Name: a simple technique to assay locomotor activity in drosophila
Uploaded: 2023-02-24T14:00:00
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この研究は、東呉大学と中国国家科学財団(NSFC)(82171414)からの特別打ち上げ基金によって支援されました。Chunfeng Liu教授の研究室メンバーの議論とコメントに感謝します。

W1118 成虫のハエと3齢幼虫を本研究に用いた。
1. 実験準備
注: ショウジョウバエ の移動追跡のためのオープンフィールドアリーナは、無色無臭のシリカゲルで作られています。
<ol><li>試薬Aと試薬Bを、シリカキットの製造元の説明書に従って1:10の比率で混合します( 材料表を参照)。色が白に変わるまで...

<ol>
	<li>Ham, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+UCHL1+rescues+the+defects+related+to+Parkinson's+disease+by+suppressing+glycolysis.">Loss of UCHL1 rescues the defects related to Parkinson's disease by suppressing glycolysis.</a> Science Advances. 7 (28), (2021).</li><li>Algarve, T. D., Assmann, C. E., Aigaki, T., da Cruz, I. B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parental+and+preimaginal+exposure+to+methylmercury+disrupts+locomotor+activity+and+circadian+rhythm+of+adult+Drosophila+melanogaster.">Parental and preimaginal exposure to methylmercury disrupts locomotor activity and circadian rhythm of adult Drosophila melanogaster.</a> Drug and Chemical Toxicology. 43 (3), 255-265 (2020).</li><li>Jones, M. 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U., Prashanth, K. V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotenone+mediated+developmental+toxicity+in+Drosophila+melanogaster.">Rotenone mediated developmental toxicity in Drosophila melanogaster.</a> Environmental Toxicology and Pharmacology. 93, 103892 (2022).</li><li>Gulyas, M., Bencsik, N., Pusztai, S., Liliom, H., Schlett, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AnimalTracker:+an+ImageJ-based+tracking+API+to+create+a+customized+behaviour+analyser+program.">AnimalTracker: an ImageJ-based tracking API to create a customized behaviour analyser program.</a> Neuroinformatics. 14 (4), 479-481 (2016).</li><li>Qu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EasyFlyTracker:+a+simple+video+tracking+Python+package+for+analyzing+adult+Drosophila+locomotor+and+sleep+activity+to+facilitate+revealing+the+effect+of+psychiatric+drugs.">EasyFlyTracker: a simple video tracking Python package for analyzing adult Drosophila locomotor and sleep activity to facilitate revealing the effect of psychiatric drugs.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 15, 809665 (2022).</li><li>Yarwais, Z. H., Najmalddin, H. O., Omar, Z. J., Mohammed, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+data+collection+of+Drosophila+movement+behaviour+assays+using+computer+vision+in+Python.">Automated data collection of Drosophila movement behaviour assays using computer vision in Python.</a> International Journal of Innovative Approaches in Science Research. 4 (1), 15-22 (2020).</li></ol>

フィジーの画像処理プログラムと互換性のあるオープンソースの AnimalTracker APIに基づいて、研究者が成虫と個々の幼虫の両方のハエを追跡することにより、自発運動活動を体系的に評価できるようにする方法を設計しました。 AnimalTracke はJavaで書かれたツールであり、既存のデータベースや他のツールに簡単に統合して、アプリケーションで設計された動物の追跡行動の分析を?...

