Name: efficient vascularization of kidney organoids through intracelomic transplantation in chicken embryos
Uploaded: 2023-02-17T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Vascularization of Kidney Organoids through Intracelomic Transplantation in Chicken Embryos at JoVE.com

Vi takker George Galaris (LUMC, Leiden, Holland) for hans hjælp med injektion af kyllingeembryoner. Vi anerkender støtten fra Saskia van der Wal-Maas (Institut for Anatomi & Embryologi, LUMC, Leiden, Holland), Conny van Munsteren (Institut for Anatomi & Embryologi, LUMC, Leiden, Holland), Manon Zuurmond (LUMC, Leiden, Holland) og Annemarie de Graaf (LUMC, Leiden, Holland). M. Koning støttes af »Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC«. Dette arbejde blev delvist støttet af Leiden University Fund "Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fund" GWF2019-02. Dette arbejde støttes af partnerne i Regenerative Medicine Crossing Borders (RegMedXB) og Health Holland, Top Sector Life Sciences & Health. C.W. van den Berg og T.J. Rabelink er støttet af The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Cell Medicine er støttet af Novo Nordisk Fondens bevillinger (NNF21CC0073729).

I henhold til nederlandsk lovgivning var godkendelse fra dyrevelfærdsudvalget ikke påkrævet for denne forskning.
1. Forberedelse af hiPSC-afledte nyreorganoider til transplantation
<ol><li>Differentier hiPSC'er til nyreorganoider ved hjælp af protokollen udviklet af Takasato et al.4,18,31. Kultur organoiderne efter denne protokol om polyestercellekulturindsatser med 0,4 μm pore...

