Name: efficient vascularization of kidney organoids through intracelomic transplantation in chicken embryos
Uploaded: 2023-02-17T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Vascularization of Kidney Organoids through Intracelomic Transplantation in Chicken Embryos at JoVE.com

Vi takker George Galaris (LUMC, Leiden, Nederland) for hans hjelp med kyllingembryoinjeksjon. Vi takker støtten fra Saskia van der Wal-Maas (Institutt for anatomi og embryologi, LUMC, Leiden, Nederland), Conny van Munsteren (Institutt for anatomi og embryologi, LUMC, Leiden, Nederland), Manon Zuurmond (LUMC, Leiden, Nederland) og Annemarie de Graaf (LUMC, Leiden, Nederland). M. Koning støttes av 'Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC'. Dette arbeidet ble delvis støttet av Leiden University Fund "Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fund" GWF2019-02. Dette arbeidet støttes av partnerne til Regenerative Medicine Crossing Borders (RegMedXB) og Health Holland, Top Sector Life Sciences &; Health. C.W. van den Berg og T.J. Rabelink støttes av The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine støttes av tilskudd fra Novo Nordisk Foundation (NNF21CC0073729).

I henhold til nederlandsk lov var det ikke nødvendig med godkjenning fra dyrevelferdskomiteen for denne undersøkelsen.
1. Klargjøring av hiPSC-avledede nyreorganoider for transplantasjon
<ol><li>Differensiere hiPSCs til nyreorganoider ved hjelp av protokollen utviklet av Takasato et al.4,18,31. Dyrkning av organoidene som følger denne protokollen på polyestercellekulturinnsatse...

