Name: efficient vascularization of kidney organoids through intracelomic transplantation in chicken embryos
Uploaded: 2023-02-17T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Vascularization of Kidney Organoids through Intracelomic Transplantation in Chicken Embryos at JoVE.com

Vi tackar George Galaris (LUMC, Leiden, Nederländerna) för hans hjälp med injektion av kycklingembryon. Vi erkänner stödet från Saskia van der Wal-Maas (Institutionen för anatomi och embryologi, LUMC, Leiden, Nederländerna), Conny van Munsteren (Institutionen för anatomi och embryologi, LUMC, Leiden, Nederländerna), Manon Zuurmond (LUMC, Leiden, Nederländerna) och Annemarie de Graaf (LUMC, Leiden, Nederländerna). M. Koning stöds av "Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC". Detta arbete stöddes delvis av Leiden University Fund "Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fund" GWF2019-02. Detta arbete stöds av partnerna Regenerative Medicine Crossing Borders (RegMedXB) och Health Holland, Top Sector Life Sciences &; Health. C.W. van den Berg och T.J. Rabelink stöds av Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine stöds av Novo Nordisk Foundation bidrag (NNF21CC0073729).

I enlighet med nederländsk lag krävdes inte godkännande av djurskyddskommittén för denna forskning.
1. Beredning av hiPSC-härledda njurorganoider för transplantation
<ol><li>Differentiera hiPSC till njurorganoider med hjälp av protokollet som utvecklats av Takasato et al.4,18,31. Odla organoiderna enligt detta protokoll på polyestercellodlingsinsatser med 0,4 μm porer (cel...

