Name: efficient vascularization of kidney organoids through intracelomic transplantation in chicken embryos
Uploaded: 2023-02-17T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Vascularization of Kidney Organoids through Intracelomic Transplantation in Chicken Embryos at JoVE.com

Wir danken George Galaris (LUMC, Leiden, Niederlande) für seine Hilfe bei der Injektion von Hühnerembryonen. Wir bedanken uns für die Unterstützung von Saskia van der Wal-Maas (Institut für Anatomie und Embryologie, LUMC, Leiden, Niederlande), Conny van Munsteren (Institut für Anatomie und Embryologie, LUMC, Leiden, Niederlande), Manon Zuurmond (LUMC, Leiden, Niederlande) und Annemarie de Graaf (LUMC, Leiden, Niederlande). M. Koning wird unterstützt von "Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC". Diese Arbeit wurde zum Teil durch den Fonds der Universität Leiden "Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fund" GWF2019-02 unterstützt. Diese Arbeit wird von den Partnern Regenerative Medicine Crossing Borders (RegMedXB) und Health Holland, Top Sector Life Sciences &; Health unterstützt. C.W. van den Berg und T.J. Rabelink werden vom Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW) unterstützt, das Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine wird durch Zuschüsse der Novo Nordisk Foundation unterstützt (NNF21CC0073729).

Nach niederländischem Recht war für diese Forschung keine Genehmigung durch den Tierschutzausschuss erforderlich.
1. Vorbereitung von hiPSC-abgeleiteten Nierenorganoiden für die Transplantation
<ol><li>Unterscheidung von hiPS-Zellen zu Nierenorganoiden unter Verwendung des von Takasato et al.4,18,31 entwickelten Protokolls. Kultivieren Sie die Organoide nach diesem Protokoll auf ...

