Name: efficient vascularization of kidney organoids through intracelomic transplantation in chicken embryos
Uploaded: 2023-02-17T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Vascularization of Kidney Organoids through Intracelomic Transplantation in Chicken Embryos at JoVE.com

Мы благодарим Джорджа Галариса (LUMC, Лейден, Нидерланды) за помощь с инъекцией куриных эмбрионов. Мы выражаем благодарность за поддержку Саскии ван дер Валь-Маас (Департамент анатомии и эмбриологии, LUMC, Лейден, Нидерланды), Конни ван Мюнстерен (Департамент анатомии и эмбриологии, LUMC, Лейден, Нидерланды), Манон Зуурмонд (LUMC, Лейден, Нидерланды) и Аннемари де Грааф (LUMC, Лейден, Нидерланды). М. Конинг поддерживается 'Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC'. Эта работа была частично поддержана Фондом Лейденского университета «Фонд профессора Яапа де Граффа-Линглинга Виядханрмы» GWF2019-02. Эта работа поддерживается партнерами Regenerative Medicine Crossing Borders (RegMedXB) и Health Holland, Top Sector Life Sciences & Health. К.В. ван ден Берг и Т.Д. Рабелинк поддерживаются Центром медицины стволовых клеток Фонда Ново Нордиск (reNEW), Центр медицины стволовых клеток Фонда Ново Нордиск поддерживается грантами Фонда Ново Нордиск (NNF21CC0073729).

В соответствии с законодательством Нидерландов, для этого исследования не требовалось одобрения комитета по защите животных.
1. Подготовка органоидов почек, полученных из hiPSC, к трансплантации
<ol><li>Дифференцируйте ИПСК до органоидов почек с использованием про?...

