Name: efficient vascularization of kidney organoids through intracelomic transplantation in chicken embryos
Uploaded: 2023-02-17T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Vascularization of Kidney Organoids through Intracelomic Transplantation in Chicken Embryos at JoVE.com

George Galaris'e (LUMC, Leiden, Hollanda) tavuk embriyosu enjeksiyonu konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. Saskia van der Wal-Maas (Anatomi ve Embriyoloji Bölümü, LUMC, Leiden, Hollanda), Conny van Munsteren (Anatomi ve Embriyoloji Bölümü, LUMC, Leiden, Hollanda), Manon Zuurmond (LUMC, Leiden, Hollanda) ve Annemarie de Graaf'ın (LUMC, Leiden, Hollanda) desteklerini kabul ediyoruz. M. Koning, 'Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC' tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma kısmen Leiden Üniversitesi Fonu "Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fonu" GWF2019-02 tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma, Rejeneratif Tıp Sınırları Aşan (RegMedXB) ve Health Holland, Top Sector Life Sciences &; Health ortakları tarafından desteklenmektedir. C.W. van den Berg ve T.J. Rabelink, Novo Nordisk Vakfı Kök Hücre Tıbbı Merkezi (reNEW), Novo Nordisk Vakfı Kök Hücre Tıbbı Merkezi, Novo Nordisk Vakfı hibeleri (NNF21CC0073729) tarafından desteklenmektedir.

Hollanda yasalarına göre, bu araştırma için hayvan refahı komitesinin onayı gerekli değildi.
1. HiPSC türevi böbrek organoidlerinin transplantasyon için hazırlanması
<ol><li>Takasato ve ark.4,18,31 tarafından geliştirilen protokolü kullanarak hiPSC'leri böbrek organoidlerine ayırt edin. Polyester hücre kültürü ekleri üzerindeki bu protokolü takip eden organoi...