<ol>
	<li>Taguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+in+vivo+origin+of+metanephric+nephron+progenitors+enables+generation+of+complex+kidney+structures+from+pluripotent+stem+cells.">Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).</li><li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury.">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li><li>Kim, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-edited+human+kidney+organoids+reveal+mechanisms+of+disease+in+podocyte+development.">Gene-edited human kidney organoids reveal mechanisms of disease in podocyte development.</a> Stem Cells. 35 (12), 2366-2378 (2017).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Hale, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+organoid-derived+human+glomeruli+for+personalised+podocyte+disease+modelling+and+drug+screening.">3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening.</a> Nature Communications. 9 (1), 5167 (2018).</li><li>Vanslambrouck, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+metanephric+specification+to+functional+proximal+tubule+enables+toxicity+screening+and+infectious+disease+modelling+in+kidney+organoids.">Enhanced metanephric specification to functional proximal tubule enables toxicity screening and infectious disease modelling in kidney organoids.</a> Nature Communications. 13 (1), 5943 (2022).</li><li>Tanigawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+from+nephrotic+disease-derived+iPSCs+identify+impaired+NEPHRIN+localization+and+slit+diaphragm+formation+in+kidney+podocytes.">Organoids from nephrotic disease-derived iPSCs identify impaired NEPHRIN localization and slit diaphragm formation in kidney podocytes.</a> Stem Cell Reports. 11 (3), 727-740 (2018).</li><li>Forbes, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-iPSC-derived+kidney+organoids+show+functional+validation+of+a+ciliopathic+renal+phenotype+and+reveal+underlying+pathogenetic+mechanisms.">Patient-iPSC-derived kidney organoids show functional validation of a ciliopathic renal phenotype and reveal underlying pathogenetic mechanisms.</a> American Journal of Human Genetics. 102 (5), 816-831 (2018).</li><li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids.">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communications. 6, 8715 (2015).</li><li>Cruz, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cystogenesis+reveals+a+critical+role+of+microenvironment+in+human+polycystic+kidney+disease.">Organoid cystogenesis reveals a critical role of microenvironment in human polycystic kidney disease.</a> Nature Materials. 16 (11), 1112-1119 (2017).</li><li>Gupta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+injury+and+repair+in+kidney+organoids+reveals+that+homologous+recombination+governs+tubular+intrinsic+repair.">Modeling injury and repair in kidney organoids reveals that homologous recombination governs tubular intrinsic repair.</a> Science Translational Medicine. 14 (634), eabj4772 (2022).</li><li>Hiratsuka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid-on-a-chip+model+of+human+ARPKD+reveals+mechanosensing+pathomechanisms+for+drug+discovery.">Organoid-on-a-chip model of human ARPKD reveals mechanosensing pathomechanisms for drug discovery.</a> Scencei Advances. 8 (38), eabq0866 (2022).</li><li>Dorison, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+generated+using+an+allelic+series+of+NPHS2+point+variants+reveal+distinct+intracellular+podocin+mistrafficking.">Kidney organoids generated using an allelic series of NPHS2 point variants reveal distinct intracellular podocin mistrafficking.</a> Journal of the American Society of Nephrology. , (2022).</li><li>Eremina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular-specific+alterations+of+VEGF-A+expression+lead+to+distinct+congenital+and+acquired+renal+diseases.">Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases.</a> The Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).</li><li>Kitamoto, Y., Tokunaga, H., Tomita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+is+an+essential+molecule+for+mouse+kidney+development:+glomerulogenesis+and+nephrogenesis.">Vascular endothelial growth factor is an essential molecule for mouse kidney development: glomerulogenesis and nephrogenesis.</a> The Journal of Clinical Investigation. 99 (10), 2351-2357 (1997).</li><li>Sison, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+structure+and+function+require+paracrine,+not+autocrine,+VEGF-VEGFR-2+signaling.">Glomerular structure and function require paracrine, not autocrine, VEGF-VEGFR-2 signaling.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 21 (10), 1691-1701 (2010).