Name: efficient vascularization of kidney organoids through intracelomic transplantation in chicken embryos
Uploaded: 2023-02-17T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Vascularization of Kidney Organoids through Intracelomic Transplantation in Chicken Embryos at JoVE.com

닭 배아 주입에 도움을 준 George Galaris(LUMC, Leiden, Netherlands)에게 감사드립니다. 우리는 Saskia van der Wal-Maas (Department of Anatomy & Embryology, LUMC, Leiden, the Netherlands), Conny van Munsteren (Department of Anatomy & Embryology, LUMC, Leiden, the Netherlands), Manon Zuurmond (LUMC, Leiden, the Netherlands), Annemarie de Graaf (LUMC, Leiden, the Netherlands)의 지원을 인정합니다. M. Koning은 'Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC'에 의해 지원됩니다. 이 작업은 Leiden University Fund "Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fund" GWF2019-02의 일부 지원을 받았습니다. 이 작업은 RegMedXB (Regenerative Medicine Crossing Borders)와 Health Holland, Top Sector Life Sciences & Health의 파트너가 지원합니다. C.W. van den Berg와 T.J. Rabelink는 Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine(reNEW)의 지원을 받고, Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine은 Novo Nordisk Foundation 보조금(NNF21CC0073729)의 지원을 받습니다.

네덜란드 법에 따라이 연구에는 동물 복지위원회의 승인이 필요하지 않았습니다.
1. 이식을 위한 hiPSC 유래 신장 오가노이드 준비
<ol><li>Takasato et al.4,18,31에 의해 개발된 프로토콜을 사용하여 hiPSC를 신장 오가노이드로 구별합니다. 분화 7일 + 12일까지 0.4μm 공극이 있는 폴리에스터 세포 배양 ?...

