Name: efficient vascularization of kidney organoids through intracelomic transplantation in chicken embryos
Uploaded: 2023-02-17T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Vascularization of Kidney Organoids through Intracelomic Transplantation in Chicken Embryos at JoVE.com

Ringraziamo George Galaris (LUMC, Leiden, Paesi Bassi) per il suo aiuto con l'iniezione di embrioni di pollo. Riconosciamo il sostegno di Saskia van der Wal-Maas (Dipartimento di Anatomia ed Embriologia, LUMC, Leida, Paesi Bassi), Conny van Munsteren (Dipartimento di Anatomia ed Embriologia, LUMC, Leida, Paesi Bassi), Manon Zuurmond (LUMC, Leida, Paesi Bassi) e Annemarie de Graaf (LUMC, Leida, Paesi Bassi). M. Koning è sostenuto da «Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC». Questo lavoro è stato in parte sostenuto dal Fondo dell'Università di Leida "Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fund" GWF2019-02. Questo lavoro è supportato dai partner di Regenerative Medicine Crossing Borders (RegMedXB) e Health Holland, Top Sector Life Sciences & Health. C.W. van den Berg e T.J. Rabelink sono supportati da The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine è supportato da sovvenzioni della Novo Nordisk Foundation (NNF21CC0073729).

In conformità con la legge olandese, l'approvazione da parte del comitato per il benessere degli animali non era richiesta per questa ricerca.
1. Preparazione di organoidi renali derivati da hiPSC per il trapianto
<ol><li>Differenziare le hiPSCs dagli organoidi renali usando il protocollo sviluppato da Takasato et al.4,18,31. Coltura degli organoidi seguendo questo protocollo su in...