</li><li>Ryan, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+deficiencies+in+renal+organoids+and+ex+vivo+kidney+organogenesis.">Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis.</a> Developmental Biology. 477, 98-116 (2021).</li><li>vanden Berg, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+subcapsular+transplantation+of+PSC-derived+kidney+organoids+induces+neo-vasculogenesis+and+significant+glomerular+and+tubular+maturation+in+vivo.">Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).</li><li>Sharmin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+podocytes+mature+into+vascularized+glomeruli+upon+experimental+transplantation.">Human induced pluripotent stem cell-derived podocytes mature into vascularized glomeruli upon experimental transplantation.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1778-1791 (2016).</li><li>Bantounas, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functioning+nephrons+by+implanting+human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+progenitors.">Generation of functioning nephrons by implanting human pluripotent stem cell-derived kidney progenitors.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 766-779 (2018).</li><li>vanden Berg, C. W., Koudijs, A., Ritsma, L., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+assessment+of+size-selective+glomerular+sieving+in+transplanted+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+organoids.">In vivo assessment of size-selective glomerular sieving in transplanted human induced pluripotent stem cell-derived kidney organoids.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 31 (5), 921-929 (2020).</li><li>Asai, R., Bressan, M., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avians+as+a+model+system+of+vascular+development.">Avians as a model system of vascular development.</a> Methods in Molecular Biology. 2206, 103-127 (2021).</li><li>Jankovic, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+capacity+of+the+chicken+embryo.+I.+Relationship+between+the+maturation+of+lymphoid+tissues+and+the+occurrence+of+cell-mediated+immunity+in+the+developing+chicken+embryo.">Immunological capacity of the chicken embryo. I. Relationship between the maturation of lymphoid tissues and the occurrence of cell-mediated immunity in the developing chicken embryo.</a> Immunology. 29 (3), 497-508 (1975).</li><li>Alkie, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+innate+immunity+in+chicken+embryos+and+newly+hatched+chicks:+a+disease+control+perspective.">Development of innate immunity in chicken embryos and newly hatched chicks: a disease control perspective.</a> Avian Pathology. 48 (4), 288-310 (2019).</li><li>Rawles, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+normal+embryonic+tissues.">Transplantation of normal embryonic tissues.</a> Annalls of the New York Academy of Sciences. 55 (2), 302-312 (1952).</li><li>Rawles, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+melanophores+from+embryonic+mouse+tissues+grown+in+the+coelom+of+chick+embryos.">The development of melanophores from embryonic mouse tissues grown in the coelom of chick embryos.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 26 (12), 673-680 (1940).</li><li>Garreta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+tuning+the+extracellular+environment+accelerates+the+derivation+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Materials. 18 (4), 397-405 (2019).</li><li>Koning, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculogenesis+in+kidney+organoids+upon+transplantation.">Vasculogenesis in kidney organoids upon transplantation.</a> NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 40 (2022).</li><li>Hamburger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenetic+and+axial+self-differentiation+of+transplanted+limb+primordia+of+2-day+chick+embryos.">Morphogenetic and axial self-differentiation of transplanted limb primordia of 2-day chick embryos.</a> Journal of Experimental Zoology. 77 (3), 379-399 (1938).</li><li>Dossel, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+of+intracelomic+grafting.">New method of intracelomic grafting.</a> Science. 120 (3111), 262-263 (1954).</li><li>Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).</li><li>Aleksandrowicz, E., Herr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethical+euthanasia+and+short-term+anesthesia+of+the+chick+embryo.">Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo.</a> ALTEX. 32 (2), 143-147 (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACUC.">ACUC.</a> Guideline: The Use and Euthanasia Procedures of Chicken/Avian Embryos. , (2012).</li></ol>