<ol>
	<li>Taguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+in+vivo+origin+of+metanephric+nephron+progenitors+enables+generation+of+complex+kidney+structures+from+pluripotent+stem+cells.">Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).</li><li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury.">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li><li>Kim, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-edited+human+kidney+organoids+reveal+mechanisms+of+disease+in+podocyte+development.">Gene-edited human kidney organoids reveal mechanisms of disease in podocyte development.</a> Stem Cells. 35 (12), 2366-2378 (2017).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Hale, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+organoid-derived+human+glomeruli+for+personalised+podocyte+disease+modelling+and+drug+screening.">3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening.</a> Nature Communications. 9 (1), 5167 (2018).</li><li>Vanslambrouck, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+metanephric+specification+to+functional+proximal+tubule+enables+toxicity+screening+and+infectious+disease+modelling+in+kidney+organoids.">Enhanced metanephric specification to functional proximal tubule enables toxicity screening and infectious disease modelling in kidney organoids.</a> Nature Communications. 13 (1), 5943 (2022).</li><li>Tanigawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+from+nephrotic+disease-derived+iPSCs+identify+impaired+NEPHRIN+localization+and+slit+diaphragm+formation+in+kidney+podocytes.">Organoids from nephrotic disease-derived iPSCs identify impaired NEPHRIN localization and slit diaphragm formation in kidney podocytes.</a> Stem Cell Reports. 11 (3), 727-740 (2018).</li><li>Forbes, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-iPSC-derived+kidney+organoids+show+functional+validation+of+a+ciliopathic+renal+phenotype+and+reveal+underlying+pathogenetic+mechanisms.">Patient-iPSC-derived kidney organoids show functional validation of a ciliopathic renal phenotype and reveal underlying pathogenetic mechanisms.</a> American Journal of Human Genetics. 102 (5), 816-831 (2018).</li><li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids.">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communications. 6, 8715 (2015).</li><li>Cruz, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cystogenesis+reveals+a+critical+role+of+microenvironment+in+human+polycystic+kidney+disease.">Organoid cystogenesis reveals a critical role of microenvironment in human polycystic kidney disease.</a> Nature Materials. 16 (11), 1112-1119 (2017).</li><li>Gupta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+injury+and+repair+in+kidney+organoids+reveals+that+homologous+recombination+governs+tubular+intrinsic+repair.">Modeling injury and repair in kidney organoids reveals that homologous recombination governs tubular intrinsic repair.</a> Science Translational Medicine. 14 (634), eabj4772 (2022).</li><li>Hiratsuka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid-on-a-chip+model+of+human+ARPKD+reveals+mechanosensing+pathomechanisms+for+drug+discovery.">Organoid-on-a-chip model of human ARPKD reveals mechanosensing pathomechanisms for drug discovery.</a> Scencei Advances. 8 (38), eabq0866 (2022).</li><li>Dorison, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+generated+using+an+allelic+series+of+NPHS2+point+variants+reveal+distinct+intracellular+podocin+mistrafficking.">Kidney organoids generated using an allelic series of NPHS2 point variants reveal distinct intracellular podocin mistrafficking.</a> Journal of the American Society of Nephrology. , (2022).</li><li>Eremina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular-specific+alterations+of+VEGF-A+expression+lead+to+distinct+congenital+and+acquired+renal+diseases.">Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases.</a> The Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).</li><li>Kitamoto, Y., Tokunaga, H., Tomita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+is+an+essential+molecule+for+mouse+kidney+development:+glomerulogenesis+and+nephrogenesis.">Vascular endothelial growth factor is an essential molecule for mouse kidney development: glomerulogenesis and nephrogenesis.</a> The Journal of Clinical Investigation. 99 (10), 2351-2357 (1997).</li><li>Sison, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+structure+and+function+require+paracrine,+not+autocrine,+VEGF-VEGFR-2+signaling.">Glomerular structure and function require paracrine, not autocrine, VEGF-VEGFR-2 signaling.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 21 (10), 1691-1701 (2010).