Name: efficient vascularization of kidney organoids through intracelomic transplantation in chicken embryos
Uploaded: 2023-02-17T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Vascularization of Kidney Organoids through Intracelomic Transplantation in Chicken Embryos at JoVE.com

Agradecemos a George Galaris (LUMC, Leiden, Holanda) por sua ajuda com a injeção de embrião de galinha. Agradecemos o apoio de Saskia van der Wal-Maas (Department of Anatomy &Embryology, LUMC, Leiden, Holanda), Conny van Munsteren (Department of Anatomy & Embryology, LUMC, Leiden, Holanda), Manon Zuurmond (LUMC, Leiden, Holanda) e Annemarie de Graaf (LUMC, Leiden, Holanda). M. Koning é apoiado por «Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC». Este trabalho foi em parte apoiado pelo Leiden University Fund "Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fund" GWF2019-02. Este trabalho é apoiado pelos parceiros da Regenerative Medicine Crossing Borders (RegMedXB) e Health Holland, Top Sector Life Sciences and Health. C.W. van den Berg e T.J. Rabelink são apoiados pelo Centro da Fundação Novo Nordisk para Medicina de Células-Tronco (reNEW), O Centro da Fundação Novo Nordisk para Medicina de Células-Tronco é apoiado por subsídios da Fundação Novo Nordisk (NNF21CC0073729).

De acordo com a legislação holandesa, a aprovação do comitê de bem-estar animal não era necessária para esta pesquisa.
1. Preparação de organoides renais derivados da hiPSC para transplante
<ol><li>Diferenciar hiPSCs de organoides renais utilizando o protocolo desenvolvido por Takasato et al.4,18,31. Cultura dos organoides seguindo este protocolo em pastilhas de cultura cel...