In diesem Manuskript wird ein Protokoll für die intracelome Transplantation von hiPSC-abgeleiteten Nierenorganoiden in Hühnerembryonen demonstriert. Nach der Transplantation werden Organoide durch perfundierte Blutgefäße vaskularisiert, die aus einer Kombination von aus menschlichen Organoiden und Hühnern bestehen. Diese verteilen sich über das Organoid und dringen in die glomerulären Strukturen ein, was eine Wechselwirkung zwischen den ECs und Podozyten ermöglicht. Es konnte bereits gezeigt werden, dass dies zu ...

Es hat sich gezeigt, dass aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) gewonnenen Nierenorganoiden Potenzial für Entwicklungsstudien 1,2,3,4, Toxizitätsscreening 5,6 und Krankheitsmodellierung5,7,8,9,10,11,12,13 haben. Ihre Anwendbarkeit für diese und spätere klinische Transplantationszwecke ist jedoch durch das Fehlen eines vaskulären Netzwerks eingeschränkt. Während der embryonalen Nierenentwicklung interagieren Podozyten, Mesangialzellen und vaskuläre Endothelzellen (ECs), um die komplizierte Struktur des Glomerulus zu bilden. Ohne diese Wechselwirkung kann sich die glomeruläre Filtrationsbarriere, bestehend aus Podozyten, der glomerulären Basalmembran (GBM) und ECs, nicht richtig entwickeln14,15,16. Obwohl Nierenorganoide in vitro einige ECs enthalten, bilden diese kein richtiges Gefäßnetzwerk und nehmen mit der Zeit ab17. Es ist daher nicht verwunderlich, dass die Organoide unreif bleiben. Die Transplantation in Mäusen induziert eine Vaskularisierung und Reifung der Nierenorganoide 18,19,20,21. Leider ist dies ein arbeitsintensiver Prozess, der für die Analyse einer großen Anzahl von Organoiden ungeeignet ist.
Hühnerembryonen werden seit über einem Jahrhundert verwendet, um die Vaskularisierung und Entwicklung zu untersuchen22. Sie sind leicht zugänglich, wartungsarm, verfügen nicht über ein voll funktionsfähiges Immunsystem und können sich nach dem Öffnen der Eierschale normal entwickeln23,24,25,26. Es konnte gezeigt werden, dass die Transplantation von Organoiden auf deren chorioallantoische Membran (CAM) zu einer Vaskularisation führt27. Die Dauer der Transplantation auf dem CAM sowie der Reifegrad des Transplantats sind jedoch durch die CAM-Bildung begrenzt, die bis zum 7. Embryonaltag dauert. Daher wurde kürzlich eine Methode entwickelt, um Nierenorganoide durch intracelome Transplantation in Hühnerembryonen effizient zu vaskularisieren und reifenzu lassen 28. Seit den 1930er Jahren ist bekannt, dass die Zölomhöhle von Hühnerembryonen eine günstige Umgebung für die Differenzierung von embryonalem Gewebedarstellt 29,30. Es ist früh in der Embryonalentwicklung zugänglich und ermöglicht eine relativ unbegrenzte Ausdehnung des Transplantats in alle Richtungen.
In dieser Arbeit wird ein Protokoll für die Transplantation von hiPSC-abgeleiteten Nierenorganoiden in die Zölomhöhle von Tag-4-Hühnerembryonen beschrieben. Diese Methode induziert eine Vaskularisierung und eine verbesserte Reifung der Organoide innerhalb von 8 Tagen. Die Injektion von fluoreszenzmarkiertem Lens culinaris Agglutinin (LCA) vor der Opferung der Embryonen ermöglicht die Visualisierung von perfundierten Blutgefäßen in den Organoiden durch konfokale Mikroskopie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>10462200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes&#160;</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>Contains silicone tubes, mouth piece and connector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHTC091-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHTC090-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope&#160;</td>
			<td>Wild Heerbrugg</td>
			<td>355110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHSB391-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-&#945;-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-212-02</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-&#945;-sheep Alexa Fluor 647</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21448</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edged stainless steel razor blades</td>
			<td>Electron Microsopy Sciences</td>
			<td>72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg cartons or custom made egg holders&#160;</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus)&#160;</td>
			<td>Drost Loosdrecht B.V.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Elbanton BV</td>
			<td>ET-3 combi</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>B-1325</td>
			<td>dilution 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHSB500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150F-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td>We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws.</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>L-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olivecrona dura dissector 18 cm&#160;</td>
			<td>Reda</td>
			<td>41146-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm&#160;</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HS234526B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated spoon&#160;</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>S-20-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 x 15 mm&#160;</td>
			<td>CELLSTAR</td>
			<td>628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipettes&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PP89SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified mouse anti-human CD31 antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555444</td>
			<td>dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>RL-1042</td>
			<td>This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-human NPHS1 antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>AF4269</td>
			<td>dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile hypodermic needles, 19 G</td>
			<td>BD microlance</td>
			<td>301500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Alexa Fluor 405</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S32351</td>
			<td>dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 5 mL</td>
			<td>BD Emerald</td>
			<td>307731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent tape&#160;</td>
			<td>Tesa</td>
			<td>4124</td>
			<td>Available at most hardware stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire, 0.25 mm dia&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>010404.H2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient vascularization of kidney organoids through intracelomic transplantation in chicken embryos

Nierenorganoide, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen werden, enthalten nephronähnliche Strukturen, die denen in der erwachsenen Niere bis zu einem gewissen Grad ähneln. Leider wird ihre klinische Anwendbarkeit durch das Fehlen eines funktionellen Gefäßsystems und die daraus resultierende eingeschränkte Reifung in vitro erschwert. Die Transplantation von Nierenorganoiden in die Zölomhöhle von Hühnerembryonen induziert die Vaskularisierung durch perfundierte Blutgefäße, einschließlich der Bildung glomerulärer Kapillaren, und fördert deren Reifung. Diese Technik ist sehr effizient und ermöglicht die Transplantation und Analyse einer großen Anzahl von Organoiden. Diese Arbeit beschreibt ein detailliertes Protokoll für die intracelome Transplantation von Nierenorganoiden in Hühnerembryonen, gefolgt von der Injektion von fluoreszenzmarkiertem Lektin zur Färbung des perfundierten Gefäßsystems und der Entnahme von transplantierten Organoiden für die bildgebende Analyse. Diese Methode kann verwendet werden, um die Organoid-Vaskularisierung und -Reifung zu induzieren und zu untersuchen, um Hinweise zur Verbesserung dieser Prozesse in vitro zu finden und die Krankheitsmodellierung zu verbessern.