<ol>
	<li>Taguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+in+vivo+origin+of+metanephric+nephron+progenitors+enables+generation+of+complex+kidney+structures+from+pluripotent+stem+cells.">Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).</li><li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury.">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li><li>Kim, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-edited+human+kidney+organoids+reveal+mechanisms+of+disease+in+podocyte+development.">Gene-edited human kidney organoids reveal mechanisms of disease in podocyte development.</a> Stem Cells. 35 (12), 2366-2378 (2017).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Hale, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+organoid-derived+human+glomeruli+for+personalised+podocyte+disease+modelling+and+drug+screening.">3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening.</a> Nature Communications. 9 (1), 5167 (2018).</li><li>Vanslambrouck, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+metanephric+specification+to+functional+proximal+tubule+enables+toxicity+screening+and+infectious+disease+modelling+in+kidney+organoids.">Enhanced metanephric specification to functional proximal tubule enables toxicity screening and infectious disease modelling in kidney organoids.</a> Nature Communications. 13 (1), 5943 (2022).</li><li>Tanigawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+from+nephrotic+disease-derived+iPSCs+identify+impaired+NEPHRIN+localization+and+slit+diaphragm+formation+in+kidney+podocytes.">Organoids from nephrotic disease-derived iPSCs identify impaired NEPHRIN localization and slit diaphragm formation in kidney podocytes.</a> Stem Cell Reports. 11 (3), 727-740 (2018).</li><li>Forbes, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-iPSC-derived+kidney+organoids+show+functional+validation+of+a+ciliopathic+renal+phenotype+and+reveal+underlying+pathogenetic+mechanisms.">Patient-iPSC-derived kidney organoids show functional validation of a ciliopathic renal phenotype and reveal underlying pathogenetic mechanisms.</a> American Journal of Human Genetics. 102 (5), 816-831 (2018).</li><li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids.">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communications. 6, 8715 (2015).</li><li>Cruz, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cystogenesis+reveals+a+critical+role+of+microenvironment+in+human+polycystic+kidney+disease.">Organoid cystogenesis reveals a critical role of microenvironment in human polycystic kidney disease.</a> Nature Materials. 16 (11), 1112-1119 (2017).</li><li>Gupta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+injury+and+repair+in+kidney+organoids+reveals+that+homologous+recombination+governs+tubular+intrinsic+repair.">Modeling injury and repair in kidney organoids reveals that homologous recombination governs tubular intrinsic repair.</a> Science Translational Medicine. 14 (634), eabj4772 (2022).</li><li>Hiratsuka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid-on-a-chip+model+of+human+ARPKD+reveals+mechanosensing+pathomechanisms+for+drug+discovery.">Organoid-on-a-chip model of human ARPKD reveals mechanosensing pathomechanisms for drug discovery.</a> Scencei Advances. 8 (38), eabq0866 (2022).</li><li>Dorison, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+generated+using+an+allelic+series+of+NPHS2+point+variants+reveal+distinct+intracellular+podocin+mistrafficking.">Kidney organoids generated using an allelic series of NPHS2 point variants reveal distinct intracellular podocin mistrafficking.</a> Journal of the American Society of Nephrology. , (2022).</li><li>Eremina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular-specific+alterations+of+VEGF-A+expression+lead+to+distinct+congenital+and+acquired+renal+diseases.">Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases.</a> The Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).</li><li>Kitamoto, Y., Tokunaga, H., Tomita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+is+an+essential+molecule+for+mouse+kidney+development:+glomerulogenesis+and+nephrogenesis.">Vascular endothelial growth factor is an essential molecule for mouse kidney development: glomerulogenesis and nephrogenesis.</a> The Journal of Clinical Investigation. 99 (10), 2351-2357 (1997).</li><li>Sison, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+structure+and+function+require+paracrine,+not+autocrine,+VEGF-VEGFR-2+signaling.">Glomerular structure and function require paracrine, not autocrine, VEGF-VEGFR-2 signaling.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 21 (10), 1691-1701 (2010).</li><li>Ryan, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+deficiencies+in+renal+organoids+and+ex+vivo+kidney+organogenesis.">Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis.</a> Developmental Biology. 477, 98-116 (2021).</li><li>vanden Berg, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+subcapsular+transplantation+of+PSC-derived+kidney+organoids+induces+neo-vasculogenesis+and+significant+glomerular+and+tubular+maturation+in+vivo.">Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).</li><li>Sharmin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+podocytes+mature+into+vascularized+glomeruli+upon+experimental+transplantation.">Human induced pluripotent stem cell-derived podocytes mature into vascularized glomeruli upon experimental transplantation.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1778-1791 (2016).</li><li>Bantounas, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functioning+nephrons+by+implanting+human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+progenitors.">Generation of functioning nephrons by implanting human pluripotent stem cell-derived kidney progenitors.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 766-779 (2018).</li><li>vanden Berg, C. W., Koudijs, A., Ritsma, L., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+assessment+of+size-selective+glomerular+sieving+in+transplanted+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+organoids.">In vivo assessment of size-selective glomerular sieving in transplanted human induced pluripotent stem cell-derived kidney organoids.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 31 (5), 921-929 (2020).</li><li>Asai, R., Bressan, M., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avians+as+a+model+system+of+vascular+development.">Avians as a model system of vascular development.</a> Methods in Molecular Biology. 2206, 103-127 (2021).</li><li>Jankovic, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+capacity+of+the+chicken+embryo.+I.+Relationship+between+the+maturation+of+lymphoid+tissues+and+the+occurrence+of+cell-mediated+immunity+in+the+developing+chicken+embryo.">Immunological capacity of the chicken embryo. I. Relationship between the maturation of lymphoid tissues and the occurrence of cell-mediated immunity in the developing chicken embryo.</a> Immunology. 29 (3), 497-508 (1975).</li><li>Alkie, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+innate+immunity+in+chicken+embryos+and+newly+hatched+chicks:+a+disease+control+perspective.">Development of innate immunity in chicken embryos and newly hatched chicks: a disease control perspective.</a> Avian Pathology. 48 (4), 288-310 (2019).</li><li>Rawles, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+normal+embryonic+tissues.">Transplantation of normal embryonic tissues.</a> Annalls of the New York Academy of Sciences. 55 (2), 302-312 (1952).</li><li>Rawles, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+melanophores+from+embryonic+mouse+tissues+grown+in+the+coelom+of+chick+embryos.">The development of melanophores from embryonic mouse tissues grown in the coelom of chick embryos.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 26 (12), 673-680 (1940).</li><li>Garreta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+tuning+the+extracellular+environment+accelerates+the+derivation+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Materials. 18 (4), 397-405 (2019).</li><li>Koning, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculogenesis+in+kidney+organoids+upon+transplantation.">Vasculogenesis in kidney organoids upon transplantation.</a> NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 40 (2022).</li><li>Hamburger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenetic+and+axial+self-differentiation+of+transplanted+limb+primordia+of+2-day+chick+embryos.">Morphogenetic and axial self-differentiation of transplanted limb primordia of 2-day chick embryos.</a> Journal of Experimental Zoology. 77 (3), 379-399 (1938).</li><li>Dossel, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+of+intracelomic+grafting.">New method of intracelomic grafting.</a> Science. 120 (3111), 262-263 (1954).</li><li>Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).</li><li>Aleksandrowicz, E., Herr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethical+euthanasia+and+short-term+anesthesia+of+the+chick+embryo.">Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo.</a> ALTEX. 32 (2), 143-147 (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACUC.">ACUC.</a> Guideline: The Use and Euthanasia Procedures of Chicken/Avian Embryos. , (2012).</li></ol>