ショウジョウバエメラノガスターは、遺伝子改変1、薬物治療2、老化3によって作成された神経疾患モデルにおける細胞および分子機能を調べるための優れたモデル生物を提供します。ヒトとショウジョウバエの間の生物学的経路、物理的特性、および疾患関連ホモログ遺伝子の高い保存により、ショウジョウバエは分子レベルから行動レベル4までの理想的な模倣になります。多くの疾患モデルにおいて、行動不全は重要な指標であり、さまざまなヒトニューロパシーに有用なモデルを提供します5,6。ショウジョウバエは現在、複数のヒト疾患、神経発達、およびパーキンソン病や筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患の研究に使用されています7,8。疾患モデルの運動能力を検出することは、病原性の進行を理解するために重要であり、疾患プロセスの根底にある分子メカニズムとの表現型の相関関係を提供する可能性があります。
最近、市販のソフトウェアツールと費用対効果の高いプログラムが、グループ化されたハエ9,10でのハイスループットテストやリアルタイムでの移動の測定11,12など、ショウジョウバエの自発運動検出戦略のために開発されました。そのような従来のアプローチの1つは、クライミングアッセイとも呼ばれる迅速なインタラクティブネガティブジオタキシス(RING)であり、同じ性別と年齢の大規模なハエの個体群を封じ込めることを可能にする複数のチャネルを含み、データ収集中の変動を減らします9,13。自発運動挙動を分析するための別の事前試験方法は、TriKinetics ショウジョウバエ活動モニタ(DAM)であり、これは、薄いガラス管14内のハエ活動運動を検出するために複数のビームを使用する装置である。この装置は、位置を連続的に記録し、これは、より長い期間にわたるハエの活動および概日リズムを研究するためにビーム交差を計算することによって自動移動を表す15。これらの方法は、ショウジョウバエの行動欠陥を分析して行動移動の変化を決定する際に広く使用されてきましたが、常に特別な試験装置または複雑な分析プロセスが必要であり、限られた単純な装置で一部のモデルでは適用が制限されています。FlyGrAM11やショウジョウバエアイランドアッセイ10など、成虫のショウジョウバエをテストするための動物追跡グループベースの戦略は、事前定義された領域で社会的募集と個々の追跡を実装します。それにもかかわらず、反抗された地域での社会的個人的制限は、ハエの衝突または重なりによって引き起こされる画像内の識別に悪影響を与える可能性があります。TRex16、MARGO 12、FlyPi17などのオープンソースのマテリアルベースの方法には緊急事態がありますが、行動テストで柔軟に使用することで、ハエを迅速に追跡できます。これらのテストアプローチは、精巧な実験装置の設置、特別なソフトウェア要件、またはプロのコンピューター言語に関連しています。幼虫の場合、単位時間18あたりのグリッド境界線の数を横切って移動した総距離を測定するか、または個人の体壁収縮を手動で大まかに数えること19は、自発運動能力を評価するための主要な方法です。機器や装置、分析方法の精度が不足しているため、幼虫の行動移動が検出を逃れ、行動運動、特に微細な動きを正確に評価することが困難になる可能性があります15。
本開発手法は,画像処理プログラム「フィジー(ImageJ)」と互換性のあるアプリケーションプログラミングインターフェース(API) AnimalTracker を利用し,高精細(HD)映像からハエの追跡行動を解析し,成虫と仔魚の運動活動を系統的に評価する手法である.フィジーはオープンソースソフトウェアです ImageJディストリビューション 堅牢なソフトウェアライブラリと多数のスクリプト言語を組み合わせることができるため、画像処理アルゴリズムのラピッドプロトタイピングが可能になり、画像分析機能で生物学者の間で人気があります20。現在のアプローチでは、フィジーの AnimalTracker APIへの統合を利用して、パーソナライズされたアルゴリズム挿入を備えた独自の ショウジョウバエ 行動アッセイを開発し、自発運動行動の堅牢な分析機能をサポートするための詳細なドキュメントとチュートリアルの有用なステップを提供します(図1)。ハエの衝突または重なりによって引き起こされる画像内の客観的識別の複雑さを回避するために、各アリーナは1つのハエのみをホストするように制限されています。アプローチの追跡精度を評価した上で、パーキンソン病の動物モデルに一般的に使用されている毒性薬物ロテノンを投与された ショウジョウバエ の運動運動を追跡および定量化するために実施され、最終的に薬物治療における移動障害を発見した21。オープンソースでフリーなソフトウェアを採用したこの方法論は、高コストの計測を必要とせず、 ショウジョウバエ の行動運動を正確かつ再現性よく解析することができます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Animal tracker</td>
			<td>Hungarian Brain Research Program</td>
			<td>version: 1.7</td>
			<td>pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>version: 2021.105.10.0</td>
			<td>built-in windows 10 system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>DELL</td>
			<td>Vostro-14-5480</td>
			<td>a comupter running win 10 system is available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila carbon dioxide anesthesia workstation</td>
			<td>Wu han Yihong technology</td>
			<td>#YHDFPCO2-018</td>
			<td>official website: http://www.yhkjwh.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td>Fiji team</td>
			<td>version: 1.53v</td>
			<td>official website: https://fiji.sc/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Format factory software</td>
			<td>Pcfreetime</td>
			<td>version: X64 5.4.5</td>
			<td>official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph pad prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>version: 8.0.2</td>
			<td>official website: https://www.graphpad-prism.cn</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hight definition camera</td>
			<td>TTQ</td>
			<td>Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm)</td>
			<td>official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Office software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>version: office 2019</td>
			<td>official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Bkman</td>
			<td>110301003</td>
			<td>size: 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>DOW</td>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Mix well according to the instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>#144-55-8</td>
			<td>Mix well with silica gel</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple technique to assay locomotor activity in drosophila