<ol>
	<li>Taguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+in+vivo+origin+of+metanephric+nephron+progenitors+enables+generation+of+complex+kidney+structures+from+pluripotent+stem+cells.">Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).</li><li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury.">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li><li>Kim, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-edited+human+kidney+organoids+reveal+mechanisms+of+disease+in+podocyte+development.">Gene-edited human kidney organoids reveal mechanisms of disease in podocyte development.</a> Stem Cells. 35 (12), 2366-2378 (2017).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Hale, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+organoid-derived+human+glomeruli+for+personalised+podocyte+disease+modelling+and+drug+screening.">3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening.</a> Nature Communications. 9 (1), 5167 (2018).</li><li>Vanslambrouck, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+metanephric+specification+to+functional+proximal+tubule+enables+toxicity+screening+and+infectious+disease+modelling+in+kidney+organoids.">Enhanced metanephric specification to functional proximal tubule enables toxicity screening and infectious disease modelling in kidney organoids.</a> Nature Communications. 13 (1), 5943 (2022).</li><li>Tanigawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+from+nephrotic+disease-derived+iPSCs+identify+impaired+NEPHRIN+localization+and+slit+diaphragm+formation+in+kidney+podocytes.">Organoids from nephrotic disease-derived iPSCs identify impaired NEPHRIN localization and slit diaphragm formation in kidney podocytes.</a> Stem Cell Reports. 11 (3), 727-740 (2018).</li><li>Forbes, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-iPSC-derived+kidney+organoids+show+functional+validation+of+a+ciliopathic+renal+phenotype+and+reveal+underlying+pathogenetic+mechanisms.">Patient-iPSC-derived kidney organoids show functional validation of a ciliopathic renal phenotype and reveal underlying pathogenetic mechanisms.</a> American Journal of Human Genetics. 102 (5), 816-831 (2018).</li><li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids.">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communications. 6, 8715 (2015).</li><li>Cruz, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cystogenesis+reveals+a+critical+role+of+microenvironment+in+human+polycystic+kidney+disease.">Organoid cystogenesis reveals a critical role of microenvironment in human polycystic kidney disease.</a> Nature Materials. 16 (11), 1112-1119 (2017).</li><li>Gupta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+injury+and+repair+in+kidney+organoids+reveals+that+homologous+recombination+governs+tubular+intrinsic+repair.">Modeling injury and repair in kidney organoids reveals that homologous recombination governs tubular intrinsic repair.</a> Science Translational Medicine. 14 (634), eabj4772 (2022).</li><li>Hiratsuka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid-on-a-chip+model+of+human+ARPKD+reveals+mechanosensing+pathomechanisms+for+drug+discovery.">Organoid-on-a-chip model of human ARPKD reveals mechanosensing pathomechanisms for drug discovery.</a> Scencei Advances. 8 (38), eabq0866 (2022).</li><li>Dorison, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+generated+using+an+allelic+series+of+NPHS2+point+variants+reveal+distinct+intracellular+podocin+mistrafficking.">Kidney organoids generated using an allelic series of NPHS2 point variants reveal distinct intracellular podocin mistrafficking.</a> Journal of the American Society of Nephrology. , (2022).</li><li>Eremina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular-specific+alterations+of+VEGF-A+expression+lead+to+distinct+congenital+and+acquired+renal+diseases.">Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases.</a> The Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).</li><li>Kitamoto, Y., Tokunaga, H., Tomita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+is+an+essential+molecule+for+mouse+kidney+development:+glomerulogenesis+and+nephrogenesis.">Vascular endothelial growth factor is an essential molecule for mouse kidney development: glomerulogenesis and nephrogenesis.</a> The Journal of Clinical Investigation. 99 (10), 2351-2357 (1997).</li><li>Sison, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+structure+and+function+require+paracrine,+not+autocrine,+VEGF-VEGFR-2+signaling.">Glomerular structure and function require paracrine, not autocrine, VEGF-VEGFR-2 signaling.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 21 (10), 1691-1701 (2010).</li><li>Ryan, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+deficiencies+in+renal+organoids+and+ex+vivo+kidney+organogenesis.">Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis.</a> Developmental Biology. 477, 98-116 (2021).</li><li>vanden Berg, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+subcapsular+transplantation+of+PSC-derived+kidney+organoids+induces+neo-vasculogenesis+and+significant+glomerular+and+tubular+maturation+in+vivo.">Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).</li><li>Sharmin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+podocytes+mature+into+vascularized+glomeruli+upon+experimental+transplantation.">Human induced pluripotent stem cell-derived podocytes mature into vascularized glomeruli upon experimental transplantation.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1778-1791 (2016).</li><li>Bantounas, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functioning+nephrons+by+implanting+human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+progenitors.">Generation of functioning nephrons by implanting human pluripotent stem cell-derived kidney progenitors.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 766-779 (2018).</li><li>vanden Berg, C. W., Koudijs, A., Ritsma, L., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+assessment+of+size-selective+glomerular+sieving+in+transplanted+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+organoids.">In vivo assessment of size-selective glomerular sieving in transplanted human induced pluripotent stem cell-derived kidney organoids.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 31 (5), 921-929 (2020).</li><li>Asai, R., Bressan, M., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avians+as+a+model+system+of+vascular+development.">Avians as a model system of vascular development.</a> Methods in Molecular Biology. 2206, 103-127 (2021).</li><li>Jankovic, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+capacity+of+the+chicken+embryo.+I.+Relationship+between+the+maturation+of+lymphoid+tissues+and+the+occurrence+of+cell-mediated+immunity+in+the+developing+chicken+embryo.">Immunological capacity of the chicken embryo. I. Relationship between the maturation of lymphoid tissues and the occurrence of cell-mediated immunity in the developing chicken embryo.</a> Immunology. 29 (3), 497-508 (1975).</li><li>Alkie, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+innate+immunity+in+chicken+embryos+and+newly+hatched+chicks:+a+disease+control+perspective.">Development of innate immunity in chicken embryos and newly hatched chicks: a disease control perspective.</a> Avian Pathology. 48 (4), 288-310 (2019).</li><li>Rawles, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+normal+embryonic+tissues.">Transplantation of normal embryonic tissues.</a> Annalls of the New York Academy of Sciences. 55 (2), 302-312 (1952).</li><li>Rawles, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+melanophores+from+embryonic+mouse+tissues+grown+in+the+coelom+of+chick+embryos.">The development of melanophores from embryonic mouse tissues grown in the coelom of chick embryos.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 26 (12), 673-680 (1940).</li><li>Garreta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+tuning+the+extracellular+environment+accelerates+the+derivation+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Materials. 18 (4), 397-405 (2019).</li><li>Koning, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculogenesis+in+kidney+organoids+upon+transplantation.">Vasculogenesis in kidney organoids upon transplantation.</a> NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 40 (2022).</li><li>Hamburger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenetic+and+axial+self-differentiation+of+transplanted+limb+primordia+of+2-day+chick+embryos.">Morphogenetic and axial self-differentiation of transplanted limb primordia of 2-day chick embryos.</a> Journal of Experimental Zoology. 77 (3), 379-399 (1938).</li><li>Dossel, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+of+intracelomic+grafting.">New method of intracelomic grafting.</a> Science. 120 (3111), 262-263 (1954).</li><li>Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).</li><li>Aleksandrowicz, E., Herr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethical+euthanasia+and+short-term+anesthesia+of+the+chick+embryo.">Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo.</a> ALTEX. 32 (2), 143-147 (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACUC.">ACUC.</a> Guideline: The Use and Euthanasia Procedures of Chicken/Avian Embryos. , (2012).</li></ol>