<ol>
	<li>Taguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+in+vivo+origin+of+metanephric+nephron+progenitors+enables+generation+of+complex+kidney+structures+from+pluripotent+stem+cells.">Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).</li><li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury.">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li><li>Kim, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-edited+human+kidney+organoids+reveal+mechanisms+of+disease+in+podocyte+development.">Gene-edited human kidney organoids reveal mechanisms of disease in podocyte development.</a> Stem Cells. 35 (12), 2366-2378 (2017).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Hale, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+organoid-derived+human+glomeruli+for+personalised+podocyte+disease+modelling+and+drug+screening.">3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening.</a> Nature Communications. 9 (1), 5167 (2018).</li><li>Vanslambrouck, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+metanephric+specification+to+functional+proximal+tubule+enables+toxicity+screening+and+infectious+disease+modelling+in+kidney+organoids.">Enhanced metanephric specification to functional proximal tubule enables toxicity screening and infectious disease modelling in kidney organoids.</a> Nature Communications. 13 (1), 5943 (2022).</li><li>Tanigawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+from+nephrotic+disease-derived+iPSCs+identify+impaired+NEPHRIN+localization+and+slit+diaphragm+formation+in+kidney+podocytes.">Organoids from nephrotic disease-derived iPSCs identify impaired NEPHRIN localization and slit diaphragm formation in kidney podocytes.</a> Stem Cell Reports. 11 (3), 727-740 (2018).</li><li>Forbes, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-iPSC-derived+kidney+organoids+show+functional+validation+of+a+ciliopathic+renal+phenotype+and+reveal+underlying+pathogenetic+mechanisms.">Patient-iPSC-derived kidney organoids show functional validation of a ciliopathic renal phenotype and reveal underlying pathogenetic mechanisms.</a> American Journal of Human Genetics. 102 (5), 816-831 (2018).</li><li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids.">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communications. 6, 8715 (2015).</li><li>Cruz, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cystogenesis+reveals+a+critical+role+of+microenvironment+in+human+polycystic+kidney+disease.">Organoid cystogenesis reveals a critical role of microenvironment in human polycystic kidney disease.</a> Nature Materials. 16 (11), 1112-1119 (2017).</li><li>Gupta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+injury+and+repair+in+kidney+organoids+reveals+that+homologous+recombination+governs+tubular+intrinsic+repair.">Modeling injury and repair in kidney organoids reveals that homologous recombination governs tubular intrinsic repair.</a> Science Translational Medicine. 14 (634), eabj4772 (2022).</li><li>Hiratsuka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid-on-a-chip+model+of+human+ARPKD+reveals+mechanosensing+pathomechanisms+for+drug+discovery.">Organoid-on-a-chip model of human ARPKD reveals mechanosensing pathomechanisms for drug discovery.</a> Scencei Advances. 8 (38), eabq0866 (2022).</li><li>Dorison, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+generated+using+an+allelic+series+of+NPHS2+point+variants+reveal+distinct+intracellular+podocin+mistrafficking.">Kidney organoids generated using an allelic series of NPHS2 point variants reveal distinct intracellular podocin mistrafficking.</a> Journal of the American Society of Nephrology. , (2022).</li><li>Eremina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular-specific+alterations+of+VEGF-A+expression+lead+to+distinct+congenital+and+acquired+renal+diseases.">Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases.</a> The Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).</li><li>Kitamoto, Y., Tokunaga, H., Tomita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+is+an+essential+molecule+for+mouse+kidney+development:+glomerulogenesis+and+nephrogenesis.">Vascular endothelial growth factor is an essential molecule for mouse kidney development: glomerulogenesis and nephrogenesis.</a> The Journal of Clinical Investigation. 99 (10), 2351-2357 (1997).</li><li>Sison, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+structure+and+function+require+paracrine,+not+autocrine,+VEGF-VEGFR-2+signaling.">Glomerular structure and function require paracrine, not autocrine, VEGF-VEGFR-2 signaling.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 21 (10), 1691-1701 (2010).</li><li>Ryan, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+deficiencies+in+renal+organoids+and+ex+vivo+kidney+organogenesis.">Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis.</a> Developmental Biology. 477, 98-116 (2021).</li><li>vanden Berg, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+subcapsular+transplantation+of+PSC-derived+kidney+organoids+induces+neo-vasculogenesis+and+significant+glomerular+and+tubular+maturation+in+vivo.">Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).</li><li>Sharmin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+podocytes+mature+into+vascularized+glomeruli+upon+experimental+transplantation.">Human induced pluripotent stem cell-derived podocytes mature into vascularized glomeruli upon experimental transplantation.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1778-1791 (2016).</li><li>Bantounas, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functioning+nephrons+by+implanting+human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+progenitors.">Generation of functioning nephrons by implanting human pluripotent stem cell-derived kidney progenitors.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 766-779 (2018).</li><li>vanden Berg, C. W., Koudijs, A., Ritsma, L., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+assessment+of+size-selective+glomerular+sieving+in+transplanted+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+organoids.">In vivo assessment of size-selective glomerular sieving in transplanted human induced pluripotent stem cell-derived kidney organoids.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 31 (5), 921-929 (2020).</li><li>Asai, R., Bressan, M., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avians+as+a+model+system+of+vascular+development.">Avians as a model system of vascular development.</a> Methods in Molecular Biology. 2206, 103-127 (2021).</li><li>Jankovic, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+capacity+of+the+chicken+embryo.+I.+Relationship+between+the+maturation+of+lymphoid+tissues+and+the+occurrence+of+cell-mediated+immunity+in+the+developing+chicken+embryo.">Immunological capacity of the chicken embryo. I. Relationship between the maturation of lymphoid tissues and the occurrence of cell-mediated immunity in the developing chicken embryo.</a> Immunology. 29 (3), 497-508 (1975).</li><li>Alkie, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+innate+immunity+in+chicken+embryos+and+newly+hatched+chicks:+a+disease+control+perspective.">Development of innate immunity in chicken embryos and newly hatched chicks: a disease control perspective.</a> Avian Pathology. 48 (4), 288-310 (2019).</li><li>Rawles, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+normal+embryonic+tissues.">Transplantation of normal embryonic tissues.</a> Annalls of the New York Academy of Sciences. 55 (2), 302-312 (1952).</li><li>Rawles, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+melanophores+from+embryonic+mouse+tissues+grown+in+the+coelom+of+chick+embryos.">The development of melanophores from embryonic mouse tissues grown in the coelom of chick embryos.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 26 (12), 673-680 (1940).</li><li>Garreta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+tuning+the+extracellular+environment+accelerates+the+derivation+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Materials. 18 (4), 397-405 (2019).</li><li>Koning, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculogenesis+in+kidney+organoids+upon+transplantation.">Vasculogenesis in kidney organoids upon transplantation.</a> NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 40 (2022).</li><li>Hamburger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenetic+and+axial+self-differentiation+of+transplanted+limb+primordia+of+2-day+chick+embryos.">Morphogenetic and axial self-differentiation of transplanted limb primordia of 2-day chick embryos.</a> Journal of Experimental Zoology. 77 (3), 379-399 (1938).</li><li>Dossel, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+of+intracelomic+grafting.">New method of intracelomic grafting.</a> Science. 120 (3111), 262-263 (1954).</li><li>Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).</li><li>Aleksandrowicz, E., Herr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethical+euthanasia+and+short-term+anesthesia+of+the+chick+embryo.">Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo.</a> ALTEX. 32 (2), 143-147 (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACUC.">ACUC.</a> Guideline: The Use and Euthanasia Procedures of Chicken/Avian Embryos. , (2012).</li></ol>