In questo manoscritto viene dimostrato un protocollo per il trapianto tracciatomico di organoidi renali derivati da hiPSC in embrioni di pollo. Dopo il trapianto, gli organoidi vengono vascolarizzati da vasi sanguigni perfusi che consistono in una combinazione di EC derivate da organoidi umani e derivate dal pollo. Questi si diffondono in tutto l'organoide e invadono le strutture glomerulari, consentendo l'interazione tra EC e podociti. In precedenza è stato dimostrato che ciò porta a una maggiore maturazione delle str...

Gli organoidi renali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) hanno dimostrato di avere un potenziale per studi sullo sviluppo 1,2,3,4, screening di tossicità 5,6 e modelli di malattia5,7,8,9,10,11,12,13. Tuttavia, la loro applicabilità per questi e per eventuali scopi clinici di trapianto è limitata dalla mancanza di una rete vascolare. Durante lo sviluppo del rene embrionale, i podociti, le cellule mesangiali e le cellule endoteliali vascolari (ECs) interagiscono per formare l'intricata struttura del glomerulo. Senza questa interazione, la barriera di filtrazione glomerulare, costituita da podociti, membrana basale glomerulare (GBM) e CE, non può svilupparsi correttamente14,15,16. Sebbene gli organoidi renali in vitro contengano alcune EC, queste non riescono a formare una rete vascolare adeguata e diminuiscono nel tempo17. Non sorprende quindi che gli organoidi rimangano immaturi. Il trapianto nei topi induce vascolarizzazione e maturazione degli organoidi renali 18,19,20,21. Sfortunatamente, questo è un processo ad alta intensità di lavoro che non è adatto per l'analisi di un gran numero di organoidi.
Gli embrioni di pollo sono stati utilizzati per studiare la vascolarizzazione e lo sviluppo per oltre un secolo22. Sono facilmente accessibili, richiedono poca manutenzione, mancano di un sistema immunitario completamente funzionale e possono svilupparsi normalmente dopo aver aperto il guscio d'uovo23,24,25,26. È stato dimostrato che il trapianto di organoidi sulla loro membrana corioallantoica (CAM) porta alla vascolarizzazione27. Tuttavia, la durata del trapianto sulla CAM, così come il livello di maturazione dell'innesto, sono limitati dalla formazione della CAM, che richiede fino al giorno 7 embrionale per essere completata. Pertanto, è stato recentemente sviluppato un metodo per vascolarizzare e maturare in modo efficiente gli organoidi renali attraverso il trapianto tracciatomico in embrioni di pollo28. La cavità celomica degli embrioni di pollo è nota dal 1930 per essere un ambiente favorevole per la differenziazione dei tessuti embrionali29,30. È possibile accedervi all'inizio dello sviluppo embrionale e consente un'espansione relativamente illimitata dell'innesto in tutte le direzioni.
Questo documento delinea un protocollo per il trapianto di organoidi renali derivati da hiPSC nella cavità celomica di embrioni di pollo del giorno 4. Questo metodo induce la vascolarizzazione e una maggiore maturazione degli organoidi entro 8 giorni. L'iniezione di lente fluorescente culinaris agglutinina (LCA) prima di sacrificare gli embrioni consente la visualizzazione dei vasi sanguigni perfusi all'interno degli organoidi attraverso la microscopia confocale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>10462200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes&#160;</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>Contains silicone tubes, mouth piece and connector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHTC091-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHTC090-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope&#160;</td>
			<td>Wild Heerbrugg</td>
			<td>355110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHSB391-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-&#945;-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-212-02</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-&#945;-sheep Alexa Fluor 647</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21448</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edged stainless steel razor blades</td>
			<td>Electron Microsopy Sciences</td>
			<td>72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg cartons or custom made egg holders&#160;</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus)&#160;</td>
			<td>Drost Loosdrecht B.V.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Elbanton BV</td>
			<td>ET-3 combi</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>B-1325</td>
			<td>dilution 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHSB500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150F-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td>We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws.</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>L-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olivecrona dura dissector 18 cm&#160;</td>
			<td>Reda</td>
			<td>41146-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm&#160;</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HS234526B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated spoon&#160;</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>S-20-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 x 15 mm&#160;</td>
			<td>CELLSTAR</td>
			<td>628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipettes&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PP89SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified mouse anti-human CD31 antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555444</td>
			<td>dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>RL-1042</td>
			<td>This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-human NPHS1 antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>AF4269</td>
			<td>dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile hypodermic needles, 19 G</td>
			<td>BD microlance</td>
			<td>301500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Alexa Fluor 405</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S32351</td>
			<td>dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 5 mL</td>
			<td>BD Emerald</td>
			<td>307731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent tape&#160;</td>
			<td>Tesa</td>
			<td>4124</td>
			<td>Available at most hardware stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire, 0.25 mm dia&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>010404.H2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient vascularization of kidney organoids through intracelomic transplantation in chicken embryos