<ol>
	<li>Taguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+in+vivo+origin+of+metanephric+nephron+progenitors+enables+generation+of+complex+kidney+structures+from+pluripotent+stem+cells.">Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).</li><li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury.">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li><li>Kim, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-edited+human+kidney+organoids+reveal+mechanisms+of+disease+in+podocyte+development.">Gene-edited human kidney organoids reveal mechanisms of disease in podocyte development.</a> Stem Cells. 35 (12), 2366-2378 (2017).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Hale, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+organoid-derived+human+glomeruli+for+personalised+podocyte+disease+modelling+and+drug+screening.">3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening.</a> Nature Communications. 9 (1), 5167 (2018).</li><li>Vanslambrouck, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+metanephric+specification+to+functional+proximal+tubule+enables+toxicity+screening+and+infectious+disease+modelling+in+kidney+organoids.">Enhanced metanephric specification to functional proximal tubule enables toxicity screening and infectious disease modelling in kidney organoids.</a> Nature Communications. 13 (1), 5943 (2022).</li><li>Tanigawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+from+nephrotic+disease-derived+iPSCs+identify+impaired+NEPHRIN+localization+and+slit+diaphragm+formation+in+kidney+podocytes.">Organoids from nephrotic disease-derived iPSCs identify impaired NEPHRIN localization and slit diaphragm formation in kidney podocytes.</a> Stem Cell Reports. 11 (3), 727-740 (2018).</li><li>Forbes, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-iPSC-derived+kidney+organoids+show+functional+validation+of+a+ciliopathic+renal+phenotype+and+reveal+underlying+pathogenetic+mechanisms.">Patient-iPSC-derived kidney organoids show functional validation of a ciliopathic renal phenotype and reveal underlying pathogenetic mechanisms.</a> American Journal of Human Genetics. 102 (5), 816-831 (2018).</li><li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids.">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communications. 6, 8715 (2015).</li><li>Cruz, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cystogenesis+reveals+a+critical+role+of+microenvironment+in+human+polycystic+kidney+disease.">Organoid cystogenesis reveals a critical role of microenvironment in human polycystic kidney disease.</a> Nature Materials. 16 (11), 1112-1119 (2017).</li><li>Gupta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+injury+and+repair+in+kidney+organoids+reveals+that+homologous+recombination+governs+tubular+intrinsic+repair.">Modeling injury and repair in kidney organoids reveals that homologous recombination governs tubular intrinsic repair.</a> Science Translational Medicine. 14 (634), eabj4772 (2022).</li><li>Hiratsuka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid-on-a-chip+model+of+human+ARPKD+reveals+mechanosensing+pathomechanisms+for+drug+discovery.">Organoid-on-a-chip model of human ARPKD reveals mechanosensing pathomechanisms for drug discovery.</a> Scencei Advances. 8 (38), eabq0866 (2022).</li><li>Dorison, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+generated+using+an+allelic+series+of+NPHS2+point+variants+reveal+distinct+intracellular+podocin+mistrafficking.">Kidney organoids generated using an allelic series of NPHS2 point variants reveal distinct intracellular podocin mistrafficking.</a> Journal of the American Society of Nephrology. , (2022).</li><li>Eremina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular-specific+alterations+of+VEGF-A+expression+lead+to+distinct+congenital+and+acquired+renal+diseases.">Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases.</a> The Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).</li><li>Kitamoto, Y., Tokunaga, H., Tomita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+is+an+essential+molecule+for+mouse+kidney+development:+glomerulogenesis+and+nephrogenesis.">Vascular endothelial growth factor is an essential molecule for mouse kidney development: glomerulogenesis and nephrogenesis.</a> The Journal of Clinical Investigation. 99 (10), 2351-2357 (1997).</li><li>Sison, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+structure+and+function+require+paracrine,+not+autocrine,+VEGF-VEGFR-2+signaling.">Glomerular structure and function require paracrine, not autocrine, VEGF-VEGFR-2 signaling.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 21 (10), 1691-1701 (2010).