Bu yazıda, tavuk embriyolarında hiPSC türevi böbrek organoidlerinin intrasemik transplantasyonu için bir protokol gösterilmiştir. Transplantasyon üzerine, organoidler, insan organoid kaynaklı ve tavuk kaynaklı ECs'nin bir kombinasyonundan oluşan perfüze kan damarları tarafından vaskülarize edilir. Bunlar organoid boyunca yayılır ve glomerüler yapıları istila ederek ECs ve podositler arasında etkileşimi sağlar. Daha önce bunun organoid glomerüler ve tübüler yapıların olgunlaşmasının artmas?...

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre (hiPSC) kaynaklı böbrek organoidlerinin gelişimsel çalışmalariçin potansiyele sahip olduğu gösterilmiştir 1,2,3,4, toksisite taraması 5,6 ve hastalık modelleme 5,7,8,9,10,11,12,13 . Bununla birlikte, bunlar ve nihai klinik transplantasyon amaçları için uygulanabilirlikleri, vasküler bir ağın olmaması nedeniyle sınırlıdır. Embriyonik böbrek gelişimi sırasında, podositler, mezangial hücreler ve vasküler endotel hücreleri (ECs), glomerulusun karmaşık yapısını oluşturmak için etkileşime girer. Bu etkileşim olmadan, podositler, glomerüler bazal membran (GBM) ve ECs'den oluşan glomerüler filtrasyon bariyeri düzgün bir şekilde gelişemez14,15,16. İn vitro böbrek organoidleri bazı EC'ler içermesine rağmen, bunlar uygun bir vasküler ağ oluşturamaz ve zamanla azalır17. Bu nedenle organoidlerin olgunlaşmamış kalması şaşırtıcı değildir. Farelerde transplantasyon, böbrek organoidlerinin vaskülarizasyonunu ve olgunlaşmasını indükler 18,19,20,21. Ne yazık ki, bu, çok sayıda organoidin analizi için uygun olmayan emek yoğun bir süreçtir.
Tavuk embriyoları, bir yüzyıldan fazla bir süredir vaskülarizasyon ve gelişimi incelemek için kullanılmıştır22. Kolayca erişilebilirler, düşük bakım gerektirirler, tamamen işlevsel bir bağışıklık sisteminden yoksundurlar ve yumurta kabuğunu açtıktan sonra normal olarak gelişebilirler23,24,25,26. Organoidlerin koryoallantoik membran (CAM) transplantasyonunun vaskülarizasyona yol açtığı gösterilmiştir27. Bununla birlikte, CAM üzerindeki transplantasyon süresi ve greftin olgunlaşma seviyesi, tamamlanması embriyonik gün 7'ye kadar süren CAM oluşumu ile sınırlıdır. Bu nedenle, son zamanlarda tavuk embriyolarında intrasemik transplantasyon yoluyla böbrek organoidlerini etkili bir şekilde vaskülarize etmek ve olgunlaştırmak için bir yöntem geliştirilmiştir28. Tavuk embriyolarının selomik boşluğunun 1930'lardan beri embriyonik dokuların farklılaşması için elverişli bir ortam olduğu bilinmektedir29,30. Embriyonik gelişimin erken dönemlerinde erişilebilir ve greftin her yöne nispeten sınırsız genişlemesine izin verir.
Bu yazıda, hiPSC türevi böbrek organoidlerinin 4. gün tavuk embriyolarının selomik boşluğunda transplantasyonu için bir protokol özetlenmiştir. Bu yöntem, 8 gün içinde organoidlerin vaskülarizasyonunu ve gelişmiş olgunlaşmasını indükler. Embriyoları feda etmeden önce floresan etiketli lens culinaris aglutinin (LCA) enjeksiyonu, konfokal mikroskopi ile organoidler içindeki perfüze kan damarlarının görüntülenmesini sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>10462200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes&#160;</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>Contains silicone tubes, mouth piece and connector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHTC091-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHTC090-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope&#160;</td>
			<td>Wild Heerbrugg</td>
			<td>355110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHSB391-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-&#945;-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-212-02</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey-&#945;-sheep Alexa Fluor 647</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21448</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edged stainless steel razor blades</td>
			<td>Electron Microsopy Sciences</td>
			<td>72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg cartons or custom made egg holders&#160;</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus)&#160;</td>
			<td>Drost Loosdrecht B.V.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Elbanton BV</td>
			<td>ET-3 combi</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>B-1325</td>
			<td>dilution 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm</td>
			<td>Hammacher Karl</td>
			<td>HAMMHSB500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150F-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td>We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws.</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>L-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olivecrona dura dissector 18 cm&#160;</td>
			<td>Reda</td>
			<td>41146-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm&#160;</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HS234526B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated spoon&#160;</td>
			<td>Euronexia</td>
			<td>S-20-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 x 15 mm&#160;</td>
			<td>CELLSTAR</td>
			<td>628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipettes&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PP89SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified mouse anti-human CD31 antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555444</td>
			<td>dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>RL-1042</td>
			<td>This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-human NPHS1 antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>AF4269</td>
			<td>dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile hypodermic needles, 19 G</td>
			<td>BD microlance</td>
			<td>301500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Alexa Fluor 405</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S32351</td>
			<td>dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 5 mL</td>
			<td>BD Emerald</td>
			<td>307731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent tape&#160;</td>
			<td>Tesa</td>
			<td>4124</td>
			<td>Available at most hardware stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire, 0.25 mm dia&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>010404.H2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient vascularization of kidney organoids through intracelomic transplantation in chicken embryos