В этой рукописи демонстрируется протокол интрасиломической трансплантации органоидов почек, полученных из hiPSC, у куриных эмбрионов. При трансплантации органоиды васкуляризируются перфузированными кровеносными сосудами, которые состоят из комбинации ЭК, полученных из органоидов чел...

Было показано, что индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (hiPSC), полученные из органоидов почек, обладают потенциалом для исследований развития 1,2,3,4, скрининга токсичности 5,6 и моделирования заболеваний5,7,8,9,10,11,12,13. Однако их применимость для этих и возможных клинических целей трансплантации ограничена отсутствием сосудистой сети. Во время эмбрионального развития почек подоциты, мезангиальные клетки и эндотелиальные клетки сосудов (ЭК) взаимодействуют, образуя сложную структуру клубочка. Без этого взаимодействия клубочковый фильтрационный барьер, состоящий из подоцитов, клубочковой базальной мембраны (GBM) и ECs, не может нормально развиваться14,15,16. Хотя органоиды почек in vitro содержат некоторые ЭК, они не образуют надлежащую сосудистую сеть и со временемуменьшаются 17. Поэтому неудивительно, что органоиды остаются незрелыми. Трансплантация мышам индуцирует васкуляризацию и созревание органоидов почек 18,19,20,21. К сожалению, это трудоемкий процесс, который не подходит для анализа большого количества органоидов.
Куриные эмбрионы используются для изучения васкуляризации и развития уже болеевека 22. Они легко доступны, требуют минимального ухода, не имеют полностью функциональной иммунной системы и могут нормально развиваться после вскрытия яичной скорлупы23,24,25,26. Было показано, что трансплантация органоидов на их хориоаллантоисную мембрану (CAM) приводит к васкуляризации27. Однако продолжительность трансплантации на CAM, а также уровень созревания трансплантата ограничены образованием CAM, которое завершается до 7-го эмбрионального дня. Поэтому недавно был разработан метод эффективной васкуляризации и созревания органоидов почек посредством интрасиломической трансплантации куриным эмбрионам28. С 1930-х годов известно, что целомическая полость куриных эмбрионов является благоприятной средой для дифференцировки эмбриональных тканей29,30. Он может быть доступен на ранних стадиях эмбрионального развития и позволяет относительно неограниченно расширять трансплантат во всех направлениях.
В этой статье изложен протокол трансплантации органоидов почек, полученных из hiPSC, в поломическую полость куриных эмбрионов 4-го дня. Этот метод индуцирует васкуляризацию и усиленное созревание органоидов в течение 8 дней. Инъекция флуоресцентно меченного хрусталика culinaris agglutinin (LCA) перед принесением эмбрионов в жертву позволяет визуализировать перфузированные кровеносные сосуды в органоидах с помощью конфокальной микроскопии.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>10462200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes&#160;</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>Contains silicone tubes, mouth piece and connector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHTC091-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHTC090-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope&#160;</td>
			<td>Wild Heerbrugg</td>
			<td>355110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHSB391-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-&#945;-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-212-02</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-&#945;-sheep Alexa Fluor 647</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21448</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edged stainless steel razor blades</td>
			<td>Electron Microsopy Sciences</td>
			<td>72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg cartons or custom made egg holders&#160;</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus)&#160;</td>
			<td>Drost Loosdrecht B.V.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Elbanton BV</td>
			<td>ET-3 combi</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>B-1325</td>
			<td>dilution 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHSB500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150F-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td>We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws.</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>L-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olivecrona dura dissector 18 cm&#160;</td>
			<td>Reda</td>
			<td>41146-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm&#160;</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HS234526B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated spoon&#160;</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>S-20-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 x 15 mm&#160;</td>
			<td>CELLSTAR</td>
			<td>628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipettes&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PP89SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified mouse anti-human CD31 antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555444</td>
			<td>dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>RL-1042</td>
			<td>This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-human NPHS1 antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>AF4269</td>
			<td>dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile hypodermic needles, 19 G</td>
			<td>BD microlance</td>
			<td>301500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Alexa Fluor 405</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S32351</td>
			<td>dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 5 mL</td>
			<td>BD Emerald</td>
			<td>307731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent tape&#160;</td>
			<td>Tesa</td>
			<td>4124</td>
			<td>Available at most hardware stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire, 0.25 mm dia&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>010404.H2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient vascularization of kidney organoids through intracelomic transplantation in chicken embryos