</li><li>Ryan, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+deficiencies+in+renal+organoids+and+ex+vivo+kidney+organogenesis.">Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis.</a> Developmental Biology. 477, 98-116 (2021).</li><li>vanden Berg, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+subcapsular+transplantation+of+PSC-derived+kidney+organoids+induces+neo-vasculogenesis+and+significant+glomerular+and+tubular+maturation+in+vivo.">Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).</li><li>Sharmin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+podocytes+mature+into+vascularized+glomeruli+upon+experimental+transplantation.">Human induced pluripotent stem cell-derived podocytes mature into vascularized glomeruli upon experimental transplantation.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1778-1791 (2016).</li><li>Bantounas, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functioning+nephrons+by+implanting+human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+progenitors.">Generation of functioning nephrons by implanting human pluripotent stem cell-derived kidney progenitors.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 766-779 (2018).</li><li>vanden Berg, C. W., Koudijs, A., Ritsma, L., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+assessment+of+size-selective+glomerular+sieving+in+transplanted+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+organoids.">In vivo assessment of size-selective glomerular sieving in transplanted human induced pluripotent stem cell-derived kidney organoids.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 31 (5), 921-929 (2020).</li><li>Asai, R., Bressan, M., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avians+as+a+model+system+of+vascular+development.">Avians as a model system of vascular development.</a> Methods in Molecular Biology. 2206, 103-127 (2021).</li><li>Jankovic, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+capacity+of+the+chicken+embryo.+I.+Relationship+between+the+maturation+of+lymphoid+tissues+and+the+occurrence+of+cell-mediated+immunity+in+the+developing+chicken+embryo.">Immunological capacity of the chicken embryo. I. Relationship between the maturation of lymphoid tissues and the occurrence of cell-mediated immunity in the developing chicken embryo.</a> Immunology. 29 (3), 497-508 (1975).</li><li>Alkie, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+innate+immunity+in+chicken+embryos+and+newly+hatched+chicks:+a+disease+control+perspective.">Development of innate immunity in chicken embryos and newly hatched chicks: a disease control perspective.</a> Avian Pathology. 48 (4), 288-310 (2019).</li><li>Rawles, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+normal+embryonic+tissues.">Transplantation of normal embryonic tissues.</a> Annalls of the New York Academy of Sciences. 55 (2), 302-312 (1952).</li><li>Rawles, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+melanophores+from+embryonic+mouse+tissues+grown+in+the+coelom+of+chick+embryos.">The development of melanophores from embryonic mouse tissues grown in the coelom of chick embryos.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 26 (12), 673-680 (1940).</li><li>Garreta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+tuning+the+extracellular+environment+accelerates+the+derivation+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Materials. 18 (4), 397-405 (2019).</li><li>Koning, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculogenesis+in+kidney+organoids+upon+transplantation.">Vasculogenesis in kidney organoids upon transplantation.</a> NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 40 (2022).</li><li>Hamburger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenetic+and+axial+self-differentiation+of+transplanted+limb+primordia+of+2-day+chick+embryos.">Morphogenetic and axial self-differentiation of transplanted limb primordia of 2-day chick embryos.</a> Journal of Experimental Zoology. 77 (3), 379-399 (1938).</li><li>Dossel, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+of+intracelomic+grafting.">New method of intracelomic grafting.</a> Science. 120 (3111), 262-263 (1954).</li><li>Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).</li><li>Aleksandrowicz, E., Herr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethical+euthanasia+and+short-term+anesthesia+of+the+chick+embryo.">Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo.</a> ALTEX. 32 (2), 143-147 (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACUC.">ACUC.</a> Guideline: The Use and Euthanasia Procedures of Chicken/Avian Embryos. , (2012).</li></ol>

