركز مؤسسة نوفو نورديسك لطب الخلايا الجذعية (reNEW) ، ويتم دعم مركز مؤسسة نوفو نورديسك لطب الخلايا الجذعية من خلال منح مؤسسة نوفو نورديسك (NNF21CC0073729).

وفقا للقانون الهولندي ، لم تكن موافقة لجنة رعاية الحيوان مطلوبة لهذا البحث.
1. تحضير عضويات الكلى المشتقة من hiPSC للزراعة
<ol><li>قم بتمييز hiPSCs إلى عضويات الكلى باستخدام البروتوكول الذي طوره Takasato et al.4،18،31. استزراع الك?...

<ol>
	<li>Taguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+in+vivo+origin+of+metanephric+nephron+progenitors+enables+generation+of+complex+kidney+structures+from+pluripotent+stem+cells.">Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).</li><li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury.">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li><li>Kim, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-edited+human+kidney+organoids+reveal+mechanisms+of+disease+in+podocyte+development.">Gene-edited human kidney organoids reveal mechanisms of disease in podocyte development.</a> Stem Cells. 35 (12), 2366-2378 (2017).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Hale, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+organoid-derived+human+glomeruli+for+personalised+podocyte+disease+modelling+and+drug+screening.">3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening.</a> Nature Communications. 9 (1), 5167 (2018).</li><li>Vanslambrouck, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+metanephric+specification+to+functional+proximal+tubule+enables+toxicity+screening+and+infectious+disease+modelling+in+kidney+organoids.">Enhanced metanephric specification to functional proximal tubule enables toxicity screening and infectious disease modelling in kidney organoids.</a> Nature Communications. 13 (1), 5943 (2022).</li><li>Tanigawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+from+nephrotic+disease-derived+iPSCs+identify+impaired+NEPHRIN+localization+and+slit+diaphragm+formation+in+kidney+podocytes.">Organoids from nephrotic disease-derived iPSCs identify impaired NEPHRIN localization and slit diaphragm formation in kidney podocytes.</a> Stem Cell Reports. 11 (3), 727-740 (2018).</li><li>Forbes, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-iPSC-derived+kidney+organoids+show+functional+validation+of+a+ciliopathic+renal+phenotype+and+reveal+underlying+pathogenetic+mechanisms.">Patient-iPSC-derived kidney organoids show functional validation of a ciliopathic renal phenotype and reveal underlying pathogenetic mechanisms.</a> American Journal of Human Genetics. 102 (5), 816-831 (2018).</li><li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids.">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communications. 6, 8715 (2015).</li><li>Cruz, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cystogenesis+reveals+a+critical+role+of+microenvironment+in+human+polycystic+kidney+disease.">Organoid cystogenesis reveals a critical role of microenvironment in human polycystic kidney disease.</a> Nature Materials. 16 (11), 1112-1119 (2017).</li><li>Gupta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+injury+and+repair+in+kidney+organoids+reveals+that+homologous+recombination+governs+tubular+intrinsic+repair.">Modeling injury and repair in kidney organoids reveals that homologous recombination governs tubular intrinsic repair.</a> Science Translational Medicine. 14 (634), eabj4772 (2022).</li><li>Hiratsuka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid-on-a-chip+model+of+human+ARPKD+reveals+mechanosensing+pathomechanisms+for+drug+discovery.">Organoid-on-a-chip model of human ARPKD reveals mechanosensing pathomechanisms for drug discovery.</a> Scencei Advances. 8 (38), eabq0866 (2022).</li><li>Dorison, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+generated+using+an+allelic+series+of+NPHS2+point+variants+reveal+distinct+intracellular+podocin+mistrafficking.">Kidney organoids generated using an allelic series of NPHS2 point variants reveal distinct intracellular podocin mistrafficking.</a> Journal of the American Society of Nephrology. , (2022).</li><li>Eremina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular-specific+alterations+of+VEGF-A+expression+lead+to+distinct+congenital+and+acquired+renal+diseases.">Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases.</a> The Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).</li><li>Kitamoto, Y., Tokunaga, H., Tomita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+is+an+essential+molecule+for+mouse+kidney+development:+glomerulogenesis+and+nephrogenesis.">Vascular endothelial growth factor is an essential molecule for mouse kidney development: glomerulogenesis and nephrogenesis.</a> The Journal of Clinical Investigation. 99 (10), 2351-2357 (1997).</li><li>Sison, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+structure+and+function+require+paracrine,+not+autocrine,+VEGF-VEGFR-2+signaling.">Glomerular structure and function require paracrine, not autocrine, VEGF-VEGFR-2 signaling.