Gli organoidi renali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane contengono strutture simili a nefroni che assomigliano a quelle del rene adulto in una certa misura. Sfortunatamente, la loro applicabilità clinica è ostacolata dalla mancanza di una vascolarizzazione funzionale e di conseguenza dalla limitata maturazione in vitro. Il trapianto di organoidi renali nella cavità celomica degli embrioni di pollo induce la vascolarizzazione da parte dei vasi sanguigni perfusi, compresa la formazione di capillari glomerulari, e migliora la loro maturazione. Questa tecnica è molto efficiente, consentendo il trapianto e l'analisi di un gran numero di organoidi. Questo articolo descrive un protocollo dettagliato per il trapianto tracciatomico di organoidi renali in embrioni di pollo, seguito dall'iniezione di lectina marcata con fluorescenza per colorare la vascolarizzazione perfusa e dalla raccolta di organoidi trapiantati per l'analisi di imaging. Questo metodo può essere utilizzato per indurre e studiare la vascolarizzazione e la maturazione organoide per trovare indizi per migliorare questi processi in vitro e migliorare la modellazione della malattia.

Il metodo e la tempistica per la differenziazione delle hiPSC in organoidi renali, l'incubazione di uova di gallina fecondate, il trapianto di organoidi renali, l'iniezione di LCA e la raccolta degli organoidi sono riassunti nella Figura 1A. È importante coordinare i tempi della differenziazione organoide e dell'incubazione dell'uovo di gallina, iniziando la differenziazione 15 giorni prima dell'incubazione. Le azioni nei giorni 0, 3, 4 e 12 dell'incubazione sono illustrate da fotografie s...

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Efficient Vascularization of Kidney Organoids through Intracelomic Transplantation in Chicken Embryos

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per il trapianto di organoidi renali nella cavità celomica degli embrioni di pollo. Questo metodo induce la vascolarizzazione e una maggiore maturazione degli organoidi entro 8 giorni e può essere utilizzato per studiare questi processi in modo efficiente.

Vascolarizzazione efficiente degli organoidi renali attraverso il trapianto di intracelomica negli embrioni di pollo

Kidney organoids derived from human induced pluripotent stem cells contain nephron-like structures that resemble those in the adult kidney to a certain ...