<ol>
	<li>Taguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+in+vivo+origin+of+metanephric+nephron+progenitors+enables+generation+of+complex+kidney+structures+from+pluripotent+stem+cells.">Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).</li><li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury.">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li><li>Kim, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-edited+human+kidney+organoids+reveal+mechanisms+of+disease+in+podocyte+development.">Gene-edited human kidney organoids reveal mechanisms of disease in podocyte development.</a> Stem Cells. 35 (12), 2366-2378 (2017).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Hale, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+organoid-derived+human+glomeruli+for+personalised+podocyte+disease+modelling+and+drug+screening.">3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening.</a> Nature Communications. 9 (1), 5167 (2018).</li><li>Vanslambrouck, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+metanephric+specification+to+functional+proximal+tubule+enables+toxicity+screening+and+infectious+disease+modelling+in+kidney+organoids.">Enhanced metanephric specification to functional proximal tubule enables toxicity screening and infectious disease modelling in kidney organoids.</a> Nature Communications. 13 (1), 5943 (2022).</li><li>Tanigawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+from+nephrotic+disease-derived+iPSCs+identify+impaired+NEPHRIN+localization+and+slit+diaphragm+formation+in+kidney+podocytes.">Organoids from nephrotic disease-derived iPSCs identify impaired NEPHRIN localization and slit diaphragm formation in kidney podocytes.</a> Stem Cell Reports. 11 (3), 727-740 (2018).</li><li>Forbes, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-iPSC-derived+kidney+organoids+show+functional+validation+of+a+ciliopathic+renal+phenotype+and+reveal+underlying+pathogenetic+mechanisms.">Patient-iPSC-derived kidney organoids show functional validation of a ciliopathic renal phenotype and reveal underlying pathogenetic mechanisms.</a> American Journal of Human Genetics. 102 (5), 816-831 (2018).</li><li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids.">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communications. 6, 8715 (2015).</li><li>Cruz, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cystogenesis+reveals+a+critical+role+of+microenvironment+in+human+polycystic+kidney+disease.">Organoid cystogenesis reveals a critical role of microenvironment in human polycystic kidney disease.</a> Nature Materials. 16 (11), 1112-1119 (2017).</li><li>Gupta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+injury+and+repair+in+kidney+organoids+reveals+that+homologous+recombination+governs+tubular+intrinsic+repair.">Modeling injury and repair in kidney organoids reveals that homologous recombination governs tubular intrinsic repair.</a> Science Translational Medicine. 14 (634), eabj4772 (2022).</li><li>Hiratsuka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid-on-a-chip+model+of+human+ARPKD+reveals+mechanosensing+pathomechanisms+for+drug+discovery.">Organoid-on-a-chip model of human ARPKD reveals mechanosensing pathomechanisms for drug discovery.</a> Scencei Advances. 8 (38), eabq0866 (2022).</li><li>Dorison, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+generated+using+an+allelic+series+of+NPHS2+point+variants+reveal+distinct+intracellular+podocin+mistrafficking.">Kidney organoids generated using an allelic series of NPHS2 point variants reveal distinct intracellular podocin mistrafficking.</a> Journal of the American Society of Nephrology. , (2022).</li><li>Eremina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular-specific+alterations+of+VEGF-A+expression+lead+to+distinct+congenital+and+acquired+renal+diseases.">Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases.</a> The Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).</li><li>Kitamoto, Y., Tokunaga, H., Tomita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+is+an+essential+molecule+for+mouse+kidney+development:+glomerulogenesis+and+nephrogenesis.">Vascular endothelial growth factor is an essential molecule for mouse kidney development: glomerulogenesis and nephrogenesis.</a> The Journal of Clinical Investigation. 99 (10), 2351-2357 (1997).</li><li>Sison, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+structure+and+function+require+paracrine,+not+autocrine,+VEGF-VEGFR-2+signaling.">Glomerular structure and function require paracrine, not autocrine, VEGF-VEGFR-2 signaling.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 21 (10), 1691-1701 (2010).</li><li>Ryan, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+deficiencies+in+renal+organoids+and+ex+vivo+kidney+organogenesis.">Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis.</a> Developmental Biology. 477, 98-116 (2021).</li><li>vanden Berg, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+subcapsular+transplantation+of+PSC-derived+kidney+organoids+induces+neo-vasculogenesis+and+significant+glomerular+and+tubular+maturation+in+vivo.">Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).</li><li>Sharmin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+podocytes+mature+into+vascularized+glomeruli+upon+experimental+transplantation.">Human induced pluripotent stem cell-derived podocytes mature into vascularized glomeruli upon experimental transplantation.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1778-1791 (2016).</li><li>Bantounas, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functioning+nephrons+by+implanting+human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+progenitors.">Generation of functioning nephrons by implanting human pluripotent stem cell-derived kidney progenitors.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 766-779 (2018).</li><li>vanden Berg, C. W., Koudijs, A., Ritsma, L., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+assessment+of+size-selective+glomerular+sieving+in+transplanted+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+organoids.">In vivo assessment of size-selective glomerular sieving in transplanted human induced pluripotent stem cell-derived kidney organoids.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 31 (5), 921-929 (2020).</li><li>Asai, R., Bressan, M., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avians+as+a+model+system+of+vascular+development.">Avians as a model system of vascular development.</a> Methods in Molecular Biology. 2206, 103-127 (2021).</li><li>Jankovic, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+capacity+of+the+chicken+embryo.+I.+Relationship+between+the+maturation+of+lymphoid+tissues+and+the+occurrence+of+cell-mediated+immunity+in+the+developing+chicken+embryo.">Immunological capacity of the chicken embryo. I. Relationship between the maturation of lymphoid tissues and the occurrence of cell-mediated immunity in the developing chicken embryo.</a> Immunology. 29 (3), 497-508 (1975).</li><li>Alkie, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+innate+immunity+in+chicken+embryos+and+newly+hatched+chicks:+a+disease+control+perspective.">Development of innate immunity in chicken embryos and newly hatched chicks: a disease control perspective.</a> Avian Pathology. 48 (4), 288-310 (2019).</li><li>Rawles, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+normal+embryonic+tissues.">Transplantation of normal embryonic tissues.</a> Annalls of the New York Academy of Sciences. 55 (2), 302-312 (1952).</li><li>Rawles, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+melanophores+from+embryonic+mouse+tissues+grown+in+the+coelom+of+chick+embryos.">The development of melanophores from embryonic mouse tissues grown in the coelom of chick embryos.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 26 (12), 673-680 (1940).</li><li>Garreta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+tuning+the+extracellular+environment+accelerates+the+derivation+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Materials. 18 (4), 397-405 (2019).</li><li>Koning, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculogenesis+in+kidney+organoids+upon+transplantation.">Vasculogenesis in kidney organoids upon transplantation.</a> NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 40 (2022).</li><li>Hamburger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenetic+and+axial+self-differentiation+of+transplanted+limb+primordia+of+2-day+chick+embryos.">Morphogenetic and axial self-differentiation of transplanted limb primordia of 2-day chick embryos.</a> Journal of Experimental Zoology. 77 (3), 379-399 (1938).</li><li>Dossel, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+of+intracelomic+grafting.">New method of intracelomic grafting.</a> Science. 120 (3111), 262-263 (1954).</li><li>Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).</li><li>Aleksandrowicz, E., Herr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethical+euthanasia+and+short-term+anesthesia+of+the+chick+embryo.">Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo.</a> ALTEX. 32 (2), 143-147 (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACUC.">ACUC.</a> Guideline: The Use and Euthanasia Procedures of Chicken/Avian Embryos. , (2012).</li></ol>