Органоиды почек, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, содержат нефроноподобные структуры, которые в определенной степени напоминают таковые во взрослой почке. К сожалению, их клиническая применимость затруднена отсутствием функциональной сосудистой сети и, следовательно, ограниченным созреванием in vitro. Трансплантация органоидов почек в хеломическую полость куриных эмбрионов индуцирует васкуляризацию перфузированными кровеносными сосудами, в том числе образование клубочковых капилляров, и усиливает их созревание. Этот метод очень эффективен, позволяя проводить трансплантацию и анализ большого количества органоидов. В этой статье описывается подробный протокол интрацеломической трансплантации органоидов почек у куриных эмбрионов с последующей инъекцией флуоресцентно меченного лектина для окрашивания перфузированной сосудистой сети и сбора трансплантированных органоидов для анализа изображений. Этот метод может быть использован для индукции и изучения васкуляризации и созревания органоидов, чтобы найти ключи к усилению этих процессов in vitro и улучшить моделирование заболеваний.

Метод и сроки дифференциации hiPSC в органоиды почек, инкубации оплодотворенных куриных яиц, трансплантации органоидов почек, инъекции LCA и сбора органоидов обобщены на рисунке 1A. Важно согласовывать сроки дифференцировки органоидов и инкубации куриных яиц, начиная дифф?...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Vascularization of Kidney Organoids through Intracelomic Transplantation in Chicken Embryos at JoVE.com

Efficient Vascularization of Kidney Organoids through Intracelomic Transplantation in Chicken Embryos

Здесь мы представляем подробный протокол трансплантации органоидов почек в поломическую полость куриных эмбрионов. Этот метод индуцирует васкуляризацию и ускоренное созревание органоидов в течение 8 дней и может быть использован для эффективного изучения этих процессов.

Эффективная васкуляризация органоидов почек путем интраселомной трансплантации куриным эмбрионам

Kidney organoids derived from human induced pluripotent stem cells contain nephron-like structures that resemble those in the adult kidney to a certain ...