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 21 (10), 1691-1701 (2010).</li><li>Ryan, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+deficiencies+in+renal+organoids+and+ex+vivo+kidney+organogenesis.">Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis.</a> Developmental Biology. 477, 98-116 (2021).</li><li>vanden Berg, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+subcapsular+transplantation+of+PSC-derived+kidney+organoids+induces+neo-vasculogenesis+and+significant+glomerular+and+tubular+maturation+in+vivo.">Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).</li><li>Sharmin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+podocytes+mature+into+vascularized+glomeruli+upon+experimental+transplantation.">Human induced pluripotent stem cell-derived podocytes mature into vascularized glomeruli upon experimental transplantation.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1778-1791 (2016).</li><li>Bantounas, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functioning+nephrons+by+implanting+human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+progenitors.">Generation of functioning nephrons by implanting human pluripotent stem cell-derived kidney progenitors.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 766-779 (2018).</li><li>vanden Berg, C. W., Koudijs, A., Ritsma, L., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+assessment+of+size-selective+glomerular+sieving+in+transplanted+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+organoids.">In vivo assessment of size-selective glomerular sieving in transplanted human induced pluripotent stem cell-derived kidney organoids.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 31 (5), 921-929 (2020).</li><li>Asai, R., Bressan, M., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avians+as+a+model+system+of+vascular+development.">Avians as a model system of vascular development.</a> Methods in Molecular Biology. 2206, 103-127 (2021).</li><li>Jankovic, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+capacity+of+the+chicken+embryo.+I.+Relationship+between+the+maturation+of+lymphoid+tissues+and+the+occurrence+of+cell-mediated+immunity+in+the+developing+chicken+embryo.">Immunological capacity of the chicken embryo. I. Relationship between the maturation of lymphoid tissues and the occurrence of cell-mediated immunity in the developing chicken embryo.</a> Immunology. 29 (3), 497-508 (1975).</li><li>Alkie, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+innate+immunity+in+chicken+embryos+and+newly+hatched+chicks:+a+disease+control+perspective.">Development of innate immunity in chicken embryos and newly hatched chicks: a disease control perspective.</a> Avian Pathology. 48 (4), 288-310 (2019).</li><li>Rawles, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+normal+embryonic+tissues.">Transplantation of normal embryonic tissues.</a> Annalls of the New York Academy of Sciences. 55 (2), 302-312 (1952).</li><li>Rawles, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+melanophores+from+embryonic+mouse+tissues+grown+in+the+coelom+of+chick+embryos.">The development of melanophores from embryonic mouse tissues grown in the coelom of chick embryos.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 26 (12), 673-680 (1940).</li><li>Garreta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+tuning+the+extracellular+environment+accelerates+the+derivation+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Materials. 18 (4), 397-405 (2019).</li><li>Koning, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculogenesis+in+kidney+organoids+upon+transplantation.">Vasculogenesis in kidney organoids upon transplantation.</a> NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 40 (2022).</li><li>Hamburger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenetic+and+axial+self-differentiation+of+transplanted+limb+primordia+of+2-day+chick+embryos.">Morphogenetic and axial self-differentiation of transplanted limb primordia of 2-day chick embryos.</a> Journal of Experimental Zoology. 77 (3), 379-399 (1938).</li><li>Dossel, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+of+intracelomic+grafting.">New method of intracelomic grafting.</a> Science. 120 (3111), 262-263 (1954).</li><li>Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).</li><li>Aleksandrowicz, E., Herr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethical+euthanasia+and+short-term+anesthesia+of+the+chick+embryo.">Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo.</a> ALTEX. 32 (2), 143-147 (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACUC.">ACUC.</a> Guideline: The Use and Euthanasia Procedures of Chicken/Avian Embryos. , (2012).</li></ol>

في هذه المخطوطة ، تم عرض بروتوكول للزرع داخل المخ لعضويات الكلى المشتقة من hiPSC في أجنة الدجاج. عند الزرع ، يتم الأوعية الدموية العضوية بواسطة الأوعية الدموية المثقوبة التي تتكون من مزيج من ECs المشتقة من الأعضاء البشرية والمشتقة من الدجاج. تنتشر هذه في جميع أنحاء العضوية وتغزو الهياكل الكبي...