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden elde edilen böbrek organoidleri, yetişkin böbrektekine belirli bir dereceye kadar benzeyen nefron benzeri yapılar içerir. Ne yazık ki, klinik uygulanabilirlikleri fonksiyonel bir vaskülatür eksikliği ve sonuç olarak in vitro olgunlaşmanın sınırlı olması nedeniyle engellenmektedir. Tavuk embriyolarının selomik boşluğundaki böbrek organoidlerinin transplantasyonu, glomerüler kılcal damarların oluşumu da dahil olmak üzere perfüze edilmiş kan damarları tarafından vaskülarizasyonu indükler ve olgunlaşmalarını arttırır. Bu teknik çok etkilidir ve çok sayıda organoidin transplantasyonuna ve analizine izin verir. Bu yazıda, tavuk embriyolarında böbrek organoidlerinin intrasemik transplantasyonu için ayrıntılı bir protokol, ardından perfüze edilen vaskülatürü boyamak için floresan olarak etiketlenmiş lektin enjeksiyonu ve görüntüleme analizi için nakledilen organoidlerin toplanması açıklanmaktadır. Bu yöntem, in vitro olarak bu süreçleri geliştirmek ve hastalık modellemesini geliştirmek için ipuçları bulmak üzere organoid vaskülarizasyon ve olgunlaşmayı indüklemek ve incelemek için kullanılabilir.

HiPSC'lerin böbrek organoidlerine farklılaşması, döllenmiş tavuk yumurtasının inkübasyonu, böbrek organoidlerinin transplantasyonu, LCA enjeksiyonu ve organoidlerin toplanması için yöntem ve zaman çizelgesi Şekil 1A'da özetlenmiştir. Organoid farklılaşma ve tavuk yumurtası inkübasyonunun zamanlamasını koordine etmek, inkübasyondan 15 gün önce farklılaşmaya başlamak önemlidir. Kuluçkanın 0, 3, 4 ve 12. günlerindeki eylemler zaman çizelgesinin altındaki foto...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Vascularization of Kidney Organoids through Intracelomic Transplantation in Chicken Embryos at JoVE.com

Efficient Vascularization of Kidney Organoids through Intracelomic Transplantation in Chicken Embryos

Burada, tavuk embriyolarının selomik boşluğunda böbrek organoidlerinin transplantasyonu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, 8 gün içinde organoidlerin vaskülarizasyonunu ve gelişmiş olgunlaşmasını indükler ve bu süreçleri verimli bir şekilde incelemek için kullanılabilir.

Tavuk Embriyolarında İntralomik Transplantasyon Yoluyla Böbrek Organoidlerinin Etkin Vaskülarizasyonu

Kidney organoids derived from human induced pluripotent stem cells contain nephron-like structures that resemble those in the adult kidney to a certain ...