<ol>
	<li>Taguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+in+vivo+origin+of+metanephric+nephron+progenitors+enables+generation+of+complex+kidney+structures+from+pluripotent+stem+cells.">Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).</li><li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury.">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li><li>Kim, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-edited+human+kidney+organoids+reveal+mechanisms+of+disease+in+podocyte+development.">Gene-edited human kidney organoids reveal mechanisms of disease in podocyte development.</a> Stem Cells. 35 (12), 2366-2378 (2017).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Hale, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+organoid-derived+human+glomeruli+for+personalised+podocyte+disease+modelling+and+drug+screening.">3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening.</a> Nature Communications. 9 (1), 5167 (2018).</li><li>Vanslambrouck, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+metanephric+specification+to+functional+proximal+tubule+enables+toxicity+screening+and+infectious+disease+modelling+in+kidney+organoids.">Enhanced metanephric specification to functional proximal tubule enables toxicity screening and infectious disease modelling in kidney organoids.</a> Nature Communications. 13 (1), 5943 (2022).</li><li>Tanigawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+from+nephrotic+disease-derived+iPSCs+identify+impaired+NEPHRIN+localization+and+slit+diaphragm+formation+in+kidney+podocytes.">Organoids from nephrotic disease-derived iPSCs identify impaired NEPHRIN localization and slit diaphragm formation in kidney podocytes.</a> Stem Cell Reports. 11 (3), 727-740 (2018).</li><li>Forbes, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-iPSC-derived+kidney+organoids+show+functional+validation+of+a+ciliopathic+renal+phenotype+and+reveal+underlying+pathogenetic+mechanisms.">Patient-iPSC-derived kidney organoids show functional validation of a ciliopathic renal phenotype and reveal underlying pathogenetic mechanisms.</a> American Journal of Human Genetics. 102 (5), 816-831 (2018).</li><li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids.">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communications. 6, 8715 (2015).</li><li>Cruz, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cystogenesis+reveals+a+critical+role+of+microenvironment+in+human+polycystic+kidney+disease.">Organoid cystogenesis reveals a critical role of microenvironment in human polycystic kidney disease.</a> Nature Materials. 16 (11), 1112-1119 (2017).</li><li>Gupta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+injury+and+repair+in+kidney+organoids+reveals+that+homologous+recombination+governs+tubular+intrinsic+repair.">Modeling injury and repair in kidney organoids reveals that homologous recombination governs tubular intrinsic repair.</a> Science Translational Medicine. 14 (634), eabj4772 (2022).</li><li>Hiratsuka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid-on-a-chip+model+of+human+ARPKD+reveals+mechanosensing+pathomechanisms+for+drug+discovery.">Organoid-on-a-chip model of human ARPKD reveals mechanosensing pathomechanisms for drug discovery.</a> Scencei Advances. 8 (38), eabq0866 (2022).</li><li>Dorison, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+generated+using+an+allelic+series+of+NPHS2+point+variants+reveal+distinct+intracellular+podocin+mistrafficking.">Kidney organoids generated using an allelic series of NPHS2 point variants reveal distinct intracellular podocin mistrafficking.</a> Journal of the American Society of Nephrology. , (2022).</li><li>Eremina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular-specific+alterations+of+VEGF-A+expression+lead+to+distinct+congenital+and+acquired+renal+diseases.">Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases.</a> The Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).</li><li>Kitamoto, Y., Tokunaga, H., Tomita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+is+an+essential+molecule+for+mouse+kidney+development:+glomerulogenesis+and+nephrogenesis.">Vascular endothelial growth factor is an essential molecule for mouse kidney development: glomerulogenesis and nephrogenesis.</a> The Journal of Clinical Investigation. 99 (10), 2351-2357 (1997).</li><li>Sison, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+structure+and+function+require+paracrine,+not+autocrine,+VEGF-VEGFR-2+signaling.">Glomerular structure and function require paracrine, not autocrine, VEGF-VEGFR-2 signaling.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 21 (10), 1691-1701 (2010).</li><li>Ryan, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+deficiencies+in+renal+organoids+and+ex+vivo+kidney+organogenesis.">Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis.</a> Developmental Biology. 477, 98-116 (2021).</li><li>vanden Berg, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+subcapsular+transplantation+of+PSC-derived+kidney+organoids+induces+neo-vasculogenesis+and+significant+glomerular+and+tubular+maturation+in+vivo.">Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).</li><li>Sharmin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+podocytes+mature+into+vascularized+glomeruli+upon+experimental+transplantation.">Human induced pluripotent stem cell-derived podocytes mature into vascularized glomeruli upon experimental transplantation.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1778-1791 (2016).</li><li>Bantounas, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functioning+nephrons+by+implanting+human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+progenitors.">Generation of functioning nephrons by implanting human pluripotent stem cell-derived kidney progenitors.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 766-779 (2018).</li><li>vanden Berg, C. W., Koudijs, A., Ritsma, L., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+assessment+of+size-selective+glomerular+sieving+in+transplanted+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+organoids.">In vivo assessment of size-selective glomerular sieving in transplanted human induced pluripotent stem cell-derived kidney organoids.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 31 (5), 921-929 (2020).</li><li>Asai, R., Bressan, M., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avians+as+a+model+system+of+vascular+development.">Avians as a model system of vascular development.</a> Methods in Molecular Biology. 2206, 103-127 (2021).</li><li>Jankovic, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+capacity+of+the+chicken+embryo.+I.+Relationship+between+the+maturation+of+lymphoid+tissues+and+the+occurrence+of+cell-mediated+immunity+in+the+developing+chicken+embryo.">Immunological capacity of the chicken embryo. I. Relationship between the maturation of lymphoid tissues and the occurrence of cell-mediated immunity in the developing chicken embryo.</a> Immunology. 29 (3), 497-508 (1975).</li><li>Alkie, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+innate+immunity+in+chicken+embryos+and+newly+hatched+chicks:+a+disease+control+perspective.">Development of innate immunity in chicken embryos and newly hatched chicks: a disease control perspective.</a> Avian Pathology. 48 (4), 288-310 (2019).</li><li>Rawles, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+normal+embryonic+tissues.">Transplantation of normal embryonic tissues.</a> Annalls of the New York Academy of Sciences. 55 (2), 302-312 (1952).</li><li>Rawles, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+melanophores+from+embryonic+mouse+tissues+grown+in+the+coelom+of+chick+embryos.">The development of melanophores from embryonic mouse tissues grown in the coelom of chick embryos.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 26 (12), 673-680 (1940).</li><li>Garreta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+tuning+the+extracellular+environment+accelerates+the+derivation+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Materials. 18 (4), 397-405 (2019).</li><li>Koning, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculogenesis+in+kidney+organoids+upon+transplantation.">Vasculogenesis in kidney organoids upon transplantation.</a> NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 40 (2022).</li><li>Hamburger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenetic+and+axial+self-differentiation+of+transplanted+limb+primordia+of+2-day+chick+embryos.">Morphogenetic and axial self-differentiation of transplanted limb primordia of 2-day chick embryos.</a> Journal of Experimental Zoology. 77 (3), 379-399 (1938).</li><li>Dossel, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+of+intracelomic+grafting.">New method of intracelomic grafting.</a> Science. 120 (3111), 262-263 (1954).</li><li>Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).</li><li>Aleksandrowicz, E., Herr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethical+euthanasia+and+short-term+anesthesia+of+the+chick+embryo.">Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo.</a> ALTEX. 32 (2), 143-147 (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACUC.">ACUC.</a> Guideline: The Use and Euthanasia Procedures of Chicken/Avian Embryos. , (2012).</li></ol>

