Name: efficient vascularization of kidney organoids through intracelomic transplantation in chicken embryos
Uploaded: 2023-02-17T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Vascularization of Kidney Organoids through Intracelomic Transplantation in Chicken Embryos at JoVE.com

Agradecemos a George Galaris (LUMC, Leiden, Países Bajos) por su ayuda con la inyección de embriones de pollo. Reconocemos el apoyo de Saskia van der Wal-Maas (Departamento de Anatomía y Embriología, LUMC, Leiden, Países Bajos), Conny van Munsteren (Departamento de Anatomía y Embriología, LUMC, Leiden, Países Bajos), Manon Zuurmond (LUMC, Leiden, Países Bajos) y Annemarie de Graaf (LUMC, Leiden, Países Bajos). M. Koning cuenta con el apoyo de «Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC». Este trabajo fue apoyado en parte por el Fondo de la Universidad de Leiden "Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fund" GWF2019-02. Este trabajo cuenta con el apoyo de los socios de Regenerative Medicine Crossing Borders (RegMedXB) y Health Holland, Top Sector Life Sciences & Health. C.W. van den Berg y T.J. Rabelink cuentan con el apoyo del Centro de Medicina de Células Madre de la Fundación Novo Nordisk (reNEW), el Centro de Medicina con Células Madre de la Fundación Novo Nordisk cuenta con el apoyo de subvenciones de la Fundación Novo Nordisk (NNF21CC0073729).

De acuerdo con la ley holandesa, no se requería la aprobación del comité de bienestar animal para esta investigación.
1. Preparación de organoides renales derivados de hiPSC para trasplante
<ol><li>Diferenciar las hiPSCs a los organoides renales utilizando el protocolo desarrollado por Takasato et al.4,18,31. Cultivar los organoides siguiendo este protocolo en insertos de culti...