Gli organoidi renali coltivati in vitro rimangono immaturi, limitandone l'applicabilità. E questo metodo di trapianto intracelomico induce vascolarizzazione e migliora la maturazione degli organoidi. La procedura è molto efficiente, consentendo il trapianto e l'analisi di un gran numero di organoidi in un esperimento.Dopo aver preparato organoidi renali derivati da HIPSC e incubato le uova fecondate di livorno, creare una finestra nel guscio d'uovo il terzo giorno di incubazione. Metti un piccolo pezzo di nastro trasparente sulla punta appuntita dell'uovo. Fai un piccolo foro nel guscio d'uovo nel mezzo del nastro trasparente picchiettandolo con l'estremità affilata di un paio di forbici da dissezione.Quindi, inserire un ago da 19 gauge su una siringa da cinque millilitri nel foro con un angolo di 45 gradi. Aspirare da due a tre millilitri di albumina dall'uovo per abbassare l'embrione all'interno dell'uovo. Nascondere il foro con un secondo pezzo di nastro trasparente, quindi posizionare un grande pezzo di nastro trasparente sulla matita contrassegnata verso l'alto verso il lato dell'uovo.Fai un buco nel guscio d'uovo nel mezzo del nastro trasparente picchiettandolo con l'estremità affilata di un paio di forbici da dissezione. Taglia una piccola finestra circolare nel guscio d'uovo da questo foro usando forbici da dissezione curve. Guarda attraverso questa finestra per individuare l'embrione.Quindi, ingrandisci la finestra per ottimizzare l'accesso all'embrione. Rimuovere eventuali pezzi grandi di guscio d'uovo che potrebbero essere caduti sopra l'embrione usando una pinza. Rimuovere i pezzi più piccoli mettendo alcune gocce di DPBS con calcio e magnesio sull'embrione con una pipetta di trasferimento di plastica, quindi aspirando il DPBS con il guscio d'uovo nella pipetta.Utilizzando una pipetta di trasferimento di plastica, aggiungere tre gocce di DPBS, integrate con streptomicina penicillina allo 0,5% all'uovo. Sigillare accuratamente la finestra con un grande pezzo di nastro trasparente prima di riporre l'uovo nell'incubatrice fino al quarto giorno di incubazione. Tagliare il nastro dalla finestra con forbici da dissezione curve.Metti l'uovo sotto un microscopio da dissezione su un supporto di gomma o un cartone per uova. L'embrione di pollo è ora nella fase 23-24 di Hamburger-Hamilton e giace sul lato sinistro con il lato destro rivolto verso lo spettatore. Localizzare l'ala destra e la gemma della gamba dell'embrione poiché il celoma sarà valutato tra questi due germogli degli arti.Nell'area tra l'ala destra e la gemma della gamba, crea un'apertura consecutiva nella membrana vitellina, nel corion e nell'amnione tenendoli con due paia di pinze da dissezione e tirandoli delicatamente in direzioni opposte. Controlla se c'è un accesso libero alla cavità celomica. Afferrare delicatamente il bordo della parete del corpo tra l'ala e il germoglio dell'arto con un paio di pinze da dissezione e tirarlo leggermente verso l'osservatore.La cavità celomica deve essere chiaramente visibile. Inserire con attenzione uno strumento smussato ma sottile nella cavità celomica. Posizionare mezzo organoide all'interno dell'uovo sopra l'allantoide usando un dissettore di dura.Usando una pinza da dissezione, afferrare con attenzione il bordo della parete del corpo e tirarlo leggermente verso l'osservatore per rendere visibile l'apertura del coelum. Spostare delicatamente l'organoide verso e attraverso l'apertura nella parete del corpo nel coelum con un filo di tungsteno smussato e un supporto per bisturi micro. Spingere leggermente l'organoide cranicamente per alloggiarlo all'interno del celo.Ora è visibile appena dietro la gemma dell'ala. Aggiungere tre gocce di DPBS all'uovo usando una pipetta di trasferimento di plastica. Sigillare accuratamente la finestra con un grande pezzo di nastro trasparente prima di riporre l'uovo nell'incubatrice fino al giorno 12 dell'incubazione.Tagliare il nastro dalla finestra con forbici da dissezione curve. Metti l'uovo sotto un microscopio da dissezione in un supporto di gomma. Valutare la vascolarizzazione e individuare le vene, che possono essere distinte dalle arterie per il loro colore rosso leggermente più brillante.Per migliorare l'accesso al sistema vascolare, allargare con cura la finestra tagliandola con forbici da dissezione curve. Dopo aver