Neste manuscrito, um protocolo para transplante intracelomico de organoides renais derivados de hiPSC em embriões de galinha é demonstrado. Após o transplante, os organoides são vascularizados por vasos sanguíneos perfundidos que consistem em uma combinação de CE derivada de organoides humanos e de frango. Estes se espalham por todo o organoide e invadem as estruturas glomerulares, possibilitando a interação entre as CE e os podócitos. Foi demonstrado anteriormente que isso leva a uma maior maturação das estr...

Organoides renais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSC) têm demonstrado potencial para estudos de desenvolvimento 1,2,3,4, triagem de toxicidade 5,6 e modelagem de doenças5,7,8,9,10,11,12,13. Entretanto, sua aplicabilidade para esses e eventuais transplantes clínicos é limitada pela falta de uma rede vascular. Durante o desenvolvimento renal embrionário, podócitos, células mesangiais e células endoteliais vasculares (CEs) interagem para formar a intrincada estrutura do glomérulo. Sem essa interação, a barreira de filtração glomerular, composta por podócitos, membrana basal glomerular (MBG) e CE, não pode se desenvolver adequadamente14,15,16. Embora os organoides renais in vitro contenham algumas CE, estas não formam uma rede vascular adequada e diminuem com o passar do tempo17. Portanto, não é surpreendente que os organoides permaneçam imaturos. O transplante em camundongos induz vascularização e maturação dos organoides renais 18,19,20,21. Infelizmente, este é um processo trabalhoso que é inadequado para a análise de um grande número de organoides.
Embriões de galinha têm sido utilizados para estudar vascularização e desenvolvimento há mais de um século22. São de fácil acesso, requerem baixa manutenção, não possuem sistema imunológico totalmente funcional e podem desenvolver-se normalmente após a abertura da casca do ovo23,24,25,26. Demonstrou-se que o transplante de organoides em sua membrana corioalantóide (CAM) leva à vascularização27. No entanto, a duração do transplante na MAC, bem como o nível de maturação do enxerto, são limitados pela formação de CAM, que leva até o 7º dia embrionário para ser concluída. Portanto, recentemente foi desenvolvido um método para vascularizar eficientemente e amadurecer organoides renais através do transplante intracelomico em embriões degalinha28. A cavidade celômica de embriões de galinha é conhecida desde a década de 1930 como um ambiente favorável para a diferenciação de tecidos embrionários29,30. Pode ser acessado no início do desenvolvimento embrionário e permite a expansão relativamente ilimitada do enxerto em todas as direções.
Este trabalho descreve um protocolo para o transplante de organoides renais derivados de hiPSC na cavidade celômica de embriões de galinha do dia 4. Este método induz vascularização e maior maturação dos organoides em 8 dias. A injeção de aglutinina culinaris fluorescentemente marcada (LCA) antes do sacrifício dos embriões permite a visualização dos vasos sanguíneos perfundidos dentro dos organoides através da microscopia confocal.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>10462200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes&#160;</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>Contains silicone tubes, mouth piece and connector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHTC091-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHTC090-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope&#160;</td>
			<td>Wild Heerbrugg</td>
			<td>355110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHSB391-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-&#945;-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-212-02</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-&#945;-sheep Alexa Fluor 647</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21448</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edged stainless steel razor blades</td>
			<td>Electron Microsopy Sciences</td>
			<td>72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg cartons or custom made egg holders&#160;</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus)&#160;</td>
			<td>Drost Loosdrecht B.V.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Elbanton BV</td>
			<td>ET-3 combi</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>B-1325</td>
			<td>dilution 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHSB500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150F-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td>We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws.</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>L-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olivecrona dura dissector 18 cm&#160;</td>
			<td>Reda</td>
			<td>41146-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm&#160;</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HS234526B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated spoon&#160;</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>S-20-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 x 15 mm&#160;</td>
			<td>CELLSTAR</td>
			<td>628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipettes&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PP89SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified mouse anti-human CD31 antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555444</td>
			<td>dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>RL-1042</td>
			<td>This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-human NPHS1 antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>AF4269</td>
			<td>dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile hypodermic needles, 19 G</td>
			<td>BD microlance</td>
			<td>301500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Alexa Fluor 405</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S32351</td>
			<td>dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 5 mL</td>
			<td>BD Emerald</td>
			<td>307731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent tape&#160;</td>
			<td>Tesa</td>
			<td>4124</td>
			<td>Available at most hardware stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire, 0.25 mm dia&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>010404.H2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient vascularization of kidney organoids through intracelomic transplantation in chicken embryos

Os organoides renais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos contêm estruturas semelhantes a néfrons que se assemelham às do rim adulto até certo ponto. Infelizmente, sua aplicabilidade clínica é dificultada pela falta de uma vasculatura funcional e, consequentemente, maturação limitada in vitro. O transplante de organoides renais na cavidade celômica de embriões de galinha induz a vascularização por vasos sanguíneos perfundidos, incluindo a formação de capilares glomerulares, e aumenta sua maturação. Esta técnica é muito eficiente, permitindo o transplante e análise de um grande número de organoides. Este trabalho descreve um protocolo detalhado para o transplante intracelomico de organoides renais em embriões de galinha, seguido da injeção de lectina fluorescentemente marcada para coloração da vasculatura perfundida e da coleta de organoides transplantados para análise de imagem. Este método pode ser usado para induzir e estudar a vascularização e maturação de organoides para encontrar pistas para melhorar esses processos in vitro e melhorar a modelagem de doenças.

O método e o cronograma para diferenciação de hiPSCs em organoides renais, incubação de ovos de galinha fertilizados, transplante de organoides renais, injeção de ACV e coleta dos organoides estão resumidos na Figura 1A. É importante coordenar o momento da diferenciação organoide e incubação dos ovos de galinha, iniciando a diferenciação 15 dias antes da incubação. As ações nos dias 0, 3, 4 e 12 de incubação são ilustradas por fotografias abaixo da linha do tempo. Os o...

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Efficient Vascularization of Kidney Organoids through Intracelomic Transplantation in Chicken Embryos

Apresentamos aqui um protocolo detalhado para o transplante de organoides renais na cavidade celômica de embriões de galinha. Este método induz a vascularização e maior maturação dos organoides em 8 dias e pode ser usado para estudar esses processos de maneira eficiente.