<ol>
	<li>Taguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+in+vivo+origin+of+metanephric+nephron+progenitors+enables+generation+of+complex+kidney+structures+from+pluripotent+stem+cells.">Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).</li><li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury.">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li><li>Kim, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-edited+human+kidney+organoids+reveal+mechanisms+of+disease+in+podocyte+development.">Gene-edited human kidney organoids reveal mechanisms of disease in podocyte development.</a> Stem Cells. 35 (12), 2366-2378 (2017).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Hale, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+organoid-derived+human+glomeruli+for+personalised+podocyte+disease+modelling+and+drug+screening.">3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening.</a> Nature Communications. 9 (1), 5167 (2018).</li><li>Vanslambrouck, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+metanephric+specification+to+functional+proximal+tubule+enables+toxicity+screening+and+infectious+disease+modelling+in+kidney+organoids.">Enhanced metanephric specification to functional proximal tubule enables toxicity screening and infectious disease modelling in kidney organoids.</a> Nature Communications. 13 (1), 5943 (2022).</li><li>Tanigawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+from+nephrotic+disease-derived+iPSCs+identify+impaired+NEPHRIN+localization+and+slit+diaphragm+formation+in+kidney+podocytes.">Organoids from nephrotic disease-derived iPSCs identify impaired NEPHRIN localization and slit diaphragm formation in kidney podocytes.</a> Stem Cell Reports. 11 (3), 727-740 (2018).</li><li>Forbes, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-iPSC-derived+kidney+organoids+show+functional+validation+of+a+ciliopathic+renal+phenotype+and+reveal+underlying+pathogenetic+mechanisms.">Patient-iPSC-derived kidney organoids show functional validation of a ciliopathic renal phenotype and reveal underlying pathogenetic mechanisms.</a> American Journal of Human Genetics. 102 (5), 816-831 (2018).</li><li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids.">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communications. 6, 8715 (2015).</li><li>Cruz, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cystogenesis+reveals+a+critical+role+of+microenvironment+in+human+polycystic+kidney+disease.">Organoid cystogenesis reveals a critical role of microenvironment in human polycystic kidney disease.</a> Nature Materials. 16 (11), 1112-1119 (2017).</li><li>Gupta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+injury+and+repair+in+kidney+organoids+reveals+that+homologous+recombination+governs+tubular+intrinsic+repair.">Modeling injury and repair in kidney organoids reveals that homologous recombination governs tubular intrinsic repair.</a> Science Translational Medicine. 14 (634), eabj4772 (2022).</li><li>Hiratsuka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid-on-a-chip+model+of+human+ARPKD+reveals+mechanosensing+pathomechanisms+for+drug+discovery.">Organoid-on-a-chip model of human ARPKD reveals mechanosensing pathomechanisms for drug discovery.</a> Scencei Advances. 8 (38), eabq0866 (2022).</li><li>Dorison, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+generated+using+an+allelic+series+of+NPHS2+point+variants+reveal+distinct+intracellular+podocin+mistrafficking.">Kidney organoids generated using an allelic series of NPHS2 point variants reveal distinct intracellular podocin mistrafficking.</a> Journal of the American Society of Nephrology. , (2022).</li><li>Eremina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular-specific+alterations+of+VEGF-A+expression+lead+to+distinct+congenital+and+acquired+renal+diseases.">Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases.</a> The Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).</li><li>Kitamoto, Y., Tokunaga, H., Tomita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+is+an+essential+molecule+for+mouse+kidney+development:+glomerulogenesis+and+nephrogenesis.">Vascular endothelial growth factor is an essential molecule for mouse kidney development: glomerulogenesis and nephrogenesis.</a> The Journal of Clinical Investigation. 99 (10), 2351-2357 (1997).</li><li>Sison, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+structure+and+function+require+paracrine,+not+autocrine,+VEGF-VEGFR-2+signaling.">Glomerular structure and function require paracrine, not autocrine, VEGF-VEGFR-2 signaling.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 21 (10), 1691-1701 (2010).</li><li>Ryan, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+deficiencies+in+renal+organoids+and+ex+vivo+kidney+organogenesis.">Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis.</a> Developmental Biology. 477, 98-116 (2021).</li><li>vanden Berg, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+subcapsular+transplantation+of+PSC-derived+kidney+organoids+induces+neo-vasculogenesis+and+significant+glomerular+and+tubular+maturation+in+vivo.">Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).</li><li>Sharmin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+podocytes+mature+into+vascularized+glomeruli+upon+experimental+transplantation.">Human induced pluripotent stem cell-derived podocytes mature into vascularized glomeruli upon experimental transplantation.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1778-1791 (2016).</li><li>Bantounas, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functioning+nephrons+by+implanting+human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+progenitors.">Generation of functioning nephrons by implanting human pluripotent stem cell-derived kidney progenitors.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 766-779 (2018).</li><li>vanden Berg, C. W., Koudijs, A., Ritsma, L., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+assessment+of+size-selective+glomerular+sieving+in+transplanted+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+organoids.">In vivo assessment of size-selective glomerular sieving in transplanted human induced pluripotent stem cell-derived kidney organoids.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 31 (5), 921-929 (2020).</li><li>Asai, R., Bressan, M., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avians+as+a+model+system+of+vascular+development.">Avians as a model system of vascular development.</a> Methods in Molecular Biology. 2206, 103-127 (2021).</li><li>Jankovic, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+capacity+of+the+chicken+embryo.+I.+Relationship+between+the+maturation+of+lymphoid+tissues+and+the+occurrence+of+cell-mediated+immunity+in+the+developing+chicken+embryo.">Immunological capacity of the chicken embryo. I. Relationship between the maturation of lymphoid tissues and the occurrence of cell-mediated immunity in the developing chicken embryo.</a> Immunology. 29 (3), 497-508 (1975).</li><li>Alkie, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+innate+immunity+in+chicken+embryos+and+newly+hatched+chicks:+a+disease+control+perspective.">Development of innate immunity in chicken embryos and newly hatched chicks: a disease control perspective.</a> Avian Pathology. 48 (4), 288-310 (2019).</li><li>Rawles, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+normal+embryonic+tissues.">Transplantation of normal embryonic tissues.</a> Annalls of the New York Academy of Sciences. 55 (2), 302-312 (1952).</li><li>Rawles, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+melanophores+from+embryonic+mouse+tissues+grown+in+the+coelom+of+chick+embryos.">The development of melanophores from embryonic mouse tissues grown in the coelom of chick embryos.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 26 (12), 673-680 (1940).</li><li>Garreta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+tuning+the+extracellular+environment+accelerates+the+derivation+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Materials. 18 (4), 397-405 (2019).</li><li>Koning, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculogenesis+in+kidney+organoids+upon+transplantation.">Vasculogenesis in kidney organoids upon transplantation.</a> NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 40 (2022).</li><li>Hamburger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenetic+and+axial+self-differentiation+of+transplanted+limb+primordia+of+2-day+chick+embryos.">Morphogenetic and axial self-differentiation of transplanted limb primordia of 2-day chick embryos.</a> Journal of Experimental Zoology. 77 (3), 379-399 (1938).</li><li>Dossel, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+of+intracelomic+grafting.">New method of intracelomic grafting.</a> Science. 120 (3111), 262-263 (1954).</li><li>Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).</li><li>Aleksandrowicz, E., Herr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethical+euthanasia+and+short-term+anesthesia+of+the+chick+embryo.">Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo.</a> ALTEX. 32 (2), 143-147 (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACUC.">ACUC.</a> Guideline: The Use and Euthanasia Procedures of Chicken/Avian Embryos. , (2012).</li></ol>