لقد ثبت أن عضويات الكلى المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSC) لديها إمكانات للدراسات التنموية1،2،3،4 ، وفحص السمية 5،6 ، ونمذجة المرض5،7،8،9،10،11،12،13. ومع ذلك ، فإن قابليتها للتطبيق لهذه الأغراض وأغراض الزرع السريري في نهاية المطاف محدودة بسبب عدم وجود شبكة الأوعية الدموية. أثناء نمو الكلى الجنينية ، تتفاعل الخلايا القلبية والخلايا المتوسطة والخلايا البطانية الوعائية (ECs) لتشكيل البنية المعقدة للكبيبة. بدون هذا التفاعل ، لا يمكن أن يتطور حاجز الترشيح الكبيبي ، الذي يتكون من الخلايا الدموية ، والغشاء القاعدي الكبيبي (GBM) ، و ECs ، بشكل صحيح14،15،16. على الرغم من أن عضويات الكلى في المختبر تحتوي على بعض ECs ، إلا أنها تفشل في تكوين شبكة أوعية دموية مناسبة وتتضاءل بمرور الوقت17. لذلك ليس من المستغرب أن تظل الكائنات العضوية غير ناضجة. زرع في الفئران يحفز الأوعية الدموية ونضوج عضويات الكلى18،19،20،21. لسوء الحظ ، هذه عملية كثيفة العمالة وغير مناسبة لتحليل أعداد كبيرة من المواد العضوية.
تم استخدام أجنة الدجاج لدراسة الأوعية الدموية وتطورها لأكثر منقرن 22. يمكن الوصول إليها بسهولة ، وتتطلب صيانة منخفضة ، وتفتقر إلى نظام مناعي يعمل بكامل طاقته ، ويمكن أن تتطور بشكل طبيعي بعد فتح قشر البيض23،24،25،26. ثبت أن زرع المواد العضوية على الغشاء المشيمي الولعي (CAM) يؤدي إلى الأوعية الدموية27. ومع ذلك ، فإن مدة الزرع على CAM ، وكذلك مستوى نضوج الكسب غير المشروع ، محدودة بتكوين الطب التكميلي والبديل ، والذي يستغرق حتى اليوم الجنيني 7 حتى يكتمل. لذلك ، تم تطوير طريقة مؤخرا لكفاءة الأوعية الدموية وعضويات الكلى الناضجة من خلال زرع inenterlomic في أجنة الدجاج28. من المعروف أن التجويف السيلومي لأجنة الدجاج منذ ثلاثينيات القرن العشرين هو بيئة مواتية لتمايز الأنسجة الجنينية29,30. يمكن الوصول إليه في وقت مبكر من التطور الجنيني ويسمح بتوسع غير محدود نسبيا للكسب غير المشروع في جميع الاتجاهات.
تحدد هذه الورقة بروتوكولا لزرع عضويات الكلى المشتقة من hiPSC في التجويف السيلومي لأجنة الدجاج في اليوم 4. هذه الطريقة تحفز الأوعية الدموية وتعزيز نضوج المواد العضوية في غضون 8 أيام. يتيح حقن عدسة كوليناريس أغلوتينين (LCA) ذات العلامات الفلورية قبل التضحية بالأجنة تصور الأوعية الدموية المثقوبة داخل المواد العضوية من خلال الفحص المجهري متحد البؤر.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>10462200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes&#160;</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>Contains silicone tubes, mouth piece and connector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHTC091-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHTC090-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope&#160;</td>
			<td>Wild Heerbrugg</td>
			<td>355110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHSB391-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-&#945;-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-212-02</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-&#945;-sheep Alexa Fluor 647</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21448</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edged stainless steel razor blades</td>
			<td>Electron Microsopy Sciences</td>
			<td>72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg cartons or custom made egg holders&#160;</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus)&#160;</td>
			<td>Drost Loosdrecht B.V.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Elbanton BV</td>
			<td>ET-3 combi</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>B-1325</td>
			<td>dilution 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHSB500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150F-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td>We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws.</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>L-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olivecrona dura dissector 18 cm&#160;</td>
			<td>Reda</td>
			<td>41146-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm&#160;</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HS234526B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated spoon&#160;</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>S-20-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 x 15 mm&#160;</td>
			<td>CELLSTAR</td>
			<td>628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipettes&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PP89SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified mouse anti-human CD31 antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555444</td>
			<td>dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>RL-1042</td>
			<td>This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-human NPHS1 antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>AF4269</td>
			<td>dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile hypodermic needles, 19 G</td>
			<td>BD microlance</td>
			<td>301500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Alexa Fluor 405</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S32351</td>
			<td>dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 5 mL</td>
			<td>BD Emerald</td>
			<td>307731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent tape&#160;</td>
			<td>Tesa</td>
			<td>4124</td>
			<td>Available at most hardware stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire, 0.25 mm dia&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>010404.H2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient vascularization of kidney organoids through intracelomic transplantation in chicken embryos