</li><li>Ryan, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+deficiencies+in+renal+organoids+and+ex+vivo+kidney+organogenesis.">Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis.</a> Developmental Biology. 477, 98-116 (2021).</li><li>vanden Berg, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+subcapsular+transplantation+of+PSC-derived+kidney+organoids+induces+neo-vasculogenesis+and+significant+glomerular+and+tubular+maturation+in+vivo.">Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).</li><li>Sharmin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+podocytes+mature+into+vascularized+glomeruli+upon+experimental+transplantation.">Human induced pluripotent stem cell-derived podocytes mature into vascularized glomeruli upon experimental transplantation.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1778-1791 (2016).</li><li>Bantounas, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functioning+nephrons+by+implanting+human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+progenitors.">Generation of functioning nephrons by implanting human pluripotent stem cell-derived kidney progenitors.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 766-779 (2018).</li><li>vanden Berg, C. W., Koudijs, A., Ritsma, L., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+assessment+of+size-selective+glomerular+sieving+in+transplanted+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+organoids.">In vivo assessment of size-selective glomerular sieving in transplanted human induced pluripotent stem cell-derived kidney organoids.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 31 (5), 921-929 (2020).</li><li>Asai, R., Bressan, M., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avians+as+a+model+system+of+vascular+development.">Avians as a model system of vascular development.</a> Methods in Molecular Biology. 2206, 103-127 (2021).</li><li>Jankovic, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+capacity+of+the+chicken+embryo.+I.+Relationship+between+the+maturation+of+lymphoid+tissues+and+the+occurrence+of+cell-mediated+immunity+in+the+developing+chicken+embryo.">Immunological capacity of the chicken embryo. I. Relationship between the maturation of lymphoid tissues and the occurrence of cell-mediated immunity in the developing chicken embryo.</a> Immunology. 29 (3), 497-508 (1975).</li><li>Alkie, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+innate+immunity+in+chicken+embryos+and+newly+hatched+chicks:+a+disease+control+perspective.">Development of innate immunity in chicken embryos and newly hatched chicks: a disease control perspective.</a> Avian Pathology. 48 (4), 288-310 (2019).</li><li>Rawles, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+normal+embryonic+tissues.">Transplantation of normal embryonic tissues.</a> Annalls of the New York Academy of Sciences. 55 (2), 302-312 (1952).</li><li>Rawles, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+melanophores+from+embryonic+mouse+tissues+grown+in+the+coelom+of+chick+embryos.">The development of melanophores from embryonic mouse tissues grown in the coelom of chick embryos.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 26 (12), 673-680 (1940).</li><li>Garreta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+tuning+the+extracellular+environment+accelerates+the+derivation+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Materials. 18 (4), 397-405 (2019).</li><li>Koning, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculogenesis+in+kidney+organoids+upon+transplantation.">Vasculogenesis in kidney organoids upon transplantation.</a> NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 40 (2022).</li><li>Hamburger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenetic+and+axial+self-differentiation+of+transplanted+limb+primordia+of+2-day+chick+embryos.">Morphogenetic and axial self-differentiation of transplanted limb primordia of 2-day chick embryos.</a> Journal of Experimental Zoology. 77 (3), 379-399 (1938).</li><li>Dossel, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+of+intracelomic+grafting.">New method of intracelomic grafting.</a> Science. 120 (3111), 262-263 (1954).</li><li>Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).</li><li>Aleksandrowicz, E., Herr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethical+euthanasia+and+short-term+anesthesia+of+the+chick+embryo.">Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo.</a> ALTEX. 32 (2), 143-147 (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACUC.">ACUC.</a> Guideline: The Use and Euthanasia Procedures of Chicken/Avian Embryos. , (2012).</li></ol>