En este manuscrito, se demuestra un protocolo para el trasplante intracelomico de organoides renales derivados de hiPSC en embriones de pollo. Tras el trasplante, los organoides son vascularizados por vasos sanguíneos perfundidos que consisten en una combinación de CE derivadas de organoides humanos y derivados de pollos. Estos se extienden por todo el organoide e invaden las estructuras glomerulares, permitiendo la interacción entre los CE y los podocitos. Anteriormente se demostró que esto conduce a una mayor madur...

Se ha demostrado que los organoides renales derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) tienen potencial para estudios de desarrollo 1,2,3,4, detección de toxicidad 5,6 y modelado de enfermedades5,7,8,9,10,11,12,13. Sin embargo, su aplicabilidad para estos y eventuales propósitos de trasplante clínico está limitada por la falta de una red vascular. Durante el desarrollo del riñón embrionario, los podocitos, las células mesangiales y las células endoteliales vasculares (CE) interactúan para formar la intrincada estructura del glomérulo. Sin esta interacción, la barrera de filtración glomerular, constituida por podocitos, la membrana basal glomerular (GBM) y las CE, no puede desarrollarse adecuadamente14,15,16. Aunque los organoides renales in vitro contienen algunos CE, estos no logran formar una red vascular adecuada y disminuyen con el tiempo17. Por lo tanto, no es sorprendente que los organoides permanezcan inmaduros. El trasplante en ratones induce vascularización y maduración de los organoides renales 18,19,20,21. Desafortunadamente, este es un proceso laborioso que no es adecuado para el análisis de un gran número de organoides.
Los embriones de pollo se han utilizado para estudiar la vascularización y el desarrollo durante más de un siglo22. Son de fácil acceso, requieren poco mantenimiento, carecen de un sistema inmunológico completamente funcional y pueden desarrollarse normalmente después de abrir la cáscara del huevo23,24,25,26. El trasplante de organoides en su membrana corioalantoidea (CAM) ha demostrado conducir a la vascularización27. Sin embargo, la duración del trasplante en el CAM, así como el nivel de maduración del injerto, están limitados por la formación de CAM, que tarda hasta el día 7 embrionario en completarse. Por lo tanto, recientemente se desarrolló un método para vascularizar eficientemente y madurar organoides renales a través del trasplante intracelómico en embriones de pollo28. La cavidad celómica de los embriones de pollo ha sido conocida desde la década de 1930 por ser un ambiente favorable para la diferenciación de tejidos embrionarios29,30. Se puede acceder a él temprano en el desarrollo embrionario y permite una expansión relativamente ilimitada del injerto en todas las direcciones.
Este documento describe un protocolo para el trasplante de organoides renales derivados de hiPSC en la cavidad celómica de embriones de pollo del día 4. Este método induce la vascularización y la maduración mejorada de los organoides en 8 días. La inyección de aglutinina culinaris (LCA) de lente marcada con fluorescencia antes de sacrificar los embriones permite la visualización de los vasos sanguíneos perfundidos dentro de los organoides a través de microscopía confocal.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>10462200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes&#160;</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>Contains silicone tubes, mouth piece and connector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHTC091-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHTC090-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope&#160;</td>
			<td>Wild Heerbrugg</td>
			<td>355110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHSB391-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-&#945;-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-212-02</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-&#945;-sheep Alexa Fluor 647</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21448</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edged stainless steel razor blades</td>
			<td>Electron Microsopy Sciences</td>
			<td>72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg cartons or custom made egg holders&#160;</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus)&#160;</td>
			<td>Drost Loosdrecht B.V.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Elbanton BV</td>
			<td>ET-3 combi</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>B-1325</td>
			<td>dilution 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHSB500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150F-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td>We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws.</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>L-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olivecrona dura dissector 18 cm&#160;</td>
			<td>Reda</td>
			<td>41146-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm&#160;</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HS234526B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated spoon&#160;</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>S-20-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 x 15 mm&#160;</td>
			<td>CELLSTAR</td>
			<td>628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipettes&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PP89SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified mouse anti-human CD31 antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555444</td>
			<td>dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>RL-1042</td>
			<td>This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-human NPHS1 antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>AF4269</td>
			<td>dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile hypodermic needles, 19 G</td>
			<td>BD microlance</td>
			<td>301500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Alexa Fluor 405</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S32351</td>
			<td>dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 5 mL</td>
			<td>BD Emerald</td>
			<td>307731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent tape&#160;</td>
			<td>Tesa</td>
			<td>4124</td>
			<td>Available at most hardware stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire, 0.25 mm dia&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>010404.H2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient vascularization of kidney organoids through intracelomic transplantation in chicken embryos