이 원고에서는 닭 배아에서 hiPSC 유래 신장 오가노이드의 뇌내 이식을 위한 프로토콜이 시연됩니다. 이식 시 오가노이드는 인간 오가노이드 유래 EC와 닭 유래 EC의 조합으로 구성된 관류 혈관에 의해 혈관화됩니다. 이들은 오가노이드 전체에 퍼져 사구체 구조를 침범하여 EC와 족세포 사이의 상호 작용을 가능하게 합니다. 이전에 이것이 오가노이드 사구체 및 관형 구조의 성숙을 향상시키는 것으?...

인간 유도만능줄기세포(hiPSC) 유래 신장 오가노이드는 발달 연구 1,2,3,4, 독성 스크리닝 5,6 및 질병 모델링5,7,8,9,10,11,12,13에 대한 잠재력이 있는 것으로 나타났습니다 . 그러나 이러한 목적 및 궁극적인 임상 이식 목적에 대한 적용 가능성은 혈관 네트워크의 부족으로 인해 제한됩니다. 배아 신장 발달 동안 족세포, 간질 세포 및 혈관 내피 세포(EC)가 상호 작용하여 사구체의 복잡한 구조를 형성합니다. 이러한 상호 작용이 없으면 족세포, 사구체 기저막(GBM) 및 EC로 구성된 사구체 여과 장벽이 제대로 발달할 수 없습니다14,15,16. 시험관 내 신장 오가노이드에는 일부 EC가 포함되어 있지만, 이들은 적절한 혈관 네트워크를 형성하지 못하고 시간이 지남에 따라 감소합니다17. 따라서 오가노이드가 미성숙한 상태로 남아 있는 것은 놀라운 일이 아닙니다. 마우스에서의 이식은 신장 오가노이드 18,19,20,21의 혈관화 및 성숙을 유도한다. 안타깝게도 이것은 많은 수의 오가노이드 분석에 적합하지 않은 노동 집약적인 공정입니다.
닭 배아는 한 세기 이상 혈관 형성과 발달을 연구하는 데 사용되어 왔습니다22. 그들은 쉽게 접근 할 수 있고, 유지 보수가 적고, 완전한 기능을 가진 면역 체계가 부족하며, 달걀 껍질을 연 후에 정상적으로 발달 할 수 있습니다23,24,25,26. 융모막(chorioallantoic membrane, CAM)에 오가노이드를 이식하면 혈관 형성이 일어나는 것으로 나타났다27. 그러나 CAM의 이식 기간과 이식편의 성숙 수준은 CAM 형성에 의해 제한되며, 이는 배아 7 일까지 완료됩니다. 따라서 최근 닭 배아에서 뇌내이식을 통해 신장 오가노이드를 효율적으로 혈관화하고 성숙시키는 방법이 개발되었다28. 닭 배아의 백두강은 1930년대부터 배아 조직의 분화에 유리한 환경으로 알려져 왔다29,30. 배아 발달 초기에 접근할 수 있으며 이식편을 모든 방향으로 비교적 무제한으로 확장할 수 있습니다.
이 논문은 4일차 닭 배아의 celomic cavity에 hiPSC 유래 신장 오가노이드를 이식하기 위한 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 이 방법은 8일 이내에 오가노이드의 혈관 형성 및 향상된 성숙을 유도합니다. 배아를 희생하기 전에 형광 표지된 수정체 쿨리나리스 응집소(LCA)를 주입하면 컨포칼 현미경을 통해 오가노이드 내의 관류된 혈관을 시각화할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>10462200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes&#160;</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>Contains silicone tubes, mouth piece and connector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHTC091-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHTC090-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope&#160;</td>
			<td>Wild Heerbrugg</td>
			<td>355110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHSB391-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-&#945;-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-212-02</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-&#945;-sheep Alexa Fluor 647</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21448</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edged stainless steel razor blades</td>
			<td>Electron Microsopy Sciences</td>
			<td>72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg cartons or custom made egg holders&#160;</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus)&#160;</td>
			<td>Drost Loosdrecht B.V.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Elbanton BV</td>
			<td>ET-3 combi</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>B-1325</td>
			<td>dilution 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHSB500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150F-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td>We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws.</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>L-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olivecrona dura dissector 18 cm&#160;</td>
			<td>Reda</td>
			<td>41146-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm&#160;</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HS234526B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated spoon&#160;</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>S-20-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 x 15 mm&#160;</td>
			<td>CELLSTAR</td>
			<td>628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipettes&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PP89SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified mouse anti-human CD31 antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555444</td>
			<td>dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>RL-1042</td>
			<td>This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-human NPHS1 antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>AF4269</td>
			<td>dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile hypodermic needles, 19 G</td>
			<td>BD microlance</td>
			<td>301500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Alexa Fluor 405</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S32351</td>
			<td>dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 5 mL</td>
			<td>BD Emerald</td>
			<td>307731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent tape&#160;</td>
			<td>Tesa</td>
			<td>4124</td>
			<td>Available at most hardware stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire, 0.25 mm dia&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>010404.H2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient vascularization of kidney organoids through intracelomic transplantation in chicken embryos