تحتوي عضويات الكلى المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان على هياكل تشبه النيفرون تشبه تلك الموجودة في الكلى البالغة إلى حد ما. لسوء الحظ ، فإن قابليتها للتطبيق السريري يعوقها عدم وجود الأوعية الدموية الوظيفية وبالتالي النضج المحدود في المختبر. إن زرع عضويات الكلى في التجويف السيلومي لأجنة الدجاج يحفز الأوعية الدموية عن طريق الأوعية الدموية المثقوبة ، بما في ذلك تكوين الشعيرات الدموية الكبيبية ، ويعزز نضجها. هذه التقنية فعالة للغاية ، مما يسمح بزرع وتحليل أعداد كبيرة من المواد العضوية. تصف هذه الورقة بروتوكولا مفصلا للزرع الداخلي لعضويات الكلى في أجنة الدجاج ، يليه حقن الليكتين المسمى بالفلورسنت لتلطيخ الأوعية الدموية المثقوبة ، وجمع المواد العضوية المزروعة لتحليل التصوير. يمكن استخدام هذه الطريقة للحث على دراسة الأوعية الدموية العضوية والنضج للعثور على أدلة لتعزيز هذه العمليات في المختبر وتحسين نمذجة المرض.

تم تلخيص الطريقة والجدول الزمني لتمايز hiPSCs إلى عضويات الكلى ، وحضانة بيض الدجاج المخصب ، وزرع عضويات الكلى ، وحقن LCA ، وجمع المواد العضوية في الشكل 1 أ. من المهم تنسيق توقيت التمايز العضوي وحضانة بيض الدجاج ، بدءا من التمايز قبل 15 يوما من الحضانة. يتم توضيح الإجراءات في اليو?...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Vascularization of Kidney Organoids through Intracelomic Transplantation in Chicken Embryos at JoVE.com

Efficient Vascularization of Kidney Organoids through Intracelomic Transplantation in Chicken Embryos

هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لزرع عضويات الكلى في التجويف السيلومي لأجنة الدجاج. تحفز هذه الطريقة الأوعية الدموية والنضج المعزز للعضويات في غضون 8 أيام ويمكن استخدامها لدراسة هذه العمليات بطريقة فعالة.

الأوعية الدموية الفعالة لعضويات الكلى من خلال زرع Inenterlomic في أجنة الدجاج

Kidney organoids derived from human induced pluripotent stem cells contain nephron-like structures that resemble those in the adult kidney to a certain ...