İn vitro kültüre alınan böbrek organoidleri olgunlaşmamış kalır ve uygulanabilirliklerini sınırlar. Ve bu intrakoelomik transplantasyon yöntemi vaskülarizasyonu indükler ve organoidlerin olgunlaşmasını arttırır. Prosedür çok etkilidir ve tek bir deneyde çok sayıda organoidin transplantasyonuna ve analizine izin verir.HIPSC türevi böbrek organoidlerini hazırladıktan ve döllenmiş bacak boynuzu yumurtalarını inkübe ettikten sonra, inkübasyonun üçüncü gününde yumurta kabuğunda bir pencere oluşturur. Yumurtanın sivri ucuna küçük bir şeffaf bant parçası yerleştirin. Şeffaf bandın ortasındaki yumurta kabuğunda, bir çift diseksiyon makasın keskin ucuyla dokunarak küçük bir delik açın.Ardından, beş mililitrelik bir şırınga üzerine 19 derecelik bir iğneyi 45 derecelik bir açıyla deliğe yerleştirin. Yumurtanın içindeki embriyoyu düşürmek için yumurtadan iki ila üç mililitre albümin aspire edin. Deliği ikinci bir şeffaf bant parçasıyla gizleyin, ardından yumurtanın yukarı bakan tarafına işaretlenmiş kalemin üzerine büyük bir şeffaf bant parçası yerleştirin.Şeffaf bandın ortasındaki yumurta kabuğunda, bir çift diseksiyon makasın keskin ucuyla dokunarak bir delik açın. Kavisli disseksiyon makası kullanarak yumurta kabuğundaki küçük bir dairesel pencereyi bu delikten kesin. Embriyoyu bulmak için bu pencereden bakın.Ardından, embriyoya erişimi optimize etmek için pencereyi genişletin. Forseps kullanarak embriyonun üstüne düşmüş olabilecek büyük yumurta kabuğu parçalarını çıkarın. Plastik bir transfer pipeti ile embriyonun üzerine kalsiyum ve magnezyum içeren birkaç damla DPBS yerleştirerek daha küçük parçaları çıkarın, ardından DPBS'yi yumurta kabuğu ile pipete aspire edin.Plastik bir transfer pipeti kullanarak, yumurtaya% 0.5 penisilin streptomisin ile desteklenmiş üç damla DPBS ekleyin. Yumurtayı inkübasyonun dördüncü gününe kadar inkübatöre geri yerleştirmeden önce pencereyi büyük bir şeffaf bant parçasıyla dikkatlice kapatın. Kavisli disseksiyon makası ile bandı pencereden kesin.Yumurtayı bir lastik tutucu veya yumurta kartonu üzerine diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. Tavuk embriyosu şu anda Hamburger-Hamilton Aşama 23 ila 24'te ve sağ tarafı izleyiciye bakacak şekilde sol tarafında uzanıyor. Embriyonun sağ kanadını ve bacak tomurcuğunu bulun, çünkü koelom bu iki uzuv tomurcuğu arasında değerlendirilecektir.Sağ kanat ve bacak tomurcuğu arasındaki alanda, vitelin zarında, koryonda ve amniyonda, iki çift disseksiyon forseps ile tutarak ve yavaşça zıt yönlere çekerek ardışık olarak bir açıklık oluşturun. Koelomik boşluğa engelsiz erişim olup olmadığını kontrol edin. Bir çift disseksiyon forseps ile kanat ve uzuv tomurcuğu arasındaki vücut duvarının kenarını yavaşça tutun ve izleyiciye doğru hafifçe çekin.Koelomik boşluk açıkça görülebilmelidir. Koelomik boşluğa künt ama ince bir aleti dikkatlice yerleştirin. Bir dura dissektörü kullanarak allantozun üzerine yumurtanın içine yarım organoid yerleştirin.Diseksiyon forsepslerini kullanarak, vücut duvarının kenarını dikkatlice tutun ve kolumun açıklığını görünür kılmak için izleyiciye doğru hafifçe çekin. Organoidi vücut duvarındaki açıklığa doğru ve içinden yavaşça künt bir