인간 유도 만능 줄기 세포에서 유래한 신장 오가노이드는 성인 신장의 것과 어느 정도 유사한 네프론 유사 구조를 포함합니다. 불행하게도, 그들의 임상적 적용 가능성은 기능적 맥관 구조의 부족과 결과적으로 시험관 내 성숙이 제한되어 방해를 받습니다. 닭 배아의 celomic cavity에 신장 오가노이드를 이식하면 사구체 모세 혈관 형성을 포함하여 관류 된 혈관에 의한 혈관 형성을 유도하고 성숙을 향상시킵니다. 이 기술은 매우 효율적이어서 많은 수의 오가노이드를 이식하고 분석할 수 있습니다. 이 논문은 닭 배아에서 신장 오가노이드의 뇌내 이식에 대한 자세한 프로토콜을 설명한 후 관류된 혈관 구조를 염색하기 위해 형광 표지된 렉틴을 주입하고 이미징 분석을 위해 이식된 오가노이드를 수집합니다. 이 방법은 오가노이드 혈관화 및 성숙을 유도 및 연구하여 시험관 내에서 이러한 과정을 향상시키고 질병 모델링을 개선하기 위한 단서를 찾는 데 사용할 수 있습니다.

hiPSC를 신장 오가노이드로 분화하는 방법과 일정, 수정된 닭 알의 배양, 신장 오가노이드의 이식, LCA 주입 및 오가노이드 수집을 위한 방법이 그림 1A에 요약되어 있습니다. 오가노이드 분화와 닭고기 달걀 부화의 시기를 조정하고 부화 15일 전에 분화를 시작하는 것이 중요합니다. 배양 0일, 3일, 4일, 12일의 행동은 타임라인 아래의 사진으로 설명됩니다. 오가노이드는 분화 7?...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Vascularization of Kidney Organoids through Intracelomic Transplantation in Chicken Embryos at JoVE.com

Efficient Vascularization of Kidney Organoids through Intracelomic Transplantation in Chicken Embryos

여기에서 우리는 닭 배아의 celomic cavity에서 신장 오가노이드의 이식을 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 8일 이내에 오가노이드의 혈관 형성 및 성숙 향상을 유도하고 이러한 과정을 효율적인 방식으로 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

닭 배아에서 Intracelomic Transplantation을 통한 신장 오가노이드의 효율적인 혈관 형성

Kidney organoids derived from human induced pluripotent stem cells contain nephron-like structures that resemble those in the adult kidney to a certain ...