Органоиды почек, культивируемые in vitro, остаются незрелыми, что ограничивает их применимость. А этот метод интрацеломической трансплантации индуцирует васкуляризацию и усиливает созревание органоидов. Процедура очень эффективна, позволяя проводить трансплантацию и анализ большого количества органоидов в одном эксперименте.После подготовки органоидов почек, полученных из HIPSC, и инкубации оплодотворенные яйца леггорна создают окно в яичной скорлупе на третий день инкубации. Поместите небольшой кусочек прозрачной ленты на заостренный кончик яйца. Сделайте небольшое отверстие в яичной скорлупе посередине прозрачной ленты, постукивая по ней острым концом рассекающих ножниц.Далее вставьте иглу 19-го калибра на пятимиллилитровом шприце в отверстие под углом 45 градусов. Аспирируйте два-три миллилитра альбумина из яйцеклетки, чтобы опустить эмбрион внутрь яйцеклетки. Скройте отверстие вторым куском прозрачной ленты, затем поместите большой кусок прозрачной ленты на карандаш, отмеченный вверх стороной яйца.Сделайте отверстие в яичной скорлупе посередине прозрачной ленты, постучав по ней острым концом рассекающих ножниц. Вырежьте из этого отверстия небольшое круглое окошко в яичной скорлупе с помощью изогнутых рассекающих ножниц. Посмотрите в это окно, чтобы найти эмбрион.Затем увеличьте окно, чтобы оптимизировать доступ к эмбриону. Удалите все большие куски яичной скорлупы, которые могли упасть на эмбрион, с помощью щипцов. Удалите более мелкие кусочки, поместив несколько капель DPBS с кальцием и магнием на эмбрион с помощью пластиковой пипетки для переноса, а затем аспирировав DPBS с яичной скорлупой в пипетку.С помощью пластиковой пипетки для переноса добавьте в яйцеклетку три капли DPBS, дополненного 0,5% пенициллиновым стрептомицином. Тщательно закройте окно большим куском прозрачной ленты, прежде чем поместить яйцо обратно в инкубатор до четвертого дня инкубации. Отрежьте ленту от окна изогнутыми рассекающими ножницами.Поместите яйцо под препарирующий микроскоп на резиновый держатель или картонную коробку для яиц. Куриный эмбрион сейчас находится на стадии Гамбургера-Гамильтона с 23 по 24 и лежит на левом боку, а правый бок обращен к зрителю. Найдите правую почку крыла и ноги эмбриона, так как целома будет оцениваться между этими двумя почками конечностей.В области между правым крылом и почкой ноги последовательно создайте отверстие в вителлинной мембране, хорионе и амнионе, удерживая их двумя парами рассекающих щипцов и осторожно потянув их в противоположных направлениях. Проверьте, есть ли беспрепятственный доступ к целомической полости. Аккуратно возьмитесь за край стенки тела между почкой крыла и лимба парой рассекающих щипцов и слегка потяните его к зрителю.Целомическая полость должна быть хорошо видна. Осторожно вставьте тупой, но тонкий инструмент в целомическую полость. Поместите половину органоида внутрь яйца поверх аллантоиса с помощью диссектора твердой мозговой оболочки.С помощью рассекающих щипцов осторожно возьмитесь за край стенки тела и слегка потяните его к зрителю, чтобы было видно отверстие в целом. Осторожно переместите органоид к отверстию в стенке тела и через него в целомум с помощью тупой вольфрамовой проволоки и держателя микроскальпеля. Слегка подтолкните органоид к черепу, чтобы поместить его внутрь целяка.Теперь он виден сразу за почкой крыла. Добавьте три капли DPBS в яйцо с помощью пластиковой пипетки для переноса. Тщательно закройте окно большим куском прозрачной ленты, прежде чем поместить яйцо обратно в инкубатор до 12 дня инкубации.Отрежьте ленту от окна изогнутыми рассекающими ножницами. Поместите яйцо под препарирующий микроскоп в резиновый держатель. Оцените сосудистую сеть и найдите вены, которые можно отличить от артерий по их немного более яркому красному цвету.Чтобы улучшить доступ к сосудистой сети, аккуратно увеличьте окно, разрезав его изогнутыми рассекающими ножницами. Выбрав вену, вставьте кончик иглы микрокапилляра в вену под углом от нуля до 20 градусов. Убедитесь, что игла находится в вене, осторожно перемещая кончик из стороны в сторону.