selezionato la vena, inserire la punta dell'ago micro capillare nella vena con un angolo da zero a 20 gradi. Assicurarsi che l'ago sia nella vena spostando delicatamente la punta da un lato all'altro.Soffiare delicatamente e costantemente nel sistema di iniezione per iniettare la lente culinaris agglutinina. E rimetti l'uovo nell'incubatrice per 10 minuti per farlo circolare. Metti l'uovo in un supporto di gomma sul banco.Quindi, tagliare le membrane che circondano l'embrione con forbici da dissezione curve. Raccogliere l'embrione dall'uovo con un cucchiaio perforato e decapitare immediatamente l'embrione usando le forbici. Sotto il microscopio a dissezione, posizionare il corpo dell'embrione in una capsula di Petri.Metti l'embrione sulla schiena nella capsula di Petri e allarga le sue membra. Aprire con attenzione la parete addominale dell'embrione lungo l'asse longitudinale usando una pinza. Individuare l'organoide all'interno dell'embrione.L'organoide si attacca più frequentemente al lobo del fegato destro, sia sulla punta del coccolo che cranialmente, appena sotto la gabbia toracica. Quindi, è consigliabile iniziare guardando queste posizioni. Una volta individuato l'organoide, rimuoverlo dall'embrione tagliandolo intorno con micro forbici.Posizionare l'organoide nel tessuto di pollo che è inevitabilmente attaccato ad esso in una capsula di Petri sotto il microscopio da dissezione. Rimuovere il più possibile il tessuto di pollo con una lama di rasoio in acciaio inossidabile a doppio taglio. Le immagini immunofluorescenti di un organoide renale non trapiantato e di un organoide renale trapiantato contengono entrambe strutture glomerulari e tubolari.Negli organoidi non trapiantati sono presenti alcune cellule endoteliali umane. Nell'organoide trapiantato, una rete vascolare perfusa è visibile in tutto l'organoide. Le immagini ingrandite delle aree inscatolate dimostrano i tre tipi di cellule endoteliali che possono essere distinte negli organoidi trapiantati: cellule endoteliali umane perfuse, cellule endoteliali umane non perfuse e cellule endoteliali perfuse derivate dal pollo.Negli organoidi non trapiantati, le cellule endoteliali circondano le strutture glomerulari ma non le invadono. Tuttavia, negli organoidi trapiantati, le strutture glomerulari sono vascolarizzate da capillari perfusi. Gli organoidi trapiantati possono essere analizzati utilizzando tecniche diverse a seconda dello scopo dell'esperimento.Il confronto diretto con i controlli non trapiantati può fornire informazioni sul processo di vascolarizzazione e maturazione.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Doppia etichettatura delle cellule della cresta neurale e dei vasi sanguigni all'interno degli embrioni di pollo utilizzando l'innesto del tubo neuraleGFP del pulcino e l'iniezione di colorante carbocianina

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Espianti di retina intero da pollo embrioni per trattamenti di elettroporazione e Agenti chimici

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Tecnica a Target microiniezione per lo sviluppo<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

Un metodo efficiente per ottenere cellule di grasso dedifferenziato

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation nel Brainstem Auditory del pollo

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

L'analisi di espressione genica tramite rilevazione di attività di β-galattosidasi in embrioni di topo intero

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualizzare il nodo e la piastra Notochordal In embrioni di topo Gastrulating mediante microscopia elettronica a scansione e intero Monte immunofluorescenza

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Espressione rapida ed efficiente di più proteine negli embrioni aviari utilizzando l'elettroporazione dell'mRNA

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

Un metodo semplificato per la generazione di organoidi renali da cellule staminali pluripotenti umane

Kidney organoids generated from hPSCs have provided an unlimited source of renal tissue. Human kidney organoids are an invaluable tool for studying kidney ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Un dispositivo di trapianto semplice ed efficace per embrioni di zebrafish

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...