I dette manuskript demonstreres en protokol for intracelomisk transplantation af hiPSC-afledte nyreorganoider i kyllingembryoner. Ved transplantation vaskulariseres organoider af perfunderede blodkar, der består af en kombination af humane organoidafledte og kyllingafledte EC'er. Disse spredes gennem organoiden og invaderer de glomerulære strukturer, hvilket muliggør interaktion mellem EC'erne og podocytterne. Det blev tidligere vist, at dette fører til forbedret modning af de organoide glomerulære og rørformede st...

Human induceret pluripotent stamcelle (hiPSC)-afledte nyreorganoider har vist sig at have potentiale for udviklingsstudier 1,2,3,4, toksicitetsscreening 5,6 og sygdomsmodellering 5,7,8,9,10,11,12,13 . Imidlertid er deres anvendelighed til disse og eventuelle kliniske transplantationsformål begrænset af manglen på et vaskulært netværk. Under embryonal nyreudvikling interagerer podocytter, mesangialceller og vaskulære endotelceller (EC'er) for at danne glomerulus indviklede struktur. Uden denne interaktion kan den glomerulære filtreringsbarriere, der består af podocytter, den glomerulære kældermembran (GBM) og EC'er, ikke udvikle sig korrekt14,15,16. Selvom nyreorganoider in vitro indeholder nogle EC'er, undlader disse at danne et ordentligt vaskulært netværk og mindskes over tid17. Det er derfor ikke overraskende, at organoiderne forbliver umodne. Transplantation hos mus inducerer vaskularisering og modning af nyreorganoiderne 18,19,20,21. Desværre er dette en arbejdskrævende proces, der er uegnet til analyse af et stort antal organoider.
Kyllingembryoner er blevet brugt til at studere vaskularisering og udvikling i over et århundrede22. De er let tilgængelige, kræver lav vedligeholdelse, mangler et fuldt funktionelt immunsystem og kan udvikle sig normalt efter åbning af æggeskallen23,24,25,26. Transplantationen af organoider på deres chorioallantoic membran (CAM) har vist sig at føre til vaskularisering27. Imidlertid er varigheden af transplantationen på CAM såvel som niveauet for modning af transplantatet begrænset af CAM-dannelse, hvilket tager indtil embryonal dag 7 at fuldføre. Derfor blev der for nylig udviklet en metode til effektivt at vaskularisere og modne nyreorganoider gennem intracelomisk transplantation i kyllingembryoner28. Det celomiske hulrum af kyllingembryoner har siden 1930'erne været kendt for at være et gunstigt miljø for differentiering af embryonale væv29,30. Det kan tilgås tidligt i embryonal udvikling og giver mulighed for relativt ubegrænset udvidelse af transplantatet i alle retninger.
Dette papir skitserer en protokol til transplantation af hiPSC-afledte nyreorganoider i det celomiske hulrum i dag 4 kyllingembryoner. Denne metode inducerer vaskularisering og forbedret modning af organoiderne inden for 8 dage. Injektion af fluorescerende mærket linse culinaris agglutinin (LCA) inden ofring af embryonerne muliggør visualisering af perfunderede blodkar i organoiderne gennem konfokal mikroskopi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>10462200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes&#160;</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>Contains silicone tubes, mouth piece and connector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHTC091-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHTC090-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope&#160;</td>
			<td>Wild Heerbrugg</td>
			<td>355110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHSB391-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-&#945;-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-212-02</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-&#945;-sheep Alexa Fluor 647</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21448</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edged stainless steel razor blades</td>
			<td>Electron Microsopy Sciences</td>
			<td>72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg cartons or custom made egg holders&#160;</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus)&#160;</td>
			<td>Drost Loosdrecht B.V.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Elbanton BV</td>
			<td>ET-3 combi</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>B-1325</td>
			<td>dilution 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHSB500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150F-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td>We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws.</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>L-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olivecrona dura dissector 18 cm&#160;</td>
			<td>Reda</td>
			<td>41146-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm&#160;</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HS234526B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated spoon&#160;</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>S-20-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 x 15 mm&#160;</td>
			<td>CELLSTAR</td>
			<td>628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipettes&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PP89SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified mouse anti-human CD31 antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555444</td>
			<td>dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>RL-1042</td>
			<td>This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-human NPHS1 antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>AF4269</td>
			<td>dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile hypodermic needles, 19 G</td>
			<td>BD microlance</td>
			<td>301500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Alexa Fluor 405</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S32351</td>
			<td>dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 5 mL</td>
			<td>BD Emerald</td>
			<td>307731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent tape&#160;</td>
			<td>Tesa</td>
			<td>4124</td>
			<td>Available at most hardware stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire, 0.25 mm dia&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>010404.H2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient vascularization of kidney organoids through intracelomic transplantation in chicken embryos