<ol>
	<li>Taguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+in+vivo+origin+of+metanephric+nephron+progenitors+enables+generation+of+complex+kidney+structures+from+pluripotent+stem+cells.">Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).</li><li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury.">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li><li>Kim, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-edited+human+kidney+organoids+reveal+mechanisms+of+disease+in+podocyte+development.">Gene-edited human kidney organoids reveal mechanisms of disease in podocyte development.</a> Stem Cells. 35 (12), 2366-2378 (2017).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Hale, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+organoid-derived+human+glomeruli+for+personalised+podocyte+disease+modelling+and+drug+screening.">3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening.</a> Nature Communications. 9 (1), 5167 (2018).</li><li>Vanslambrouck, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+metanephric+specification+to+functional+proximal+tubule+enables+toxicity+screening+and+infectious+disease+modelling+in+kidney+organoids.">Enhanced metanephric specification to functional proximal tubule enables toxicity screening and infectious disease modelling in kidney organoids.</a> Nature Communications. 13 (1), 5943 (2022).</li><li>Tanigawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+from+nephrotic+disease-derived+iPSCs+identify+impaired+NEPHRIN+localization+and+slit+diaphragm+formation+in+kidney+podocytes.">Organoids from nephrotic disease-derived iPSCs identify impaired NEPHRIN localization and slit diaphragm formation in kidney podocytes.</a> Stem Cell Reports. 11 (3), 727-740 (2018).</li><li>Forbes, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-iPSC-derived+kidney+organoids+show+functional+validation+of+a+ciliopathic+renal+phenotype+and+reveal+underlying+pathogenetic+mechanisms.">Patient-iPSC-derived kidney organoids show functional validation of a ciliopathic renal phenotype and reveal underlying pathogenetic mechanisms.</a> American Journal of Human Genetics. 102 (5), 816-831 (2018).</li><li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids.">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communications. 6, 8715 (2015).</li><li>Cruz, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cystogenesis+reveals+a+critical+role+of+microenvironment+in+human+polycystic+kidney+disease.">Organoid cystogenesis reveals a critical role of microenvironment in human polycystic kidney disease.</a> Nature Materials. 16 (11), 1112-1119 (2017).</li><li>Gupta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+injury+and+repair+in+kidney+organoids+reveals+that+homologous+recombination+governs+tubular+intrinsic+repair.">Modeling injury and repair in kidney organoids reveals that homologous recombination governs tubular intrinsic repair.</a> Science Translational Medicine. 14 (634), eabj4772 (2022).</li><li>Hiratsuka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid-on-a-chip+model+of+human+ARPKD+reveals+mechanosensing+pathomechanisms+for+drug+discovery.">Organoid-on-a-chip model of human ARPKD reveals mechanosensing pathomechanisms for drug discovery.</a> Scencei Advances. 8 (38), eabq0866 (2022).</li><li>Dorison, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+generated+using+an+allelic+series+of+NPHS2+point+variants+reveal+distinct+intracellular+podocin+mistrafficking.">Kidney organoids generated using an allelic series of NPHS2 point variants reveal distinct intracellular podocin mistrafficking.</a> Journal of the American Society of Nephrology. , (2022).</li><li>Eremina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular-specific+alterations+of+VEGF-A+expression+lead+to+distinct+congenital+and+acquired+renal+diseases.">Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases.</a> The Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).</li><li>Kitamoto, Y., Tokunaga, H., Tomita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+is+an+essential+molecule+for+mouse+kidney+development:+glomerulogenesis+and+nephrogenesis.">Vascular endothelial growth factor is an essential molecule for mouse kidney development: glomerulogenesis and nephrogenesis.</a> The Journal of Clinical Investigation. 99 (10), 2351-2357 (1997).</li><li>Sison, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+structure+and+function+require+paracrine,+not+autocrine,+VEGF-VEGFR-2+signaling.">Glomerular structure and function require paracrine, not autocrine, VEGF-VEGFR-2 signaling.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 21 (10), 1691-1701 (2010).</li><li>Ryan, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+deficiencies+in+renal+organoids+and+ex+vivo+kidney+organogenesis.">Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis.</a> Developmental Biology. 477, 98-116 (2021).</li><li>vanden Berg, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+subcapsular+transplantation+of+PSC-derived+kidney+organoids+induces+neo-vasculogenesis+and+significant+glomerular+and+tubular+maturation+in+vivo.">Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).</li><li>Sharmin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+podocytes+mature+into+vascularized+glomeruli+upon+experimental+transplantation.">Human induced pluripotent stem cell-derived podocytes mature into vascularized glomeruli upon experimental transplantation.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1778-1791 (2016).</li><li>Bantounas, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functioning+nephrons+by+implanting+human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+progenitors.">Generation of functioning nephrons by implanting human pluripotent stem cell-derived kidney progenitors.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 766-779 (2018).</li><li>vanden Berg, C. W., Koudijs, A., Ritsma, L., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+assessment+of+size-selective+glomerular+sieving+in+transplanted+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+organoids.">In vivo assessment of size-selective glomerular sieving in transplanted human induced pluripotent stem cell-derived kidney organoids.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 31 (5), 921-929 (2020).</li><li>Asai, R., Bressan, M., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avians+as+a+model+system+of+vascular+development.">Avians as a model system of vascular development.</a> Methods in Molecular Biology. 2206, 103-127 (2021).</li><li>Jankovic, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+capacity+of+the+chicken+embryo.+I.+Relationship+between+the+maturation+of+lymphoid+tissues+and+the+occurrence+of+cell-mediated+immunity+in+the+developing+chicken+embryo.">Immunological capacity of the chicken embryo. I. Relationship between the maturation of lymphoid tissues and the occurrence of cell-mediated immunity in the developing chicken embryo.</a> Immunology. 29 (3), 497-508 (1975).</li><li>Alkie, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+innate+immunity+in+chicken+embryos+and+newly+hatched+chicks:+a+disease+control+perspective.">Development of innate immunity in chicken embryos and newly hatched chicks: a disease control perspective.</a> Avian Pathology. 48 (4), 288-310 (2019).</li><li>Rawles, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+normal+embryonic+tissues.">Transplantation of normal embryonic tissues.</a> Annalls of the New York Academy of Sciences. 55 (2), 302-312 (1952).</li><li>Rawles, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+melanophores+from+embryonic+mouse+tissues+grown+in+the+coelom+of+chick+embryos.">The development of melanophores from embryonic mouse tissues grown in the coelom of chick embryos.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 26 (12), 673-680 (1940).</li><li>Garreta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+tuning+the+extracellular+environment+accelerates+the+derivation+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Materials. 18 (4), 397-405 (2019).</li><li>Koning, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculogenesis+in+kidney+organoids+upon+transplantation.">Vasculogenesis in kidney organoids upon transplantation.</a> NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 40 (2022).</li><li>Hamburger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenetic+and+axial+self-differentiation+of+transplanted+limb+primordia+of+2-day+chick+embryos.">Morphogenetic and axial self-differentiation of transplanted limb primordia of 2-day chick embryos.</a> Journal of Experimental Zoology. 77 (3), 379-399 (1938).</li><li>Dossel, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+of+intracelomic+grafting.">New method of intracelomic grafting.</a> Science. 120 (3111), 262-263 (1954).</li><li>Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).</li><li>Aleksandrowicz, E., Herr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethical+euthanasia+and+short-term+anesthesia+of+the+chick+embryo.">Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo.</a> ALTEX. 32 (2), 143-147 (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACUC.">ACUC.</a> Guideline: The Use and Euthanasia Procedures of Chicken/Avian Embryos. , (2012).</li></ol>