I detta manuskript demonstreras ett protokoll för intracelomisk transplantation av hiPSC-härledda njurorganoider i kycklingembryon. Vid transplantation vaskuliseras organoider av perfuserade blodkärl som består av en kombination av humana organoid-härledda och kyckling-härledda ECs. Dessa sprids över hela organoiden och invaderar de glomerulära strukturerna, vilket möjliggör interaktion mellan ECs och podocyter. Det har tidigare visats att detta leder till ökad mognad av de organoida glomerulära och rörformi...

Humant inducerade pluripotenta stamcellsbaserade njurorganoider (hiPSC) har visat sig ha potential för utvecklingsstudier 1,2,3,4, toxicitetsscreening 5,6 och sjukdomsmodellering5,7,8,9,10,11,12,13. Deras tillämplighet för dessa och eventuella kliniska transplantationsändamål begränsas dock av avsaknaden av ett vaskulärt nätverk. Under embryonal njurutveckling interagerar podocyter, mesangiala celler och vaskulära endotelceller (EC) för att bilda glomerulus invecklade struktur. Utan denna interaktion kan den glomerulära filtreringsbarriären, bestående av podocyter, det glomerulära basalmembranet (GBM) och EC, inte utvecklas ordentligt14,15,16. Även om njurorganoider in vitro innehåller vissa EC, misslyckas dessa med att bilda ett ordentligt vaskulärt nätverk och minskar med tiden17. Det är därför inte förvånande att organoiderna förblir omogna. Transplantation hos möss inducerar vaskularisering och mognad av njurorganoiderna 18,19,20,21. Tyvärr är detta en arbetsintensiv process som är olämplig för analys av ett stort antal organoider.
Kycklingembryon har använts för att studera vaskularisering och utveckling i över ett sekel22. De är lättillgängliga, kräver lågt underhåll, saknar ett fullt fungerande immunförsvar och kan utvecklas normalt efter att äggskalet 23,24,25,26 har öppnats. Transplantation av organoider på deras korioallantoiska membran (CAM) har visat sig leda till vaskularisering27. Varaktigheten av transplantation på CAM, liksom mognadsnivån för transplantatet, begränsas emellertid av CAM-bildning, vilket tar fram till embryonal dag 7 att slutföra. Därför utvecklades nyligen en metod för att effektivt vaskularisera och mogna njurorganoider genom intracelomisk transplantation i kycklingembryon28. Celomhålan hos kycklingembryon har varit känd sedan 1930-talet för att vara en gynnsam miljö för differentiering av embryonala vävnader29,30. Det kan nås tidigt i embryonal utveckling och möjliggör relativt obegränsad expansion av transplantatet i alla riktningar.
Detta dokument beskriver ett protokoll för transplantation av hiPSC-härledda njurorganoider i celomikhålan hos dag 4 kycklingembryon. Denna metod inducerar vaskularisering och förbättrad mognad av organoiderna inom 8 dagar. Injektion av fluorescerande märkt lins culinaris agglutinin (LCA) före uppoffring av embryon möjliggör visualisering av perfuserade blodkärl i organoiderna genom konfokalmikroskopi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>10462200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes&#160;</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>Contains silicone tubes, mouth piece and connector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHTC091-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHTC090-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope&#160;</td>
			<td>Wild Heerbrugg</td>
			<td>355110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHSB391-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-&#945;-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-212-02</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-&#945;-sheep Alexa Fluor 647</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21448</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edged stainless steel razor blades</td>
			<td>Electron Microsopy Sciences</td>
			<td>72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg cartons or custom made egg holders&#160;</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus)&#160;</td>
			<td>Drost Loosdrecht B.V.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Elbanton BV</td>
			<td>ET-3 combi</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>B-1325</td>
			<td>dilution 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHSB500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150F-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td>We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws.</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>L-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olivecrona dura dissector 18 cm&#160;</td>
			<td>Reda</td>
			<td>41146-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm&#160;</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HS234526B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated spoon&#160;</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>S-20-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 x 15 mm&#160;</td>
			<td>CELLSTAR</td>
			<td>628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipettes&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PP89SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified mouse anti-human CD31 antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555444</td>
			<td>dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>RL-1042</td>
			<td>This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-human NPHS1 antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>AF4269</td>
			<td>dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile hypodermic needles, 19 G</td>
			<td>BD microlance</td>
			<td>301500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Alexa Fluor 405</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S32351</td>
			<td>dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 5 mL</td>
			<td>BD Emerald</td>
			<td>307731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent tape&#160;</td>
			<td>Tesa</td>
			<td>4124</td>
			<td>Available at most hardware stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire, 0.25 mm dia&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>010404.H2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient vascularization of kidney organoids through intracelomic transplantation in chicken embryos

Njurorganoider härrörande från humaninducerade pluripotenta stamceller innehåller nefronliknande strukturer som liknar dem i den vuxna njuren till en viss grad. Tyvärr hämmas deras kliniska tillämplighet av bristen på funktionell vaskulatur och följaktligen begränsad mognad in vitro. Transplantationen av njurorganoider i den celomiska håligheten hos kycklingembryon inducerar vaskularisering genom perfuserade blodkärl, inklusive bildandet av glomerulära kapillärer, och förbättrar deras mognad. Denna teknik är mycket effektiv, vilket möjliggör transplantation och analys av ett stort antal organoider. Detta dokument beskriver ett detaljerat protokoll för intracelomisk transplantation av njurorganoider i kycklingembryon, följt av injektion av fluorescerande märkt lektin för att färga den perfuserade vaskulaturen och samlingen av transplanterade organoider för avbildningsanalys. Denna metod kan användas för att inducera och studera organoid vaskularisering och mognad för att hitta ledtrådar för att förbättra dessa processer in vitro och förbättra sjukdomsmodellering.

Metoden och tidslinjen för differentiering av hiPSC till njurorganoider, inkubation av befruktade kycklingägg, transplantation av njurorganoider, injektion av LCA och insamling av organoiderna sammanfattas i figur 1A. Det är viktigt att samordna tidpunkten för organoiddifferentiering och kycklingägginkubation, som börjar differentiering 15 dagar före inkubation. Åtgärderna på dag 0, 3, 4 och 12 av inkubationen illustreras av fotografier under tidslinjen. Organoider transplanteras ...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Vascularization of Kidney Organoids through Intracelomic Transplantation in Chicken Embryos at JoVE.com

Efficient Vascularization of Kidney Organoids through Intracelomic Transplantation in Chicken Embryos

Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för transplantation av njurorganoider i celomhålan hos kycklingembryon. Denna metod inducerar vaskularisering och förbättrad mognad av organoiderna inom 8 dagar och kan användas för att studera dessa processer på ett effektivt sätt.