Nyreorganoider afledt af humane inducerede pluripotente stamceller indeholder nefronlignende strukturer, der til en vis grad ligner dem i den voksne nyre. Desværre hæmmes deres kliniske anvendelighed af manglen på en funktionel vaskulatur og følgelig begrænset modning in vitro. Transplantationen af nyreorganoider i det celomiske hulrum af kyllingembryoner inducerer vaskularisering ved perfunderede blodkar, herunder dannelsen af glomerulære kapillærer, og forbedrer deres modning. Denne teknik er meget effektiv, hvilket giver mulighed for transplantation og analyse af et stort antal organoider. Dette papir beskriver en detaljeret protokol for intracelomisk transplantation af nyreorganoider i kyllingembryoner efterfulgt af injektion af fluorescerende mærket lektin for at plette den perfunderede vaskulatur og indsamling af transplanterede organoider til billeddannelsesanalyse. Denne metode kan bruges til at inducere og studere organoid vaskularisering og modning for at finde spor til forbedring af disse processer in vitro og forbedre sygdomsmodellering.

Metoden og tidslinjen for differentiering af hiPSC'er til nyreorganoider, inkubation af befrugtede kyllingæg, transplantation af nyreorganoider, injektion af LCA og indsamling af organoiderne er opsummeret i figur 1A. Det er vigtigt at koordinere tidspunktet for organoid differentiering og kyllingæg inkubation, begyndende differentiering 15 dage før inkubation. Handlingerne på dag 0, 3, 4 og 12 af inkubation er illustreret med fotografier under tidslinjen. Organoider transplanteres på ...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Vascularization of Kidney Organoids through Intracelomic Transplantation in Chicken Embryos at JoVE.com

Efficient Vascularization of Kidney Organoids through Intracelomic Transplantation in Chicken Embryos

Her præsenterer vi en detaljeret protokol til transplantation af nyreorganoider i det celomiske hulrum af kyllingembryoner. Denne metode inducerer vaskularisering og forbedret modning af organoiderne inden for 8 dage og kan bruges til at studere disse processer på en effektiv måde.