I dette manuskriptet er det vist en protokoll for intracelomisk transplantasjon av hiPSC-deriverte nyreorganoider i kyllingembryoer. Ved transplantasjon vaskulariseres organoider av perfuserte blodkar som består av en kombinasjon av humane organoidavledede og kyllingavledede ECer. Disse er spredt over hele organoid og invaderer glomerulære strukturer, noe som muliggjør interaksjon mellom ECs og podocytter. Det er tidligere vist at dette fører til økt modning av organoide, glomerulære og rørformede strukturer<sup c...

Humaninduserte pluripotente stamceller (hiPSC)-avledede nyreorganoider har vist seg å ha potensial for utviklingsstudier 1,2,3,4, toksisitetsscreening 5,6 og sykdomsmodellering 5,7,8,9,10,11,12,13 . Imidlertid er deres anvendelighet for disse og eventuelle kliniske transplantasjonsformål begrenset av mangelen på et vaskulært nettverk. Under embryonal nyreutvikling samhandler podocytter, mesangialceller og vaskulære endotelceller (EC) for å danne den intrikate strukturen til glomerulus. Uten denne interaksjonen kan den glomerulære filtreringsbarrieren, bestående av podocytter, den glomerulære kjellermembranen (GBM) og ECs, ikke utvikle seg riktig14,15,16. Selv om nyreorganoider in vitro inneholder noen EC, klarer disse ikke å danne et skikkelig vaskulært nettverk og avtar over tid17. Det er derfor ikke overraskende at organoidene forblir umodne. Transplantasjon hos mus induserer vaskularisering og modning av nyreorganoider 18,19,20,21. Dessverre er dette en arbeidsintensiv prosess som er uegnet for analyse av et stort antall organoider.
Kyllingembryoer har blitt brukt til å studere vaskularisering og utvikling i over et århundre22. De er lett tilgjengelige, krever lite vedlikehold, mangler et fullt funksjonelt immunsystem, og kan utvikle seg normalt etter åpning av eggeskallet23,24,25,26. Transplantasjon av organoider på deres chorioallantoic membran (CAM) har vist seg å føre til vaskularisering27. Imidlertid er varigheten av transplantasjonen på CAM, så vel som nivået av modning av transplantatet, begrenset av CAM-dannelse, som tar til embryonal dag 7 for å fullføre. Derfor ble det nylig utviklet en metode for effektivt å vaskularisere og modne nyreorganoider gjennom intracelomisk transplantasjon i kyllingembryoer28. Det celomiske hulrommet av kyllingembryoer har vært kjent siden 1930-tallet for å være et gunstig miljø for differensiering av embryonale vev 29,30. Det kan nås tidlig i embryonal utvikling og muliggjør relativt ubegrenset utvidelse av transplantatet i alle retninger.
Denne artikkelen skisserer en protokoll for transplantasjon av hiPSC-avledede nyreorganoider i det celomiske hulrommet på dag 4 kyllingembryoer. Denne metoden induserer vaskularisering og forbedret modning av organoider innen 8 dager. Injeksjon av fluorescerende merket linse culinaris agglutinin (LCA) før ofring av embryoene muliggjør visualisering av perfuserte blodkar i organoider gjennom konfokal mikroskopi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>10462200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes&#160;</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>Contains silicone tubes, mouth piece and connector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHTC091-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHTC090-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope&#160;</td>
			<td>Wild Heerbrugg</td>
			<td>355110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHSB391-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-&#945;-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-212-02</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-&#945;-sheep Alexa Fluor 647</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21448</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edged stainless steel razor blades</td>
			<td>Electron Microsopy Sciences</td>
			<td>72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg cartons or custom made egg holders&#160;</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus)&#160;</td>
			<td>Drost Loosdrecht B.V.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Elbanton BV</td>
			<td>ET-3 combi</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>B-1325</td>
			<td>dilution 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHSB500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150F-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td>We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws.</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>L-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olivecrona dura dissector 18 cm&#160;</td>
			<td>Reda</td>
			<td>41146-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm&#160;</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HS234526B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated spoon&#160;</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>S-20-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 x 15 mm&#160;</td>
			<td>CELLSTAR</td>
			<td>628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipettes&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PP89SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified mouse anti-human CD31 antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555444</td>
			<td>dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>RL-1042</td>
			<td>This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-human NPHS1 antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>AF4269</td>
			<td>dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile hypodermic needles, 19 G</td>
			<td>BD microlance</td>
			<td>301500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Alexa Fluor 405</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S32351</td>
			<td>dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 5 mL</td>
			<td>BD Emerald</td>
			<td>307731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent tape&#160;</td>
			<td>Tesa</td>
			<td>4124</td>
			<td>Available at most hardware stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire, 0.25 mm dia&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>010404.H2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient vascularization of kidney organoids through intracelomic transplantation in chicken embryos