Die Methode und der Zeitplan für die Differenzierung von hiPS-Zellen zu Nierenorganoiden, die Inkubation von befruchteten Hühnereiern, die Transplantation von Nierenorganoiden, die Injektion von LCA und die Entnahme der Organoide sind in Abbildung 1A zusammengefasst. Es ist wichtig, den Zeitpunkt der Organoid-Differenzierung und der Hühnerei-Inkubation zu koordinieren und mit der Differenzierung 15 Tage vor der Inkubation zu beginnen. Die Aktionen an Tag 0, 3, 4 und 12 der Inkubation wer...

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Efficient Vascularization of Kidney Organoids through Intracelomic Transplantation in Chicken Embryos

In dieser Arbeit stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Transplantation von Nierenorganoiden in die Zölomhöhle von Hühnerembryonen vor. Diese Methode induziert eine Vaskularisierung und eine verbesserte Reifung der Organoide innerhalb von 8 Tagen und kann verwendet werden, um diese Prozesse auf effiziente Weise zu untersuchen.

Effiziente Vaskularisierung von Nierenorganoiden durch intracelome Transplantation in Hühnerembryonen

Kidney organoids derived from human induced pluripotent stem cells contain nephron-like structures that resemble those in the adult kidney to a certain ...

In vitro kultivierte Nierenorganoide bleiben unausgereift, was ihre Anwendbarkeit einschränkt. Und diese Methode der intrazölomischen Transplantation induziert eine Vaskularisierung und fördert die Reifung der Organoide. Das Verfahren ist sehr effizient und ermöglicht die Transplantation und Analyse einer großen Anzahl von Organoiden in einem Experiment.Nach der Herstellung von HIPSC-abgeleiteten Nierenorganoiden und der Inkubation bilden die befruchteten Leghorn-Eier am dritten Tag der Inkubation ein Fenster in der Eierschale. Legen Sie ein kleines Stück transparentes Klebeband auf die spitze Spitze des Eies. Machen Sie ein kleines Loch in die Eierschale in der Mitte des transparenten Klebebandes, indem Sie mit dem scharfen Ende einer Sezierschere darauf klopfen.Führen Sie als Nächstes eine 19-Gauge-Nadel an einer Fünf-Milliliter-Spritze in einem 45-Grad-Winkel in das Loch ein. Saugen Sie zwei bis drei Milliliter Albumin aus der Eizelle ab, um den Embryo in die Eizelle zu senken. Decken Sie das Loch mit einem zweiten Stück transparentem Klebeband ab und legen Sie dann ein großes Stück transparentes Klebeband auf den Bleistift, der mit der nach oben zeigenden Seite des Eies markiert ist.Machen Sie ein Loch in die Eierschale in der Mitte des transparenten Klebebandes, indem Sie mit dem scharfen Ende einer Sezierschere darauf klopfen. Schneiden Sie aus diesem Loch mit einer gebogenen Präparierschere ein kleines rundes Fenster in die Eierschale. Schauen Sie durch dieses Fenster, um den Embryo zu finden.Vergrößern Sie dann das Fenster, um den Zugang zum Embryo zu optimieren. Entfernen Sie alle großen Stücke der Eierschale, die möglicherweise auf den Embryo gefallen sind, mit einer Pinzette. Entfernen Sie kleinere Stücke, indem Sie einige Tropfen DPBS mit Kalzium und Magnesium mit einer Plastiktransferpipette auf den Embryo geben und dann das DPBS mit der Eierschale in die Pipette aspirieren.Geben Sie mit einer Transferpipette aus Kunststoff drei Tropfen DPBS, ergänzt mit 0,5 % Penicillin-Streptomycin, in die Eizelle. Verschließe das Fenster vorsichtig mit einem großen Stück