tungsten tel ve bir mikro neşter tutucu ile coelum'a doğru hareket ettirin. Organoidi kolumun içine yerleştirmek için hafifçe kraniyal olarak itin.Artık kanat tomurcuğunun hemen arkasında görülebilir. Plastik bir transfer pipeti kullanarak yumurtaya üç damla DPBS ekleyin. Yumurtayı inkübasyonun 12. gününe kadar inkübatöre geri yerleştirmeden önce pencereyi büyük bir şeffaf bant parçasıyla dikkatlice kapatın.Kavisli disseksiyon makası ile bandı pencereden kesin. Yumurtayı bir lastik tutucuda diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. Vaskülatürü değerlendirin ve arterlerden biraz daha parlak kırmızı renkleriyle ayırt edilebilen damarları bulun.Vaskülatüre erişimi iyileştirmek için, pencereyi kavisli diseksiyon makası ile keserek dikkatlice büyütün. Damarı seçtikten sonra, mikro kılcal iğnenin ucunu sıfır ila 20 derecelik bir açıyla damarın içine yerleştirin. Ucu yavaşça bir yandan diğer yana hareket ettirerek iğnenin damarda olduğundan emin olun.Lens culinaris agglutinin enjekte etmek için enjeksiyon sistemine nazikçe ve istikrarlı bir şekilde üfleyin. Ve yumurtayı dolaşımına izin vermek için 10 dakika boyunca inkübatöre geri yerleştirin. Yumurtayı banktaki lastik bir tutucuya yerleştirin.Ardından, embriyoyu çevreleyen zarları kavisli diseksiyon makası ile kesin. Embriyoyu delikli bir kaşıkla yumurtadan çıkarın ve hemen makas kullanarak embriyonun kafasını kesin. Diseksiyon mikroskobu altında, embriyonun vücudunu bir Petri kabına yerleştirin.Embriyoyu Petri kabına sırt üstü yerleştirin ve uzuvlarını yayın. Forseps kullanarak embriyonun karın duvarını uzunlamasına eksen boyunca dikkatlice açın. Embriyonun içindeki organoidi bulun.Organoid en sık sağ karaciğer lobuna ya coddle ucunda ya da kraniyal olarak, göğüs kafesinin hemen altında bağlanır. Bu nedenle, bu konumlara bakarak başlamanız önerilir. Organoid yerleştirildikten sonra, mikro makasla etrafını keserek embriyodan çıkarın.Organoidi, diseksiyon mikroskobu altında kaçınılmaz olarak bir Petri kabına tutturulmuş tavuk dokusuna yerleştirin. İki ucu keskin paslanmaz çelik tıraş bıçağı ile mümkün olduğunca fazla tavuk dokusunu çıkarın. Transplante edilmemiş bir böbrek organoidinin ve nakledilen bir böbrek organoidinin immünofloresan görüntüleri, glomerüler ve tübüler yapılar içerir.Nakledilmemiş organoidlerde, bazı insan endotel hücreleri bulunur. Nakledilen organoidde, organoid boyunca perfüze edilmiş bir vasküler ağ görülebilir. Kutulu alanların büyütülmüş görüntüleri, nakledilen organoidlerde ayırt edilebilen üç tip endotel hücresini göstermektedir: perfüze edilmiş insan endotel hücreleri, perfüze edilmemiş insan endotel hücreleri ve perfüze edilmiş tavuk türevi endotel hücreleri.Nakledilmemiş organoidlerde, endotel hücreleri glomerüler yapıları çevreler, ancak onları istila etmez. Bununla birlikte, transplante edilen organoidlerde, glomerüler yapılar perfüze kılcal damarlar tarafından vaskülarize edilir. Nakledilen organoidler, deneyin amacına bağlı olarak farklı teknikler kullanılarak analiz edilebilir.Nakil yapılmamış kontrollerle doğrudan karşılaştırma, vaskülarizasyon ve olgunlaşma süreci hakkında fikir verebilir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