Los organoides renales derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos contienen estructuras similares a las nefronas que se asemejan a las del riñón adulto hasta cierto punto. Desafortunadamente, su aplicabilidad clínica se ve obstaculizada por la falta de una vasculatura funcional y, en consecuencia, una maduración limitada in vitro. El trasplante de organoides renales en la cavidad celómica de embriones de pollo induce la vascularización por vasos sanguíneos perfundidos, incluida la formación de capilares glomerulares, y mejora su maduración. Esta técnica es muy eficiente, permitiendo el trasplante y análisis de un gran número de organoides. Este artículo describe un protocolo detallado para el trasplante intracelomico de organoides renales en embriones de pollo, seguido de la inyección de lectina marcada con fluorescencia para teñir la vasculatura perfundida y la recolección de organoides trasplantados para el análisis de imágenes. Este método se puede utilizar para inducir y estudiar la vascularización y maduración de organoides para encontrar pistas para mejorar estos procesos in vitro y mejorar el modelado de enfermedades.

El método y la línea de tiempo para la diferenciación de hiPSCs a organoides renales, la incubación de huevos de gallina fertilizados, el trasplante de organoides renales, la inyección de LCA y la recolección de los organoides se resumen en la Figura 1A. Es importante coordinar el momento de la diferenciación de organoides y la incubación del huevo de gallina, comenzando la diferenciación 15 días antes de la incubación. Las acciones en los días 0, 3, 4 y 12 de incubación se ilu...

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Efficient Vascularization of Kidney Organoids through Intracelomic Transplantation in Chicken Embryos

Aquí, presentamos un protocolo detallado para el trasplante de organoides renales en la cavidad celómica de embriones de pollo. Este método induce la vascularización y la maduración mejorada de los organoides en 8 días y se puede utilizar para estudiar estos procesos de manera eficiente.

Vascularización eficiente de organoides renales mediante trasplante intracelomico en embriones de pollo

Kidney organoids derived from human induced pluripotent stem cells contain nephron-like structures that resemble those in the adult kidney to a certain ...