transparentem Klebeband, bevor du das Ei bis zum vierten Tag der Inkubation wieder in den Inkubator legst. Schneiden Sie das Klebeband mit einer gebogenen Präparierschere vom Fenster ab.Legen Sie das Ei unter ein Seziermikroskop auf einen Gummihalter oder Eierkarton. Der Hühnerembryo befindet sich nun in den Hamburger-Hamilton-Stadien 23 bis 24 und liegt auf der linken Seite, wobei die rechte Seite dem Betrachter zugewandt ist. Lokalisieren Sie den rechten Flügel und die Beinknospe des Embryos, da das Zölom zwischen diesen beiden Gliedmaßenknospen beurteilt wird.Schaffen Sie im Bereich zwischen rechtem Flügel und Beinknospe nacheinander eine Öffnung in der Vitellinmembran, dem Chorion und dem Amnion, indem Sie sie mit zwei Paaren Präparierzangen halten und vorsichtig in entgegengesetzte Richtungen ziehen. Prüfen Sie, ob ein ungehinderter Zugang zur Zölomhöhle besteht. Fassen Sie den Rand der Körperwand zwischen Flügel und Gliedmaßenknospe vorsichtig mit einer Präparierzange und ziehen Sie sie leicht in Richtung des Betrachters.Die Zölomhöhle muss gut sichtbar sein. Führen Sie vorsichtig ein stumpfes, aber schlankes Instrument in die Zölomhöhle ein. Legen Sie ein halbes Organoid in das Ei auf die Allantois mit einem Dura-Dissektor.Fassen Sie mit einer Präparierzange vorsichtig den Rand der Körperwand und ziehen Sie ihn leicht in Richtung des Betrachters, um die Öffnung zum Coelum sichtbar zu machen. Bewegen Sie das Organoid vorsichtig mit einem stumpfen Wolframdraht und einem Mikroskalpellhalter in Richtung und durch die Öffnung in der Körperwand in das Coelum. Drücken Sie das Organoid leicht nach kranial, um es im Coelum zu platzieren.Es ist jetzt direkt hinter der Flügelknospe sichtbar. Geben Sie drei Tropfen DPBS mit einer Transferpipette aus Kunststoff in das Ei. Verschließen Sie das Fenster vorsichtig mit einem großen Stück transparentem Klebeband, bevor Sie das Ei bis zum 12. Tag der Inkubation wieder in den Inkubator legen.Schneiden Sie das Klebeband mit einer gebogenen Präparierschere vom Fenster ab. Legen Sie das Ei unter ein Seziermikroskop in einen Gummihalter. Beurteilen Sie die Gefäße und lokalisieren Sie die Venen, die sich durch ihre etwas hellere rote Farbe von den Arterien unterscheiden lassen.Um den Zugang zum Gefäßsystem zu verbessern, vergrößern Sie das Fenster vorsichtig, indem Sie es mit einer gebogenen Präparierschere schneiden. Nachdem Sie die Vene ausgewählt haben, führen Sie die Spitze der Mikrokapillarnadel in einem Winkel von null bis 20 Grad in die Vene ein. Stellen Sie sicher, dass sich die Nadel in der Vene befindet, indem Sie die Spitze vorsichtig von einer Seite zur anderen bewegen.Blasen Sie vorsichtig und gleichmäßig in das Injektionssystem, um das Agglutinin der Linse culinaris zu injizieren. Und legen Sie das Ei für 10 Minuten wieder in den Inkubator, damit es zirkulieren kann. Legen Sie das Ei in einen Gummihalter auf die Bank.Schneiden Sie dann die Membranen, die den Embryo umgeben, mit einer gebogenen Präparierschere durch. Schöpfen Sie den Embryo mit einem perforierten Löffel aus dem Ei und enthaupten Sie den Embryo sofort mit einer Schere. Legen Sie den Körper des Embryos unter das Seziermikroskop in eine Petrischale.Legen Sie den Embryo auf den Rücken in die Petrischale und spreizen Sie seine Gliedmaßen. Öffnen Sie die Bauchdecke des Embryos vorsichtig mit einer Pinzette