ChickGFP Nöral Tüp Greftleme ve Karbosiyanine Boya DiI Enjeksiyonu Kullanılarak Tavuk Embriyoları İçinde Nöral Kret Hücrelerinin ve Kan Damarlarının Çift Etiketlenimi

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Elektroporasyon ve Kimyasal Reaktif tedaviler için Tavuk Embriyolar gelen bütün Retina Eksplantlarındaki

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Gelişmekte olan mikroenjeksiyon Hedef Tekniği<em&gt; Xenopus</em&gt; Böbrek

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

Etkin Bir Yöntem Dediferansiye Yağ Hücreleri Elde

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Tavuk İşitsel Beyinsapındaki Ovo Elektroporasyonunda

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tüm fare embriyo etkinliğinde β-galaktozidaz tespiti yoluyla Gen ifadesinin izleme

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Düğüm ve Notochordal plaka Gastrulating fare embriyo Tarama elektron mikroskobu ve bütün Dağı ayirt kullanarak görselleştirme

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

MRNA Electroporation kullanarak Avian embriyoları çoklu proteinlerin hızlı ve verimli Ifade

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Böbrek Organoidleri Üretmek için Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Kidney organoids generated from hPSCs have provided an unlimited source of renal tissue. Human kidney organoids are an invaluable tool for studying kidney ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Zebra Balığı Embriyoları İçin Basit ve Etkili Bir Transplantasyon Cihazı

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...