시험관 내에서 배양된 신장 오가노이드는 미성숙 상태로 남아 있어 적용 가능성이 제한됩니다. 그리고 이 체금내 이식 방법은 혈관 형성을 유도하고 오가노이드의 성숙을 향상시킵니다. 이 절차는 매우 효율적이어서 한 번의 실험에서 많은 수의 오가노이드를 이식하고 분석할 수 있습니다.HIPSC에서 유래한 신장 오가노이드를 준비하고 수정된 레그혼 알을 배양한 후 배양 3일째에 달걀 껍질에 창을 만듭니다. 달걀의 뾰족한 끝에 작은 투명 테이프를 붙입니다. 투명 테이프 중간의 달걀 껍질에 작은 구멍을 뚫어 해부 가위의 날카로운 끝으로 두드려주세요.그런 다음 5 밀리리터 주사기에 19 게이지 바늘을 45도 각도로 구멍에 삽입합니다. 난자에서 2-3 밀리리터의 알부민을 흡인하여 난자 내부의 배아를 낮 춥니 다. 두 번째 투명 테이프로 구멍을 숨긴 다음 달걀의 위쪽을 향한 면이 위로 표시된 연필에 큰 투명 테이프를 붙입니다.투명 테이프 중간에 달걀 껍질에 구멍을 뚫어 해부 가위의 날카로운 끝으로 두드려주세요. 구부러진 해부 가위를 사용하여이 구멍에서 달걀 껍질에 작은 원형 창을 자릅니다. 이 창을 통해 배아를 찾으십시오.그런 다음 배아에 대한 접근을 최적화하기 위해 창을 확대하십시오. 집게를 사용하여 배아 위에 떨어졌을 수 있는 큰 달걀 껍질 조각을 제거합니다. 플라스틱 이식 피펫으로 배아에 칼슘과 마그네슘이 함유된 DPBS 몇 방울을 떨어뜨린 다음 달걀 껍질이 있는 DPBS를 피펫으로 흡인하여 더 작은 조각을 제거합니다.플라스틱 이송 피펫을 사용하여 0.5% 페니실린 스트렙토마이신이 보충된 DPBS 3방울을 계란에 추가합니다. 부화 4일째까지 알을 인큐베이터에 다시 넣기 전에 큰 투명 테이프로 창을 조심스럽게 밀봉하십시오. 구부러진 해부 가위로 창에서 테이프를 자릅니다.고무 홀더 또는 달걀 상자의 해부 현미경 아래에 달걀을 놓습니다. 닭 배아는 현재 햄버거-해밀턴 스테이지 23-24에 있으며 왼쪽으로 누워 오른쪽이 시청자를 향하고 있습니다. 배아의 오른쪽 날개와 다리 새싹을 찾으면 이 두 개의 사지 새싹 사이에서 coelom이 평가됩니다.오른쪽 날개와 다리 봉오리 사이의 영역에서 두 쌍의 해부 집게로 잡고 부드럽게 반대 방향으로 당겨 vitelline 막, chorion 및 양막에 연속적으로 구멍을 만듭니다. 체강에 방해받지 않는 접근이 있는지 확인하십시오. 한 쌍의 해부 집게로 날개와 사지 새싹 사이의 체벽 가장자리를 부드럽게 잡고 보는 사람쪽으로 약간 당깁니다.체강은 명확하게 보여야 합니다. 뭉툭하지만 가느다란 기구를 체강 구멍에 조심스럽게 삽입합니다. 경막 해부기를 사용하여 알란토스 위에 계란 안에 오가노이드 반을 놓습니다.해부 집게를 사용하여 체벽의 가장자리를 조심스럽게 잡고 관찰자 쪽으로 약간 당겨 coelum의 개구부가 보이도록 합니다. 뭉툭한 텅스텐 와이어와 마이크로 메스 홀더를 사용하여 오가노이드를 체벽의 구멍을 통해 코엘럼으로 부드럽게 움직입니다. 오가노이드를 약간 두개골로 밀어 섬토 내부에 넣습니다.이제 날개 봉오리 바로 뒤에서 볼 수 있습니다. 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 계란에 DPBS 3 방울을 첨가하십시오. 부화 12 일까지 알을 인큐베이터에 다시 넣기 전에 큰 투명 테이프로 창을 조심스럽게 밀봉하십시오.구부러진 해부 가위로 창에서 테이프를 자릅니다. 고무 홀더의 해부 현미경 아래에 계란을 놓습니다. 혈관 구조를 평가하고 약간 더 밝은 붉은 색으로 동맥과 구별 할 수있는 정맥을 찾습니다.혈관 구조에 대한 접근성을 높이려면 구부러진 해부 가위로 창을 잘라서 조심스럽게 확대하십시오. 정맥을 선택한 후 미세 모세관 바늘의 끝을 0도에서 20도 각도로 정맥에 삽입합니다. 팁을 좌우로 부드럽게 움직여 바늘이 정맥에 있는지 확인합니다.렌즈 culinaris 응집소를 주입하기 위하여 주입 체계로 온화하게 그리고 꾸준히 불어. 그리고 계란을 인큐베이터에 10분 동안 다시 넣어 순환시킵니다. 계란을 벤치의 고무 홀더에 넣으십시오.그런 다음 구부러진 해부 가위로 배아를 둘러싼 막을 자릅니다. 구멍이 뚫린 숟가락으로 난자에서 배아를 긁어 내고 즉시 가위를 사용하여 배아를 참수하십시오. 