Nyreorganoider avledet fra humane induserte pluripotente stamceller inneholder nefronlignende strukturer som ligner de i den voksne nyren til en viss grad. Dessverre hemmes deres kliniske anvendelighet av mangelen på en funksjonell vaskulatur og følgelig begrenset modning in vitro. Transplantasjonen av nyreorganoider i det celomiske hulrommet av kyllingembryoer induserer vaskularisering av perfuserte blodkar, inkludert dannelsen av glomerulære kapillærer, og forbedrer modningen. Denne teknikken er svært effektiv, noe som muliggjør transplantasjon og analyse av et stort antall organoider. Dette papiret beskriver en detaljert protokoll for intracelomisk transplantasjon av nyreorganoider i kyllingembryoer, etterfulgt av injeksjon av fluorescerende merket lektin for å flekke den perfuserte vaskulaturen, og samlingen av transplanterte organoider for avbildningsanalyse. Denne metoden kan brukes til å indusere og studere organoid vaskularisering og modning for å finne ledetråder for å forbedre disse prosessene in vitro og forbedre sykdomsmodellering.

Metode og tidslinje for differensiering av hiPSC til nyreorganoider, inkubasjon av befruktede kyllingegg, transplantasjon av nyreorganoider, injeksjon av LCA og innsamling av organoider er oppsummert i figur 1A. Det er viktig å koordinere tidspunktet for organoid differensiering og kyllingegginkubasjon, og starte differensiering 15 dager før inkubasjon. Handlingene på dag 0, 3, 4 og 12 av inkubasjonen er illustrert med fotografier under tidslinjen. Organoider transplanteres på dag 7 + 1...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Vascularization of Kidney Organoids through Intracelomic Transplantation in Chicken Embryos at JoVE.com

Efficient Vascularization of Kidney Organoids through Intracelomic Transplantation in Chicken Embryos

Her presenterer vi en detaljert protokoll for transplantasjon av nyreorganoider i det celomiske hulrommet av kyllingembryoer. Denne metoden induserer vaskularisering og forbedret modning av organoider innen 8 dager og kan brukes til å studere disse prosessene på en effektiv måte.