Effektiv vaskularisering av njurorganoider genom intracelomisk transplantation i kycklingembryon

Kidney organoids derived from human induced pluripotent stem cells contain nephron-like structures that resemble those in the adult kidney to a certain ...

Njurorganoider odlade in vitro förblir omogna, vilket begränsar deras tillämplighet. Och denna metod för intrakoelomisk transplantation inducerar vaskularisering och förbättrar mognad av organoiderna. Förfarandet är mycket effektivt, vilket möjliggör transplantation och analys av ett stort antal organoider i ett experiment.Efter beredning av HIPSC-härledda njurorganoider och inkubation av de befruktade benhornäggen skapas ett fönster i äggskalet på dag tre av inkubationen. Lägg en liten bit transparent tejp på äggets spetsiga spets. Gör ett litet hål i äggskalet i mitten av det transparenta tejpen genom att knacka på det med den skarpa änden av en dissekeringssax.Sätt sedan in en 19-gauge nål på en fem milliliter spruta i hålet i 45 graders vinkel. Aspirera två till tre milliliter albumin från ägget för att sänka embryot inuti ägget. Dölj hålet med en andra bit transparent tejp och placera sedan en stor bit transparent tejp på pennan markerad uppåt mot sidan av ägget.Gör ett hål i äggskalet i mitten av det transparenta tejpen genom att knacka på det med den skarpa änden av en sax. Skär ett litet cirkulärt fönster i äggskalet från detta hål med böjd dissekeringssax. Titta genom detta fönster för att hitta embryot.Förstora sedan fönstret för att optimera tillgången till embryot. Ta bort alla stora bitar äggskal som kan ha fallit ovanpå embryot med pincett. Ta bort mindre bitar genom att placera några droppar DPBS med kalcium och magnesium på embryot med en plastöverföringspipett och sedan aspirera DPBS med äggskalet i pipetten.Tillsätt tre droppar DPBS, kompletterat med 0,5% penicillinstreptomycin till ägget med en plastöverföringspipett. Försegla försiktigt fönstret med en stor bit transparent tejp innan du placerar ägget tillbaka i inkubatorn till dag fyra av inkubationen. Klipp tejpen från fönstret med böjd dissekeringssax.Placera ägget under ett dissekeringsmikroskop på en gummihållare eller äggkartong. Kycklingembryot är nu i Hamburger-Hamilton etapp 23 till 24 och ligger på vänster sida med höger sida vänd mot betraktaren. Leta reda på embryots högra vinge och benknopp eftersom coelom kommer att bedömas mellan dessa två lemknoppar.I området mellan höger vinge och benknopp, skapa en öppning i följd i vitellinmembranet, korionen och amnionen genom att hålla dem med två par dissekerande pincett och försiktigt dra dem i motsatta riktningar. Kontrollera om det finns fri tillgång till koelomhålan. Ta försiktigt tag i kanten på kroppsväggen mellan vingen och lemknoppen med ett par dissekerande pincett och dra den något mot betraktaren.Den coelomiska håligheten måste vara tydligt synlig. Sätt försiktigt in ett trubbigt men smalt instrument i koelomhålan. Placera en halv organoid inuti ägget ovanpå allantois med en dura dissektor.Använd dissekerande pincett, ta försiktigt tag i kanten på kroppsväggen och dra den något mot betraktaren för att göra öppningen till coelum synlig. Flytta försiktigt organoiden mot och genom öppningen i kroppsväggen in i coelum med en trubbig volframtråd och en mikroskalpellhållare. Tryck organoiden något kranialt för att lägga den inuti coelum.Den är nu synlig precis bakom vingknoppen. Tillsätt tre droppar DPBS till ägget med en plastöverföringspipett. Försegla försiktigt fönstret med en stor bit transparent tejp innan du placerar ägget tillbaka i inkubatorn till dag 12 av inkubationen.Klipp tejpen från fönstret med böjd dissekeringssax. Placera ägget under ett dissekeringsmikroskop i en gummihållare. Utvärdera vaskulaturen och lokalisera venerna, som kan särskiljas från artärerna med sin något ljusare röda färg.För att förbättra tillgången till vaskulaturen, förstora försiktigt fönstret genom