Effektiv vaskularisering af nyreorganoider gennem intracelomisk transplantation i kyllingembryoner

Kidney organoids derived from human induced pluripotent stem cells contain nephron-like structures that resemble those in the adult kidney to a certain ...

Nyreorganoider dyrket in vitro forbliver umodne, hvilket begrænser deres anvendelighed. Og denne metode til intracoelomisk transplantation inducerer vaskularisering og forbedrer modningen af organoiderne. Proceduren er meget effektiv, hvilket giver mulighed for transplantation og analyse af et stort antal organoider i et eksperiment.Efter forberedelse af HIPSC-afledte nyreorganoider og inkubation af de befrugtede leghornæg skabes et vindue i æggeskallen på dag tre af inkubation. Placer et lille stykke gennemsigtigt tape på den spidse spids af ægget. Lav et lille hul i æggeskallen midt på det gennemsigtige bånd ved at banke på det med den skarpe ende af en dissekerende saks.Indsæt derefter en 19-gauge nål på en fem milliliter sprøjte i hullet i en 45 graders vinkel. Suspirer to til tre ml albumin fra ægget for at sænke embryoet inde i ægget. Skjul hullet med et andet stykke gennemsigtigt tape, og læg derefter et stort stykke gennemsigtigt tape på blyanten, der er markeret opadvendt side af ægget.Lav et hul i æggeskallen midt på det gennemsigtige bånd ved at banke på det med den skarpe ende af en par dissekerende saks. Skær et lille cirkulært vindue i æggeskallen fra dette hul ved hjælp af buet dissekerende saks. Se gennem dette vindue for at finde embryoet.Forstør derefter vinduet for at optimere adgangen til embryoet. Fjern eventuelle store stykker æggeskal, der kan være faldet oven på embryoet ved hjælp af tang. Fjern mindre stykker ved at placere et par dråber DPBS med calcium og magnesium på embryoet med en plastoverførselspipette og derefter aspirere DPBS med æggeskallen ind i pipetten.Brug en plastoverførselspipette til at tilsætte tre dråber DPBS, suppleret med 0,5% penicillin streptomycin til ægget. Luk forsigtigt vinduet med et stort stykke gennemsigtigt tape, inden ægget placeres tilbage i inkubatoren indtil dag fire af inkubation. Skær båndet fra vinduet med buet dissekerende saks.Placer ægget under et dissekerende mikroskop på en gummiholder eller æggekarton. Kyllingeembryoet er nu i Hamburger-Hamilton fase 23 til 24 og ligger på venstre side med højre side vendt mod seeren. Find embryoets højre vinge og benknop, da coelom vil blive vurderet mellem disse to lemmer.I området mellem højre vinge og benknop skal du skabe en åbning fortløbende i vitellinmembranen, korionen og amnion ved at holde dem med to par dissekerende tang og forsigtigt trække dem i modsatte retninger. Kontroller, om der er uhindret adgang til det coelomiske hulrum. Tag forsigtigt fat i kanten af kropsvæggen mellem vingen og lemknoppen med et par dissekerende tang og træk den lidt mod beskueren.Det coelomiske hulrum skal være tydeligt synligt. Indsæt forsigtigt et stump, men slankt instrument i det coelomiske hulrum. Placer en halv organoid inde i ægget oven på allantois ved hjælp af en dura dissector.Brug dissekerende tang til forsigtigt at tage fat i kanten af kropsvæggen og trække den lidt mod beskueren for at gøre åbningen til coelum synlig. Flyt forsigtigt organoiden mod og gennem åbningen i kropsvæggen ind i coelum med en stump wolframtråd og en mikroskalpelholder. Skub organoiden lidt kranielt for at sætte den ind i coelum.Det er nu synligt lige bag vingeknoppen. Tilsæt tre dråber DPBS til ægget ved hjælp af en plastikoverførselspipette. Luk forsigtigt vinduet med et stort stykke gennemsigtigt tape, inden ægget placeres tilbage i inkubatoren indtil dag 12 af inkubation.Skær båndet fra vinduet med buet dissekerende saks. Placer ægget under et dissekerende mikroskop i en gummiholder. Evaluer vaskulaturen og find venerne, som kan skelnes fra arterierne ved deres lidt lysere røde farve.For at forbedre adgangen til vaskulaturen skal du forsigtigt forstørre