Effektiv vaskularisering av nyreorganoider gjennom intracelomisk transplantasjon i kyllingembryoer

Kidney organoids derived from human induced pluripotent stem cells contain nephron-like structures that resemble those in the adult kidney to a certain ...

Nyreorganoider dyrket in vitro forblir umodne, noe som begrenser deres anvendelighet. Og denne metoden for intracoelomisk transplantasjon induserer vaskularisering og forbedrer modningen av organoider. Prosedyren er svært effektiv, noe som muliggjør transplantasjon og analyse av et stort antall organoider i ett eksperiment.Etter å ha tilberedt HIPSC-avledede nyreorganoider og inkubert de befruktede leghorneggene, lager du et vindu i eggeskallet på dag tre av inkubasjonen. Legg et lite stykke gjennomsiktig tape på den spisse spissen av egget. Lag et lite hull i eggeskallet i midten av det gjennomsiktige båndet ved å banke på det med den skarpe enden av en dissekerende saks.Sett deretter en 19-gauge nål på en fem milliliter sprøyte inn i hullet i en 45-graders vinkel. Aspirer to til tre milliliter albumin fra egget for å senke embryoet inne i egget. Skjul hullet med et annet stykke gjennomsiktig tape, og legg deretter et stort stykke gjennomsiktig tape på blyanten merket oppovervendt side av egget.Lag et hull i eggeskallet i midten av det gjennomsiktige båndet ved å banke på det med den skarpe enden av en dissekerende saks. Klipp et lite sirkulært vindu i eggeskallet fra dette hullet ved hjelp av buet dissekerende saks. Se gjennom dette vinduet for å finne embryoet.Deretter forstørrer du vinduet for å optimalisere tilgangen til embryoet. Fjern eventuelle store biter av eggeskall som kan ha falt på toppen av embryoet ved hjelp av tang. Fjern mindre biter ved å plassere noen dråper DPBS med kalsium og magnesium på embryoet med en plastoverføringspipette, og deretter aspirere DPBS med eggeskallet inn i pipetten.Bruk en plastoverføringspipette, tilsett tre dråper DPBS, supplert med 0,5% penicillin streptomycin til egget. Forsegl forsiktig vinduet med et stort stykke gjennomsiktig tape før du legger egget tilbake i inkubatoren til dag fire av inkubasjonen. Klipp båndet fra vinduet med buet dissekerende saks.Legg egget under et dissekerende mikroskop på en gummiholder eller eggekartong. Kyllingembryoet er nå i Hamburger-Hamilton trinn 23 til 24 og ligger på venstre side med høyre side mot seeren. Finn høyre vinge og benknopp av embryoet, da coelom vil bli vurdert mellom disse to lemknoppene.I området mellom høyre vinge og benknopp, opprett en åpning etter hverandre i vitellinemembranen, korionen og amnionen ved å holde dem med to par dissekerende tang og forsiktig trekke dem i motsatte retninger. Sjekk om det er uhindret tilgang til coelomic cavity. Ta forsiktig tak i kanten av kroppsveggen mellom vingen og lemknoppen med et par dissekerende tang og trekk den litt mot betrakteren.Det coelomiske hulrommet må være tydelig synlig. Sett forsiktig et sløvt, men slankt instrument inn i coelomic cavity. Legg en halv organoid inne i egget på toppen av allantois ved hjelp av en dura dissektor.Bruk dissekerende tang, ta forsiktig tak i kanten av kroppsveggen og trekk den litt mot betrakteren for å gjøre åpningen til coelum synlig. Beveg organoiden forsiktig mot og gjennom åpningen i kroppsveggen inn i coelum med en stump wolframtråd og en mikroskalpellholder. Skyv organoiden litt kranialt for å legge den inn i coelum.Den er nå synlig like bak vingeknoppen. Tilsett tre dråper DPBS til egget ved hjelp av en plastoverføringspipette. Forsegl forsiktig vinduet med et stort stykke gjennomsiktig tape før du legger egget tilbake i inkubatoren til dag 12 av inkubasjonen.Klipp båndet fra vinduet med buet dissekerende saks. Legg egget under et dissekerende mikroskop i en gummiholder. Evaluer vaskulaturen og finn venene, som kan skille seg fra arteriene ved deres litt lysere røde farge.For å forbedre tilgangen til