ショウジョウバエは 、高度な遺伝子操作技術が豊富で、多様な行動特徴があるため、さまざまな疾患を研究するための理想的なモデル生物です。動物モデルにおける行動不全の特定は、例えば、患者が運動機能の障害を経験することが多い神経変性疾患において、疾患の重症度の重要な尺度である。しかし、薬物治療やトランスジェニック個体など、ハエモデルの運動障害を追跡および評価するためのさまざまなシステムが利用できるため、複数の角度から正確に評価するための経済的でユーザーフレンドリーなシステムはまだ不足しています。ここでは、フィジーの画像処理プログラムと互換性のある AnimalTracker アプリケーションプログラミングインターフェース(API)に基づく手法を開発し、記録されたビデオから成虫と幼虫の両方の個体の移動活動を体系的に評価し、追跡行動の分析を可能にします。この方法は、行動を記録および分析するために高解像度カメラとコンピューター周辺機器の統合のみを必要とするため、トランスジェニックまたは環境行動障害のあるハエモデルをスクリーニングするための手頃な価格で効果的なアプローチになります。薬理学的に処理されたハエを用いた行動試験の例を挙げて、成虫のハエと幼虫の両方の行動変化を再現性の高い方法で検出する方法を示します。

本研究では、ロテノンで処理された成虫のハエと3齢幼虫の自発運動障害を調べ、薬物溶媒ジメチルスルホキシド(DMSO)を与えられた対照ハエの運動活動と比較しました。ショウジョウバエにおけるロテノンによる治療は、脳22においてドーパミン作動性ニューロン喪失を引き起こし、重大な自発運動障害23を引き起こすことが示されている。図<strong cla...

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A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

本プロトコルは、オープンソースソフトウェアフィジーを使用して手作りのアリーナでのハエの動きを追跡および分析することにより、ショ ウジョウバエ の自発運動を評価し、高解像度ビデオ録画に基づいて各フレームのピクセルをセグメント化し、速度、距離などのパラメータを計算するプラグインと互換性があります。

ショウジョウバエの自発運動活性をアッセイする簡単な技術

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and ...

この方法は、オープンソースソフトウェアに基づいており、記録されたビデオから成虫と幼虫のハエの追跡行動について局所的な運動活動を体系的に評価します。この方法は、行動を記録および分析するための低コストのデバイス統合を必要とするため、ハエの移動をスクリーニングするための手頃な価格で効果的なアプローチになります。この技術は、局所運動障害のあるヒト疾患のハエモデルにおける行動変容の同定に用いられているが、疾患、障害、困難の治療には適していない。分析プロセス中に関連するビデオウィンドウ、つまり元のビデオウィンドウと処理中のビデオウィンドウをクリアすることが不可欠です。まず、製造元の指示に従って、シリカキットの試薬Aと試薬Bを1対10の比率で混合し、ショウジョウバエの移動追跡用のオープンフィールドアリーナを準備します。次に、HDカメラを三脚にセットし、カメラのレンズがシリカアリーナの表面に垂直になるように調整します。次に、フィジーでビデオを開きます。進行状況バーを最初のフレームにドラッグし、暗黙のうちに承認します。フリーハンド選択ツールを使用してフライの全身を選択します。画像、調整、明るさとコントラストをクリックして、選択した領域のグレー値が広い背景に近づくまでホワイトバランスを調整します。麻酔をかけたフライをオープンフィールドアリーナに移します。ハエが麻酔から回復したら、ハエと一緒にアリーナディッシュをカメラの下に置き、左右にすばやく振って、記録の開始時にハエが動いていることを確認します。カメラアプリケーションの録画ボタンを押して、ビデオ録画を開始します。録画が完了したら、停止ボタンを押してビデオ録画を終了します。録画したビデオをMJ異教徒コーディングでAVI形式に変換して、フィジーを使用して開いて分析できるようにします。また、ビデオのフレーム/秒を、成虫のハエの場合は15 fps、幼虫の場合は12 fpsに設定します。フィジーでビデオを開くには、ポップアップウィンドウで2つのオプションを選択し、仮想スタックを使用してグレースケールに変換します。動物トラッカープラグインのアクティブな画像の設定ツールを使用して処理ウィンドウを取得し、楕円形ツールを使用して元のビデオウィンドウのアリーナを一周する追跡領域を作成します。処理ウィンドウの最初の空白フレームのフィルターと 2 つのフィルターのパラメーターを設定します。次に、元のビデオウィンドウの次のフレームを選択し、処理ウィンドウのフィルタリングされたサーフェスを選択します。フィルタリングされた処理ウィンドウを選択したら、[しきい値の設定]ツールを使用して、処理ウィンドウで覆われた赤いプロファイルでトラクトフライを回転させます。次に、set blob 検出器を使用して、処理ウィンドウで覆われた赤いプロファイルでハエをコンピューターに認識させます。テキスト原稿に記載されているように、成虫のハエまたは幼虫の最後のフレームを設定します。BLOB の表示ツールを使用して、元のビデオ ウィンドウに追跡用の四角形を表示します。追跡を開始し、監視が完了したら追跡ファイルをエクスポートします。動物トラッカーと追跡アナライザープラグインを使用して、追跡ファイルとゾーンファイルをロードします。ゾーン設定を使用して目的のインデックスを選択し、パラメーター設定を変更します。フレームレートを使用してフレーム間隔の時間を計算します。トラッキングアナライザーで分析した後、スプレッドシートソフトウェアとグラフパッドプリズムを使用して定量分析チャートを作成します。トラックファイルを開きます。すべての座標を Microsoft Office Excel にコピーし、スペース キーを使用してセルを分割します。フレーム間隔あたりの不動時間を計算するには、すべての計算結果を選択し、縦棒グラフを挿入して、縦棒グラフ全体の余白で不動時間を視覚的に表示します。方向角度の変化を示すには、すべての計算結果を選択し、散布図を挿入します。ロテノンで処理された成虫のハエと3齢幼虫は、溶媒DMSOを与えられた対照のハエと比較して有意な自発運動障害を持っていました。成虫のロテノン処理の定量分析では、移動距離と平均速度の有意な減少が示されました。そして、不動時間の大幅な増加。代表的なグラフは、対照のものと比較して、ロテノンを給餌したハエのフレーム間隔あたりの移動速度のピークが少ないことを示し、自発運動活動障害の重症度を示しています。フレームあたりの移動ピクセルの制度的不動列も、対照ハエと比較して、ロテノン給餌ハエの1分以内の動きが有意に少ないことを示しました。ロテノン給餌動物および対照動物における移動方向角変化を示す代表的なグラフも、ハエが選択した方向の変化を明らかにした。同様の結果は、3齢幼虫についても観察されました。その結果、ロテノンを給餌した追跡幼虫の行動運動は、対照と比較して著しく損なわれていることが明らかになりました。分析プロセスの最も重要なステップは、ソフトウェアが効果的にチェックできるかどうかを証明するため、最初の空白フレームを形成することです。この技術により、研究者は神経や筋肉の損傷などの複数の欠陥の根底にあるメカニズムをより深く掘り下げることができます。