해부 현미경 아래에서 배아의 몸을 페트리 접시에 넣습니다.배아를 페트리 접시에 넣고 팔다리를 펼칩니다. 집게를 사용하여 세로축을 따라 배아의 복벽을 조심스럽게 엽니 다. 배아 내부에서 오가노이드를 찾습니다.오가노이드는 가장 자주 코들 끝 또는 두개골의 흉곽 바로 아래 오른쪽 간엽에 부착됩니다. 따라서 이러한 위치를 살펴보는 것부터 시작하는 것이 좋습니다. 오가노이드를 찾으면 미세 가위로 주위를 잘라 배아에서 제거합니다.필연적으로 부착 된 닭 조직에 오가노이드를 해부 현미경으로 페트리 접시에 넣습니다. 양날의 스테인리스 스틸 면도날로 닭 티슈를 최대한 많이 제거합니다. 이식되지 않은 신장 오가노이드와 이식된 신장 오가노이드의 면역형광 이미지는 모두 사구체 및 관형 구조를 포함합니다.이식되지 않은 오가노이드에는 일부 인간 내피 세포가 존재합니다. 이식된 오가노이드에서는 관류된 혈관 네트워크가 오가노이드 전체에서 볼 수 있습니다. 박스형 영역의 확대된 이미지는 이식된 오가노이드에서 구별할 수 있는 세 가지 유형의 내피 세포(관류된 인간 내피 세포, 관류되지 않은 인간 내피 세포 및 관류된 닭 유래 내피 세포)를 보여줍니다.이식되지 않은 오가노이드에서 내피 세포는 사구체 구조를 둘러싸고 있지만 침범하지는 않습니다. 그러나 이식된 오가노이드에서 사구체 구조는 관류된 모세혈관에 의해 혈관화됩니다. 이식된 오가노이드는 실험의 목적에 따라 다양한 기술을 사용하여 분석할 수 있습니다.이식되지 않은 대조군과의 직접적인 비교는 혈관 형성 및 성숙 과정에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

병아리GFP 신경관 이식 및 카르보시아닌 염료 DiI 주입을 사용하여 닭 배아 내신경염 세포 및 혈관의 이중 라벨링

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

연구

발생학

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

일렉트로 화학 시약 트리트먼트의 닭 배아에서 전체 망막의 Explants

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

개발에 미세 주입을 대상으로 기술<em&gt; Xenopus의</em&gt; 신장

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

효율적인 방법은 탈분화 지방 세포를 얻는 방법

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

닭 오라클 Brainstem의 Ovo Electroporation에서

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

전체 마우스 배아에서 β-galactosidase 활동의 감지를 통해 유전자 발현 추적

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

노드 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 면역 형광 산 전체를 사용 하 여 Gastrulating 마우스 배아에서 Notochordal 접시를 시각화

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

mRNA 전기 포란을 사용하여 조류 배아에서 여러 단백질의 빠르고 효율적인 발현

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

인간 다능성 줄기 세포로부터 신장 오가노이드를 생성하는 단순화된 방법

Kidney organoids generated from hPSCs have provided an unlimited source of renal tissue. Human kidney organoids are an invaluable tool for studying kidney ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Zebrafish 배아를 위한 간단하고 효과적인 이식 장치

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...