vaskulaturen, forstørre vinduet forsiktig ved å kutte det med buet dissekerende saks. Etter å ha valgt venen, sett spissen av mikrokapillærnålen inn i venen i en null til 20 graders vinkel. Forsikre deg om at nålen er i venen ved å bevege spissen forsiktig fra side til side.Blås forsiktig og jevnt inn i injeksjonssystemet for å injisere linsen culinaris agglutinin. Og legg egget tilbake i inkubatoren i 10 minutter for å la det sirkulere. Legg egget i en gummiholder på benken.Deretter skjærer du gjennom membranene som omgir embryoet med buet dissekerende saks. Øs embryoet opp fra egget med en perforert skje og halshugg embryoet umiddelbart ved hjelp av saks. Under disseksjonsmikroskopet, plasser embryoets kropp i en petriskål.Legg embryoet på ryggen i petriskålen og spre lemmer. Åpne forsiktig bukveggen av embryoet langs lengdeaksen ved hjelp av tang. Finn organoid inne i embryoet.Organoiden blir oftest festet til høyre leverlapp, enten ved kokspissen eller kranialt, like under brystkassen. Så det er tilrådelig å starte med å se på disse stedene. Når organoiden er lokalisert, fjern den fra embryoet ved å kutte rundt den med mikrosaks.Plasser organoid i kyllingvevet som uunngåelig er festet til det i en petriskål under dissekeringsmikroskopet. Fjern så mye kyllingvev som mulig med et dobbeltkantet barberblad i rustfritt stål. Immunfluorescerende bilder av en ikke-transplantert nyreorganoid og en transplantert nyreorganoid inneholder begge glomerulære og rørformede strukturer.I de utransplanterte organoider er noen humane endotelceller tilstede. I den transplanterte organoiden er et perfusert vaskulært nettverk synlig gjennom hele organoiden. Forstørrede bilder av de boksede områdene demonstrerer de tre typer endotelceller som kan skilles i transplanterte organoider: perfuserte humane endotelceller, uperfuserte humane endotelceller og perfuserte kyllingavledede endotelceller.I utransplanterte organoider omgir endotelceller glomerulære strukturer, men invaderer dem ikke. I transplanterte organoider blir glomerulære strukturer imidlertid vaskularisert av perfuserte kapillærer. Transplanterte organoider kan analyseres ved hjelp av forskjellige teknikker avhengig av målet med forsøket.Direkte sammenligning med ikke-transplanterte kontroller kan gi innsikt i prosessen med vaskularisering og modning.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dobbel merking av nevrale kamceller og blodårer i kyllingembryoer ved hjelp av ChickGFP Neural Tube Grafting og Carbocyanine Dye DiI Injection

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Hele Retinal eksplantater fra kylling embryoer for Electroporation og kjemisk reagens behandlinger

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Teknikken til Target Mikroinjeksjon til utviklings<em&gt; Xenopus</em&gt; Nyre

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

En effektiv metode for å få dedifferensierte fettcellene

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

I Ovo Electroporation i Kylling Auditory Brainstem

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Sporing genuttrykk gjennom påvisning av β-galactosidase aktivitet i hele Mouse embryoer

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal Plate i Gastrulating Mouse embryoer skanning elektronmikroskop og hele Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Rask og effektiv uttrykk for flere proteiner i avian embryo bruke mRNA electroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

En forenklet metode for å generere nyreorganoider fra humane pluripotente stamceller

Kidney organoids generated from hPSCs have provided an unlimited source of renal tissue. Human kidney organoids are an invaluable tool for studying kidney ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

En enkel og effektiv transplantasjonsenhet for sebrafiskembryoer

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...