att klippa det med böjd dissekeringssax. Efter att ha valt venen, sätt in spetsen på mikrokapillärnålen i venen i noll till 20 graders vinkel. Se till att nålen är i venen genom att försiktigt flytta spetsen från sida till sida.Blås försiktigt och stadigt in i injektionssystemet för att injicera linsen culinaris agglutinin. Och placera ägget tillbaka i inkubatorn i 10 minuter för att låta det cirkulera. Lägg ägget i en gummihållare på bänken.Skär sedan genom membranen som omger embryot med krökt dissekeringssax. Skopa embryot upp från ägget med en perforerad sked och halshugg omedelbart embryot med sax. Under dissektionsmikroskopet placerar du embryonets kropp i en petriskål.Placera embryot på ryggen i petriskålen och sprid dess lemmar. Öppna försiktigt embryonets bukvägg längs längdaxeln med pincett. Leta reda på organoid inuti embryot.Organoiden fästs oftast vid höger leverlob, antingen vid torskspetsen eller kranialt, strax under bröstkorgen. Så det är lämpligt att börja med att titta på dessa platser. När organoiden är belägen, ta bort den från embryot genom att klippa runt den med mikrosax.Placera organoiden i kycklingvävnaden som oundvikligen är fäst vid den i en petriskål under dissekeringsmikroskopet. Ta bort så mycket kycklingvävnad som möjligt med ett tveeggat rakblad i rostfritt stål. Immunofluorescerande bilder av en icke-transplanterad njurorganoid och en transplanterad njurorganoid innehåller båda glomerulära och rörformiga strukturer.I de otransplanterade organoiderna finns vissa humana endotelceller närvarande. I den transplanterade organoiden är ett perfuserat vaskulärt nätverk synligt i hela organoiden. Förstorade bilder av de boxade områdena visar de tre typerna av endotelceller som kan särskiljas i transplanterade organoider: perfuserade humana endotelceller, operfuserade humana endotelceller och perfuserade kycklinghärledda endotelceller.I otransplanterade organoider omger endotelceller glomerulära strukturer men invaderar dem inte. I transplanterade organoider vaskulariseras emellertid glomerulära strukturer av perfuserade kapillärer. Transplanterade organoider kan analyseras med olika tekniker beroende på syftet med experimentet.Direkt jämförelse med otransplanterade kontroller kan ge insikt i vaskulariserings- och mognadsprocessen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dubbel märkning av neurala vapenceller och blodkärl i kycklingembryon med chickGFP neuralrör ympning och karbalybocyanin färgämne dii injektion

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Hela Retinala Explantat från kycklingembryon för elektroporering och kemiskt reagens Behandlingar

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Teknik till Target mikroinjektion till utvecklings<em&gt; Xenopus</em&gt; Njure

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

En effektiv metod för att få avdifferentierade fettceller

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

I Ovo Electroporation i Chicken Auditory Brainstem

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Spåra genuttryck genom påvisande av β-galaktosidas aktivitet i hela musembryon

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisera den noden och Notochordal plattan i Gastrulating musembryon som använder Scanning Electron Microscopy och hela Mount immunofluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Snabb och effektiv uttryck av flera proteiner i aviär embryon med hjälp av mRNA elektroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

En förenklad metod för att generera njurorganoider från humana pluripotenta stamceller

Kidney organoids generated from hPSCs have provided an unlimited source of renal tissue. Human kidney organoids are an invaluable tool for studying kidney ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

En enkel och effektiv transplantationsanordning för zebrafiskembryon

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...