Los organoides renales cultivados in vitro permanecen inmaduros, lo que limita su aplicabilidad. Y este método de trasplante intracelómico induce la vascularización y mejora la maduración de los organoides. El procedimiento es muy eficiente, lo que permite el trasplante y análisis de un gran número de organoides en un solo experimento.Después de preparar organoides renales derivados de HIPSC e incubar los huevos fertilizados de leghorn, cree una ventana en la cáscara del huevo en el tercer día de incubación. Coloque un pequeño trozo de cinta transparente en la punta puntiaguda del huevo. Haga un pequeño agujero en la cáscara del huevo en el medio de la cinta transparente golpeándola con el extremo afilado de un par de tijeras de disección.Luego, inserte una aguja de calibre 19 en una jeringa de cinco mililitros en el orificio en un ángulo de 45 grados. Aspire de dos a tres mililitros de albúmina del huevo para bajar el embrión dentro del huevo. Oculte el agujero con un segundo trozo de cinta transparente, luego coloque un trozo grande de cinta transparente en el lápiz marcado hacia arriba mirando hacia el lado del huevo.Haga un agujero en la cáscara del huevo en el medio de la cinta transparente golpeándola con el extremo afilado de un par de tijeras de disección. Corta una pequeña ventana circular en la cáscara del huevo de este agujero usando tijeras curvas de disección. Mire a través de esta ventana para localizar el embrión.Luego, amplíe la ventana para optimizar el acceso al embrión. Retire cualquier trozo grande de cáscara de huevo que pueda haber caído encima del embrión con fórceps. Retire los trozos más pequeños colocando unas gotas de DPBS con calcio y magnesio en el embrión con una pipeta de transferencia de plástico, luego aspirando el DPBS con la cáscara de huevo en la pipeta.Usando una pipeta de transferencia de plástico, agregue tres gotas de DPBS, complementadas con estreptomicina al huevo al 0,5%. Selle cuidadosamente la ventana con un trozo grande de cinta transparente antes de volver a colocar el huevo en la incubadora hasta el cuarto día de incubación. Corte la cinta de la ventana con tijeras curvas de disección.Coloque el huevo bajo un microscopio de disección en un soporte de goma o cartón de huevo. El embrión de pollo está ahora en Hamburger-Hamilton Stage 23 a 24 y está acostado sobre su lado izquierdo con su lado derecho mirando hacia el espectador. Localice el ala derecha y la yema de la pierna del embrión, ya que el celoma se evaluará entre estas dos yemas de las extremidades.En el área entre el ala derecha y el brote de la pierna, cree una abertura consecutiva en la membrana vitelina, el corion y el amnios sosteniéndolos con dos pares de pinzas de disección y tirando suavemente de ellos en direcciones opuestas. Compruebe si hay acceso sin obstrucciones a la cavidad celómica. Agarre suavemente el borde de la pared del cuerpo entre el ala y el brote de la extremidad con un par de pinzas de disección y tire ligeramente hacia el espectador.La cavidad celómica debe ser claramente visible. Inserte con cuidado un instrumento romo pero delgado en la cavidad celómica. Coloque la mitad de un organoide dentro del huevo encima de la alantois usando un disector de duramadre.Usando pinzas de disección, agarre con cuidado el borde de la pared del cuerpo y tire de él ligeramente hacia el espectador para hacer visible la abertura al celio. Mueva suavemente el organoide hacia y a través de la abertura en la pared del cuerpo hacia el celum con un alambre de tungsteno romo y un soporte de micro bisturí. Empuje el organoide ligeramente cranealmente para alojarlo dentro del celio.Ahora es visible justo detrás del brote del ala. Agregue tres gotas de DPBS al huevo usando una pipeta de transferencia de plástico. Selle cuidadosamente la ventana con un trozo grande de cinta transparente antes de volver a colocar el huevo en la incubadora hasta el día 12 de incubación.Corte la cinta de la ventana con tijeras curvas de disección. Coloque el huevo bajo un microscopio de disección en un soporte de goma. Evalúe la vasculatura y localice las venas, que se pueden distinguir de las arterias por su color rojo ligeramente más brillante.Para mejorar el acceso a la vasculatura, amplíe cuidadosamente la ventana cortándola con tijeras de disección curvas. Después de seleccionar la vena, inserte la punta de la aguja