Vascularização Eficiente de Organoides Renais através do Transplante Intracelomico em Embriões de Galinha

Kidney organoids derived from human induced pluripotent stem cells contain nephron-like structures that resemble those in the adult kidney to a certain ...

Os organoides renais cultivados in vitro permanecem imaturos, limitando sua aplicabilidade. E esse método de transplante intracelômico induz a vascularização e aumenta a maturação dos organoides. O procedimento é muito eficiente, permitindo o transplante e análise de grande número de organoides em um experimento.Depois de preparar organoides renais derivados do HISC e incubar os ovos fertilizados da leghorn, crie uma janela na casca do ovo no terceiro dia de incubação. Coloque um pequeno pedaço de fita transparente na ponta pontiaguda do ovo. Faça um pequeno orifício na casca do ovo no meio da fita transparente batendo com a ponta afiada de uma tesoura dissecante.Em seguida, insira uma agulha de calibre 19 em uma seringa de cinco mililitros no orifício em um ângulo de 45 graus. Aspirar dois a três mililitros de albumina do ovo para abaixar o embrião dentro do ovo. Esconda o orifício com um segundo pedaço de fita transparente e, em seguida, coloque um pedaço grande de fita transparente no lápis marcado para cima do lado virado para cima do ovo.Faça um buraco na casca do ovo no meio da fita transparente batendo com a ponta afiada de uma tesoura dissecante. Corte uma pequena janela circular na casca do ovo deste orifício usando uma tesoura de dissecação curva. Olhe através desta janela para localizar o embrião.Em seguida, amplie a janela para otimizar o acesso ao embrião. Remova todos os pedaços grandes de casca de ovo que possam ter caído em cima do embrião usando fórceps. Remova pedaços menores colocando algumas gotas de DPBS com cálcio e magnésio no embrião com uma pipeta de transferência plástica e, em seguida, aspirando o DPBS com a casca do ovo na pipeta.Usando uma pipeta de transferência de plástico, adicione três gotas de DPBS, suplementado com 0,5% de estreptomicina de penicilina ao ovo. Sele cuidadosamente a janela com um pedaço grande de fita transparente antes de colocar o ovo de volta na incubadora até o quarto dia de incubação. Corte a fita da janela com uma tesoura de dissecação curva.Coloque o ovo sob um microscópio dissecante em um suporte de borracha ou caixa de ovo. O embrião de galinha está agora na Etapa 23 a 24 de Hamburger-Hamilton e deitado do lado esquerdo com o lado direito voltado para o espectador. Localizar a asa direita e o broto da perna do embrião, pois o celoma será avaliado entre esses dois brotos de membros.Na área entre a asa direita e o broto da perna, crie uma abertura consecutivamente na membrana vitelina, no córion e no âmnio, segurando-os com dois pares de pinças dissecantes e puxando-os suavemente em direções opostas. Verifique se há acesso desobstruído à cavidade celômica. Segure suavemente a borda da parede do corpo entre a asa e o botão do membro com um par de pinças dissecantes e puxe-o levemente em direção ao espectador.A cavidade celômica deve ser claramente visível. Insira cuidadosamente um instrumento contundente, mas fino, na cavidade celômica. Coloque metade de um organoide dentro do ovo em cima do alantois usando uma dura-máter.Usando pinças dissecantes, segure cuidadosamente a borda da parede do corpo e puxe-a levemente em direção ao espectador para tornar visível a abertura para o coelum. Mova suavemente o organoide em direção e através da abertura na parede do corpo para o celo com um fio de tungstênio rombo e um suporte de microbisturi. Empurre o organoide ligeiramente cranialmente para aloja-lo dentro do coelum.Agora é visível logo atrás do botão da asa. Adicione três gotas de DPBS ao ovo usando uma pipeta de transferência de plástico. Sele cuidadosamente a janela com um pedaço grande de fita transparente antes de colocar o ovo de volta na incubadora até o 12º dia de incubação.Corte a fita da janela com uma tesoura de dissecação curva. Coloque o ovo sob um microscópio dissecante em um suporte de borracha. Avaliar a vasculatura e localizar as veias, que podem ser distinguidas das artérias por sua cor vermelha ligeiramente mais brilhante.Para melhorar o acesso à vasculatura, amplie cuidadosamente a janela, cortando-a com tesoura