entlang der Längsachse. Lokalisieren Sie das Organoid im Inneren des Embryos.Das Organoid heftet sich am häufigsten an den rechten Leberlappen, entweder an der Coddle-Spitze oder kranial, direkt unter dem Brustkorb. Es ist also ratsam, sich zunächst diese Standorte anzusehen. Sobald das Organoid lokalisiert ist, entfernen Sie es aus dem Embryo, indem Sie es mit einer Mikroschere umschneiden.Legen Sie das Organoid in das unweigerlich daran haftende Hühnergewebe in einer Petrischale unter das Präpariermikroskop. Entfernen Sie so viel Hühnergewebe wie möglich mit einer zweischneidigen Rasierklinge aus Edelstahl. Immunfluoreszenzbilder eines nicht transplantierten Nierenorganoids und eines transplantierten Nierenorganoids enthalten beide glomeruläre und tubuläre Strukturen.In den nicht transplantierten Organoiden sind einige menschliche Endothelzellen vorhanden. Im transplantierten Organoid ist ein perfundiertes Gefäßnetz im gesamten Organoid sichtbar. Vergrößerte Bilder der eingerahmten Bereiche zeigen die drei Arten von Endothelzellen, die in transplantierten Organoiden unterschieden werden können: perfundierte menschliche Endothelzellen, nicht durchblutete menschliche Endothelzellen und perfundierte Endothelzellen aus Hühnern.In nicht transplantierten Organoiden umgeben Endothelzellen glomeruläre Strukturen, dringen aber nicht in diese ein. In transplantierten Organoiden werden glomeruläre Strukturen jedoch durch perfundierte Kapillaren vaskularisiert. Transplantierte Organoide können je nach Ziel des Experiments mit unterschiedlichen Techniken analysiert werden.Der direkte Vergleich mit nicht transplantierten Kontrollen kann Aufschluss über den Prozess der Vaskularisierung und Reifung geben.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual-Kennzeichnung von neuralen Kammzellen und Blutgefäßen innerhalb von Hühnerembryonen mit ChickGFP Neural Tube Grafting und Carbocyanin Dye DiI Injektion

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Whole Retinal Explantaten aus Hühnerembryonen für die Elektroporation und Reagens-Behandlungen

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technik auf Zielmikroinjektions an die Entwicklungs<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

Eine effiziente Methode erhalten Sie Dedifferenzierte Fettzellen

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation im Hühnchen auditorischen Hirnstamm

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Genexpression durch Nachweis der Aktivität der β-Galaktosidase in ganze Mausembryonen

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisierung der Knoten und Notochordal Platte In Gastrulating Maus-Embryonen mittels Rasterelektronenmikroskopie und ganze Mount Immunfluoreszenz

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Schnelle und effiziente Expression mehrerer Proteine in Aviären Embryonen mit mRNA-Elektroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

Eine vereinfachte Methode zur Erzeugung von Nierenorganoiden aus humanen pluripotenten Stammzellen

Kidney organoids generated from hPSCs have provided an unlimited source of renal tissue. Human kidney organoids are an invaluable tool for studying kidney ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Ein einfaches und effektives Transplantationsgerät für Zebrafischembryonen

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...