microcapilar en la vena en un ángulo de cero a 20 grados. Asegúrese de que la aguja esté en la vena moviendo suavemente la punta de lado a lado.Sople suave y constantemente en el sistema de inyección para inyectar la aglutinina culinaris del cristalino. Y coloque el huevo de nuevo en la incubadora durante 10 minutos para que circule. Coloque el huevo en un soporte de goma en el banco.Luego, corte a través de las membranas que rodean el embrión con tijeras de disección curvas. Recoge el embrión del huevo con una cuchara perforada e inmediatamente decapita el embrión con unas tijeras. Bajo el microscopio de disección, coloque el cuerpo del embrión en una placa de Petri.Coloque el embrión boca arriba en la placa de Petri y extienda sus extremidades. Abra cuidadosamente la pared abdominal del embrión a lo largo del eje longitudinal con fórceps. Localiza el organoide dentro del embrión.El organoide se adhiere con mayor frecuencia al lóbulo hepático derecho, ya sea en la punta del mimo o cranealmente, justo debajo de la caja torácica. Por lo tanto, es recomendable comenzar mirando estas ubicaciones. Una vez localizado el organoide, retíralo del embrión cortándolo alrededor con micro tijeras.Coloque el organoide en el tejido de pollo que inevitablemente está unido a él en una placa de Petri bajo el microscopio de disección. Retire la mayor cantidad posible de papel de pollo con una cuchilla de afeitar de acero inoxidable de doble filo. Las imágenes inmunofluorescentes de un organoide renal no trasplantado y un organoide renal trasplantado contienen estructuras glomerulares y tubulares.En los organoides no trasplantados, algunas células endoteliales humanas están presentes. En el organoide trasplantado, una red vascular perfundida es visible en todo el organoide. Las imágenes ampliadas de las áreas en caja demuestran los tres tipos de células endoteliales que se pueden distinguir en los organoides trasplantados: células endoteliales humanas perfundidas, células endoteliales humanas no perfundidas y células endoteliales derivadas de pollo perfundidas.En los organoides no trasplantados, las células endoteliales rodean las estructuras glomerulares pero no las invaden. Sin embargo, en los organoides trasplantados, las estructuras glomerulares están vascularizadas por capilares perfundidos. Los organoides trasplantados se pueden analizar utilizando diferentes técnicas dependiendo del objetivo del experimento.La comparación directa con los controles no trasplantados puede proporcionar información sobre el proceso de vascularización y maduración.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Etiquetado Dual De Las Células De La Cresta Neural Y Los Vasos Sanguíneos Dentro De Los Embriones De Pollo Usando ChickGFP Injerto De Tubo Neural Y Carbocianina Tinte DiI Inyección

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Los explantes de retina enteras de pollo embriones para Tratamientos electroporación y Reactivos Químicos

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Técnica de microinyección a Target a los países en desarrollo<em&gt; Xenopus</em&gt; riñón

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

Un método eficaz para obtener células de grasa Dediferenciado

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

En Ovo electroporación en el tronco encefálico auditivo del pollo

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Seguimiento de la expresión génica mediante la detección de actividad de β-galactosidasa en embriones de ratón todo

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualización de la placa notocordal en embriones de ratón Gastrulating con microscopía electrónica e inmunofluorescencia de Monte todo y nodo

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Expresión rápida y eficiente de múltiples proteínas en embriones aviares utilizando la electroporación de ARNm

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

Un método simplificado para generar organoides renales a partir de células madre pluripotentes humanas

Kidney organoids generated from hPSCs have provided an unlimited source of renal tissue. Human kidney organoids are an invaluable tool for studying kidney ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Un dispositivo de trasplante simple y efectivo para embriones de pez cebra

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...