dissecante curva. Depois de selecionar a veia, insira a ponta da agulha microcapilar na veia em um ângulo de zero a 20 graus. Certifique-se de que a agulha está na veia, movendo suavemente a ponta de um lado para o outro.Sopre suave e firmemente no sistema de injeção para injetar a lente culinaris aglutinina. E coloque o ovo de volta na incubadora por 10 minutos para deixá-lo circular. Coloque o ovo em um suporte de borracha no banco.Em seguida, corte as membranas que envolvem o embrião com uma tesoura dissecante curva. Retire o embrião do ovo com uma colher perfurada e decapite imediatamente o embrião usando uma tesoura. Sob o microscópio de dissecção, coloque o corpo do embrião em uma placa de Petri.Coloque o embrião de costas na placa de Petri e espalhe os membros. Abra cuidadosamente a parede abdominal do embrião ao longo do eixo longitudinal usando pinças. Localize o organoide dentro do embrião.O organoide mais frequentemente fica aderido ao lobo hepático direito, seja na ponta da criança ou cranialmente, logo abaixo da caixa torácica. Então, é aconselhável começar olhando para esses locais. Uma vez localizado o organoide, retire-o do embrião cortando-o com micro tesoura.Coloque o organoide no tecido da galinha que está inevitavelmente ligado a ele em uma placa de Petri sob o microscópio dissecante. Remova o máximo possível de tecido de frango com uma lâmina de barbear de aço inoxidável de dois gumes. Imagens de imunofluorescência de um organoide renal não transplantado e de um organoide renal transplantado contêm estruturas glomerulares e tubulares.Nos organoides não transplantados, algumas células endoteliais humanas estão presentes. No organoide transplantado, uma rede vascular perfundida é visível em todo o organoide. Imagens ampliadas das áreas encaixotadas demonstram os três tipos de células endoteliais que podem ser distinguidas em organoides transplantados: células endoteliais humanas perfundidas, células endoteliais humanas não perfundidas e células endoteliais derivadas de frango perfundidas.Nos organoides não transplantados, as células endoteliais circundam as estruturas glomerulares, mas não as invadem. Entretanto, nos organoides transplantados, as estruturas glomerulares são vascularizadas por capilares perfundidos. Os organoides transplantados podem ser analisados por diferentes técnicas, dependendo do objetivo do experimento.A comparação direta com controles não transplantados pode fornecer informações sobre o processo de vascularização e maturação.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Rotulagem dupla de células de crista neural e vasos sanguíneos dentro de embriões de frango usando enxerto de tubo neural chickGFP e injeção de dii de corante de carbocyanina

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Biologia do Desenvolvimento

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Os explantes de retina inteiras de frango embriões para tratamentos de reagentes Eletroporação e Chemical

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Técnica ao Target microinjeção para o desenvolvimento<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

Um método eficiente para obter células de gordura desdiferenciado

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Em Ovo Electroporation no Brainstem Auditivo da Galinha

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Rastreamento de expressão gênica, através da detecção de atividade de β-galactosidase em embriões de rato inteiro

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualizando o nó e placa Notochordal em Gastrulating embriões de rato usando microscopia eletrônica e imunofluorescência de montagem inteira

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Expressão rápida e eficiente de múltiplas proteínas em embriões aviários usando o mRNA Electroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

Um método simplificado para gerar organoides renais a partir de células-tronco pluripotentes humanas

Kidney organoids generated from hPSCs have provided an unlimited source of renal tissue. Human kidney organoids are an invaluable tool for studying kidney ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Um dispositivo de transplante simples e eficaz para embriões de zebrafish

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...