عضويات الكلى المستزرعة في المختبر لا تزال غير ناضجة ، مما يحد من قابليتها للتطبيق. وهذه الطريقة في الزرع داخل الأوعية الدموية تحفز الأوعية الدموية وتعزز نضوج الكائنات العضوية. الإجراء فعال للغاية ، مما يسمح بزرع وتحليل عدد كبير من الكائنات العضوية في تجربة واحدة.بعد تحضير عضويات الكلى المشتقة من HIPSC واحتضان بيض leghorn المخصب ، قم بإنشاء نافذة في قشر البيض في اليوم الثالث من الحضانة. ضع قطعة صغيرة من الشريط الشفاف على الطرف المدبب للبيضة. اصنع ثقبا صغيرا في قشر البيض في منتصف الشريط الشفاف عن طريق النقر عليه بنهاية حادة لزوج من مقص التشريح.بعد ذلك ، أدخل إبرة قياس 19 على حقنة سعة خمسة ملليلتر في الفتحة بزاوية 45 درجة. نضح ملليلتر إلى ثلاثة ملليلتر من الألبومين من البويضة لخفض الجنين داخل البيضة. قم بإخفاء الفتحة بقطعة ثانية من الشريط الشفاف ، ثم ضع قطعة كبيرة من الشريط الشفاف على القلم الرصاص المحدد لأعلى الجانب المواجه لأعلى من البيضة.اصنع ثقبا في قشر البيض في منتصف الشريط الشفاف عن طريق النقر عليه بنهاية حادة لزوج من مقص التشريح. قطع نافذة دائرية صغيرة في قشر البيض من هذه الحفرة باستخدام مقص تشريح منحني. انظر من خلال هذه النافذة لتحديد موقع الجنين.ثم قم بتكبير النافذة لتحسين الوصول إلى الجنين. قم بإزالة أي قطع كبيرة من قشر البيض قد تكون سقطت فوق الجنين باستخدام ملقط. قم بإزالة القطع الصغيرة عن طريق وضع بضع قطرات من DPBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم على الجنين باستخدام ماصة نقل البلاستيك ، ثم استنشاق DPBS مع قشر البيض في الماصة.باستخدام ماصة نقل البلاستيك ، أضف ثلاث قطرات من DPBS ، تستكمل مع 0.5 ٪ البنسلين الستربتومايسين إلى البيضة. أغلق النافذة بعناية بقطعة كبيرة من الشريط الشفاف قبل وضع البويضة مرة أخرى في الحاضنة حتى اليوم الرابع من الحضانة. قطع الشريط من النافذة مع مقص تشريح منحني.ضع البيضة تحت مجهر تشريح على حامل مطاطي أو كرتون بيض. جنين الدجاج الآن في مرحلة هامبرغر هاميلتون من 23 إلى 24 وملقى على جانبه الأيسر وجانبه الأيمن مواجه للمشاهد. حدد موقع الجناح الأيمن وبرعم الساق للجنين حيث سيتم تقييم coelom بين هذين البرعمين الطرفين.في المنطقة الواقعة بين الجناح الأيمن وبرعم الساق ، قم بإنشاء فتحة متتالية في غشاء vitelline ، والمشيمة ، والسلى عن طريق إمساكها بزوجين من ملقط التشريح وسحبها برفق في اتجاهين متعاكسين. تحقق مما إذا كان هناك وصول دون عائق إلى التجويف القولوني. أمسك برفق بحافة جدار الجسم بين الجناح وبرعم الطرف بزوج من ملقط التشريح واسحبه قليلا نحو المشاهد.يجب أن يكون تجويف coelomic مرئيا بوضوح. أدخل بعناية أداة حادة ولكن رفيعة في تجويف coelomic. ضع نصف عضوي داخل البيضة فوق الألانتوا باستخدام تشريح الجافية.باستخدام ملقط التشريح ، أمسك بعناية بحافة جدار الجسم واسحبها قليلا نحو المشاهد لجعل فتحة الكويلوم مرئية. حرك العضو العضوي برفق نحو ومن خلال الفتحة الموجودة في جدار الجسم إلى الكويلوم باستخدام سلك تنغستن غير حاد وحامل مشرط صغير. ادفع العضو العضوي قليلا إلى الجمجمة لتثبيته داخل الكويل.يمكن رؤيته الآن خلف برعم الجناح مباشرة. أضف ثلاث قطرات من DPBS إلى البيضة باستخدام ماصة نقل بلاستيكية. أغلق النافذة بعناية بقطعة كبيرة من الشريط الشفاف قبل وضع البويضة مرة أخرى في الحاضنة حتى اليوم 12 من الحضانة.قطع الشريط من النافذة مع مقص تشريح منحني. ضع البيضة تحت مجهر تشريح في حامل مطاطي. تقييم الأوعية الدموية وتحديد الأوردة ، والتي يمكن تمييزها عن الشرايين بلونها الأحمر الأكثر إشراقا قليلا.لتحسين الوصول إلى الأوعية الدموية ، قم بتكبير النافذة بعناية عن طريق قصها بمقص تشريح منحني. بعد اختيار الوريد ، أدخل طرف الإبرة الشعرية الدقيقة في الوريد بزاوية من صفر إلى 20 درجة. تأكد من وجود الإبرة في الوريد عن طريق تحريك الطرف برفق من جانب إلى آخر.نفخ بلطف وثبات في نظام الحقن لحقن عدسة كوليناريس agglutinin. ضع البيضة مرة أخرى في الحاضنة لمدة 10 دقائق للسماح لها بالدوران. ضع البيضة في حامل مطاطي على المقعد.ثم ، قطع الأغشية المحيطة بالجنين بمقص تشريح منحني. اغرف الجنين من البيضة بملعقة مثقبة وقطع رأس الجنين على الفور باستخدام المقص. تحت مجهر التشريح ، ضع جسم الجنين في طبق بتري.ضع الجنين على ظهره في طبق بتري وانشر أطرافه. افتح بعناية جدار البطن للجنين على طول المحور الطولي باستخدام ملقط. حدد موقع العضو العضوي داخل الجنين.غالبا ما يصبح العضو العضوي مرتبطا بفص الكبد الأيمن ، إما عند طرف التدليل أو في الجمجمة ، أسفل القفص الصدري مباشرة. لذلك ، من المستحسن أن تبدأ بالنظر إلى هذه المواقع. بمجرد تحديد موقع العضو العضوي ، قم بإزالته من الجنين عن طريق قطعه بمقص صغير.ضع العضو العضوي في أنسجة الدجاج التي تعلق عليه حتما في طبق بتري تحت مجهر التشريح. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من مناديل الدجاج باستخدام شفرة حلاقة ذات حدين من الفولاذ المقاوم للصدأ. تحتوي الصور المناعية الفلورية لعضو الكلى غير المزروع والعضو العضوي الكلوي المزروع على هياكل كبيبية وأنبوبية.في الكائنات العضوية غير المزروعة ، توجد بعض الخلايا البطانية البشرية. في العضو العضوي المزروع ، تظهر شبكة الأوعية الدموية المثقوبة في جميع أنحاء العضو العضوي. توضح الصور المكبرة للمناطق المحاصرة الأنواع الثلاثة للخلايا البطانية التي يمكن تمييزها في الكائنات العضوية المزروعة: الخلايا البطانية البشرية المثقوبة ، والخلايا البطانية البشرية غير المثقوبة ، والخلايا البطانية المشتقة من الدجاج.في الكائنات العضوية غير المزروعة ، تحيط الخلايا البطانية بالهياكل الكبيبية ولكنها لا تغزوها. ومع ذلك ، في الكائنات العضوية المزروعة ، يتم الأوعية الدموية للهياكل الكبيبية بواسطة الشعيرات الدموية المثقوبة. يمكن تحليل المواد العضوية المزروعة باستخدام تقنيات مختلفة اعتمادا على الهدف من التجربة.يمكن أن توفر المقارنة المباشرة مع الضوابط غير المزروعة نظرة ثاقبة لعملية الأوعية الدموية والنضج.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