vinduet ved at skære det med buet dissekerende saks. Når du har valgt venen, skal du indsætte spidsen af mikrokapillærnålen i venen i en vinkel på nul til 20 grader. Sørg for, at nålen er i venen ved forsigtigt at bevæge spidsen fra side til side.Blæs forsigtigt og støt ind i injektionssystemet for at injicere linsen culinaris agglutinin. Og læg ægget tilbage i inkubatoren i 10 minutter for at lade det cirkulere. Læg ægget i en gummiholder på bænken.Skær derefter gennem membranerne, der omgiver embryoet, med buet dissekerende saks. Hæld embryoet op fra ægget med en perforeret ske og halshug straks embryoet ved hjælp af en saks. Under dissektionsmikroskopet placeres embryoets krop i en petriskål.Placer embryoet på ryggen i petriskålen og spred dets lemmer. Åbn forsigtigt embryoets abdominalvæg langs længdeaksen ved hjælp af tang. Find organoid inde i embryoet.Organoid bliver oftest fastgjort til højre leverlap, enten ved coddle tip eller kranialt lige under brystkassen. Så det er tilrådeligt at starte med at se på disse placeringer. Når organoiden er placeret, fjern den fra embryoet ved at skære rundt om den med mikrosaks.Placer organoiden i kyllingevævet, der uundgåeligt er fastgjort til det i en petriskål under dissekeringsmikroskopet. Fjern så meget kyllingevæv som muligt med et dobbeltkantet barberblad i rustfrit stål. Immunofluorescerende billeder af en ikke-transplanteret nyreorganoid og en transplanteret nyreorganoid indeholder begge glomerulære og rørformede strukturer.I de utransplanterede organoider er nogle humane endotelceller til stede. I den transplanterede organoid er et perfuseret vaskulært netværk synligt i hele organoiden. Forstørrede billeder af de indrammede områder demonstrerer de tre typer endotelceller, der kan skelnes i transplanterede organoider: perfunderede humane endotelceller, uperfusede humane endotelceller og perfuserede kyllingafledte endotelceller.I utransplanterede organoider omgiver endotelceller glomerulære strukturer, men invaderer dem ikke. I transplanterede organoider vaskes glomerulære strukturer imidlertid af perfunderede kapillærer. Transplanterede organoider kan analyseres ved hjælp af forskellige teknikker afhængigt af eksperimentets mål.Direkte sammenligning med utransplanterede kontroller kan give indsigt i processen med vaskularisering og modning.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dobbelt mærkning af neurale crest celler og blodkar i kyllingembryoner ved hjælp af ChickGFP Neural Tube Poding og Carbocyanine Dye DiI Injection

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Hele Retinale Eksplantater fra kylling Embryoner til Elektroporation og kemisk reagens Behandlinger

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Teknik Target Mikroinjektion til udviklingslandene<em&gt; Xenopus</em&gt; Nyre

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

En effektiv metode til at opnå dedifferentierede fedtceller

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

I Ovo Electroporation i Kylling Auditory Brainstem

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Sporing genekspression gennem påvisning af β-galactosidase aktivitet i hele musen embryoner

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal plade i Gastrulating mus embryoner ved hjælp af Scanning elektronmikroskopi og hele Mount immunfluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Hurtig og effektiv ekspression af flere proteiner i aviær embryoner ved hjælp af mRNA-elektroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

En forenklet metode til generering af nyreorganoider fra humane pluripotente stamceller

Kidney organoids generated from hPSCs have provided an unlimited source of renal tissue. Human kidney organoids are an invaluable tool for studying kidney ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

En enkel og effektiv transplantationsenhed til zebrafiskembryoner

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...