Осторожно и неуклонно подуйте в систему впрыска, чтобы ввести в линзу culinaris агглютинин. И поместите яйцо обратно в инкубатор на 10 минут, чтобы оно циркулировало. Поместите яйцо в резиновый держатель на скамейке.Затем прорежьте мембраны, окружающие эмбрион, изогнутыми препарирующими ножницами. Зачерпните эмбрион из яйца перфорированной ложкой и сразу же обезглавьте эмбрион с помощью ножниц. Под диссекционным микроскопом поместите тело эмбриона в чашку Петри.Поместите эмбрион на спину в чашку Петри и раздвиньте конечности. Аккуратно вскрывают брюшную стенку эмбриона по продольной оси с помощью щипцов. Найдите органоид внутри зародыша.Органоид чаще всего прикрепляется к правой доле печени, либо на кончике лапки, либо краниально, чуть ниже грудной клетки. Итак, желательно начать с просмотра этих мест. Как только органоид будет найден, удалите его из эмбриона, разрезав его микроножницами.Поместите органоид в куриную ткань, которая неизбежно прикрепляется к ней, в чашку Петри под препарирующим микроскопом. Удалите как можно больше куриной ткани с помощью обоюдоострого бритвенного лезвия из нержавеющей стали. Иммунофлуоресцентные изображения нетрансплантированного органоида почки и трансплантированного органоида почки содержат клубочковые и канальцевые структуры.В нетрансплантированных органоидах присутствуют некоторые эндотелиальные клетки человека. В пересаженном органоиде перфузированная сосудистая сеть видна по всему органоиду. Увеличенные изображения коробчатых областей демонстрируют три типа эндотелиальных клеток, которые можно различить в трансплантированных органоидах: перфузированные эндотелиальные клетки человека, неперфузированные эндотелиальные клетки человека и перфузированные эндотелиальные клетки, полученные из курицы.В нетрансплантированных органоидах эндотелиальные клетки окружают клубочковые структуры, но не вторгаются в них. Однако в трансплантированных органоидах клубочковые структуры васкуляризируются перфузированными капиллярами. Трансплантированные органоиды могут быть проанализированы с использованием различных методов в зависимости от цели эксперимента.Прямое сравнение с нетрансплантированными контрольными группами может дать представление о процессе васкуляризации и созревания.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Двойная маркировка нервных клеток Креста и кровеносных сосудов в куриных эмбрионах сиспользованием Чик GFP нейронной трубки прививки и карбоцианина красителя DiI инъекции

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Целые сетчатки Экспланты из куриных эмбрионах для обработок Электропорация и химического реагента

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Методика Целевой показатель микроинъекции к проявляющему<em&gt; Xenopus</em&gt; почки

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

Эффективный метод получения Дедифференцированные жировых клеток

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

В Ово Электропорация в курином слуховом мозге

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Трассировка экспрессии генов путем обнаружения активности β-галактозидазы в целом мыши эмбрионов

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Визуализация узлов и Notochordal пластины в Gastrulating эмбрионов мыши, используя растровая электронная микроскопия и вся гора иммунофлуоресценции

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Быстрое и эффективное выражение нескольких белков в птичьих эмбрионах с использованием мРНК Электропорации

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

Упрощенный метод получения органоидов почек из плюрипотентных стволовых клеток человека

Kidney organoids generated from hPSCs have provided an unlimited source of renal tissue. Human kidney organoids are an invaluable tool for studying kidney ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Простое и эффективное устройство для трансплантации эмбрионов рыбок данио

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...