Research

JoVE Journal

Behavior

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

Mouse Short- and Long-term Locomotor Activity Analyzed by Video Tracking Software

ビデオトラッキングソフトウェアによって分析されるマウスの短期および長期の自発運動

Locomotor  activity (LMA) is a simple and easily performed measurement of behavior in mice  and other rodents. Improvements in video tracking software ...

Uncovering Beat Deafness: Detecting Rhythm Disorders with Synchronized Finger Tapping and Perceptual Timing Tasks

ビート難聴を暴く：同期指タッピングと知覚タイミングタスクを検出リズム障害

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Behavioral and Locomotor Measurements Using an Open Field Activity Monitoring System for Skeletal Muscle Diseases

骨格筋の病気のためにオープンフィールドアクティビティ·モニタリングシステムを用いた行動と自発運動の測定

The open field activity monitoring system comprehensively assesses locomotor and behavioral activity levels of mice. It is a useful tool for assessing ...

Use of the Open Field Maze to Measure Locomotor and Anxiety-like Behavior in Mice

マウスにおける自発運動と不安様行動を測定するために、オープンフィールド迷路の利用

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The Treadmill Fatigue Test: A Simple, High-throughput Assay of Fatigue-like Behavior for the Mouse

トレッドミル疲労試験：マウスの​​疲労のような挙動のシンプルな、ハイスループットアッセイ

Fatigue is a prominent symptom in many diseases and disorders and reduces quality of life for many people. The lack of clear pathogenesis and failure of ...

Using a Split-belt Treadmill to Evaluate Generalization of Human Locomotor Adaptation

分割トレッドミルを使用した運動適応の一般化の評価

Understanding the mechanisms underlying locomotor learning helps researchers and clinicians optimize gait retraining as part of motor rehabilitation. ...

A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster

A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster

環境内の交信が交配行動に及ぼす影響を調べる方法<em&gt;ショウジョウバエmelanogaster</em

An individual's sexual drive is influenced by genotype, experience and environmental conditions. How these factors interact to modulate sexual behaviors ...

A Computational Method to Quantify Fly Circadian Activity

フライの日周期活動を定量化する手法

In most animals and plants, circadian clocks orchestrate behavioral and molecular processes and synchronize them to the daily light-dark cycle. ...

Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

多色 FlpOut 技術の高分解能単一細胞の形態とショウジョウバエにおけるグリア細胞の細胞間相互作用の研究への応用

Cells display different morphologies and complex anatomical relationships. How do cells interact with their neighbors? Do the interactions differ between ...

A Simple and Low-cost Assay for Measuring Ambulation in Mouse Models of Muscular Dystrophy

筋ジストロフィーのマウス ・ モデルで歩行を測定するためのシンプルで低コスト分析

Measuring functional outcomes in the treatment of muscular dystrophy is an essential aspect of preclinical testing. The assessment of voluntary ambulation ...