وضع العلامات المزدوجة من خلايا كريست العصبية والأوعية الدموية داخل أجنة الدجاج باستخدام الفرخGFP تطعيم الأنبوب العصبي وكاروتشيانين صبغ DiI حقن

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

إإكسبلنتس الشبكية كاملة من الدجاج الأجنة لعلاج Electroporation للوالكيميائية الكاشف

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

تقنية لاستهداف حقن مكروي إلى البلدان النامية<em&gt; القيطم</em&gt; الكلى

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

وسيلة فعالة للحصول على خلايا Dedifferentiated الدهون

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

في أوفو إليكتروبوراتيون في الدماغ الدماغ السمعي

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

تتبع التعبير الجيني من خلال الكشف عن نشاط β-جالاكتوسيداسي في الأجنة كله الماوس

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

تصور بالعقدة ولوحة نوتوتشوردال في جاسترولاتينج الأجنة الماوس باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني المسح وكله جبل الفلورة

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

التعبير السريع والفعال عن البروتينات المتعددة في أجنة الطيور باستخدام الكهربة mRNA

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

طريقة مبسطة لتوليد عضويات الكلى من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات

Kidney organoids generated from hPSCs have provided an unlimited source of renal tissue. Human kidney organoids are an invaluable tool for studying kidney ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

جهاز زرع بسيط وفعال لأجنة حمار وحشي

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...