Name: a gmp-compliant procedure for the generation of gene-modified t cells
Uploaded: 2023-10-06T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A GMP-Compliant Procedure for the Generation of Gene-Modified T cells at JoVE.com

تم تمويل هذا البحث من قبل الاتحاد الأوروبي والصناديق الوطنية اليونانية من خلال البرنامج التشغيلي للقدرة التنافسية وريادة الأعمال والابتكار ، تحت دعوة RESEARCH - CREATE - INNOVATE (رمز المشروع: T2EDK - 00474). نود أيضا أن نعرب عن امتناننا لمؤسسة Choose Life لتقديم الدعم المستمر لمختبر GMP "ديميتريس لويس" التابع لمعهد العلاج الخلوي.

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات بجامعة باتراس ومجلس المراجعة المؤسسية للمستشفى العام الجامعي في باتراس. قبل الحصول على العينات البيولوجية ، تم الحصول على الموافقة المستنيرة من الأفراد الأصحاء. تم إجراء تقييم أهلية المشاركين وفقا للإجراءات المؤسسية وبما يتوافق مع معا...

<ol>
	<li>Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).</li><li>Brentjens, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra38 (2013).</li><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li><li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li><li>Schuster, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+remissions+following+chimeric+antigen+receptor+modified+T+cells+directed+against+CD19+(CTL019)+in+patients+with+relapsed+or+refractory+CD19++lymphomas.">Sustained remissions following chimeric antigen receptor modified T cells directed against CD19 (CTL019) in patients with relapsed or refractory CD19+ lymphomas.</a> Blood. 126 (23), 183 (2015).</li><li>Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+manufacturing+of+CAR+T+cell+therapy.">Global manufacturing of CAR T cell therapy.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 4, 92-101 (2017).</li><li>Wang, X., Rivi&#232;re, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+manufacturing+of+CAR+T+cells:+foundation+of+a+promising+therapy.">Clinical manufacturing of CAR T cells: foundation of a promising therapy.</a> Molecular Therapy - Oncolytics. 3, 16015 (2016).</li><li>Iancu, E. M., Kandalaft, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+advantages+of+cell+therapy+manufacturing+under+Good+Manufacturing+Practices+within+the+hospital+setting.">Challenges and advantages of cell therapy manufacturing under Good Manufacturing Practices within the hospital setting.</a> Current Opinion in Biotechnology. 65, 233-241 (2020).</li><li>Kaiser, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+commercial+process+for+the+manufacture+of+genetically+modified+T+cells+for+therapy.">Towards a commercial process for the manufacture of genetically modified T cells for therapy.</a> Cancer Gene Therapy. 22 (2), 72-78 (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+on+quality,+non-clinical+and+clinical+aspects+of+medicinal+products+containing+genetically+modified+cells.">Guidelines on quality, non-clinical and clinical aspects of medicinal products containing genetically modified cells.</a> European Medicines Agency. , (2020).</li><li>Castella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point-of-care+CAR+T-Cell+production+(ARI-0001)+using+a+closed+semi-automatic+bioreactor:+experience+from+an+academic+phase+I+clinical+trial.">Point-of-care CAR T-Cell production (ARI-0001) using a closed semi-automatic bioreactor: experience from an academic phase I clinical trial.</a> Frontiers in Immunology. 11, 482 (2020).</li><li>Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviruses+as+gene+transfer+agents+for+delivery+to+non-dividing+cells.">Lentiviruses as gene transfer agents for delivery to non-dividing cells.</a> Current Opinion in Biotechnology. 9 (5), 457-463 (1998).</li><li>Ausubel, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+CGMP-grade+lentiviral+vectors.">Production of CGMP-grade lentiviral vectors.</a> Bioprocess International. 10 (2), 32-43 (2012).</li><li>Van der Loo, J. C. M., Wright, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+challenges+in+viral+vector+manufacturing.">Progress and challenges in viral vector manufacturing.</a> Human Molecular Genetics. 25 (R1), R42-R52 (2016).</li><li>Rad, S. M. . A. H., Poudel, A., Tan, G. M. Y., McLellan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+choice:+Who+should+drive+the+CAR+in+T+cells.">Promoter choice: Who should drive the CAR in T cells.</a> PLoS One. 15 (7), e0232915 (2020).</li><li>Sandrin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+pseudotyped+with+a+modified+RD114+envelope+glycoprotein+show+increased+stability+in+sera+and+augmented+transduction+of+primary+lymphocytes+and+CD34++cells+derived+from+human+and+nonhuman+primates.">Lentiviral vectors pseudotyped with a modified RD114 envelope glycoprotein show increased stability in sera and augmented transduction of primary lymphocytes and CD34+ cells derived from human and nonhuman primates.</a> Blood. 100 (3), 823-832 (2002).</li><li>Costello, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+stimulated+and+unstimulated+T+lymphocytes+by+HIV-1-derived+lentiviral+vectors.">Gene transfer into stimulated and unstimulated T lymphocytes by HIV-1-derived lentiviral vectors.</a> Gene Therapy. 7 (7), 596-604 (2000).</li><li>Radek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vectofusin-1+improves+transduction+of+primary+human+cells+with+diverse+retroviral+and+lentiviral+pseudotypes,+enabling+robust,+automated+closed-system+manufacturing.">Vectofusin-1 improves transduction of primary human cells with diverse retroviral and lentiviral pseudotypes, enabling robust, automated closed-system manufacturing.</a> Hum Gene Therapy. 30 (12), 1477-1493 (2019).</li><li>Hanenberg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+retrovirus+and+target+cells+on+specific+fibronectin+fragments+increases+genetic+transduction+of+mammalian+cells.">Colocalization of retrovirus and target cells on specific fibronectin fragments increases genetic transduction of mammalian cells.</a> Nature Medicine. 2 (8), 876-882 (1996).</li><li>Lamers, C. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retronectin-assisted+retroviral+transduction+of+primary+human+T+lymphocytes+under+good+manufacturing+practice+conditions:+tissue+culture+bag+critically+determines+cell+yield.">Retronectin-assisted retroviral transduction of primary human T lymphocytes under good manufacturing practice conditions: tissue culture bag critically determines cell yield.</a> Cytotherapy. 10 (4), 406-416 (2008).</li><li>O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+spinoculation+enhances+infection+through+virus+binding.">Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding.</a> Journal of Virology. 74 (21), 10074-10080 (2000).</li><li>Cieri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7+and+IL-15+instruct+the+generation+of+human+memory+stem+T+cells+from+naive+precursors.">IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors.</a> Blood. 121 (4), 573-584 (2013).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+(CAR-T)+cells+expanded+with+IL-7/IL-15+mediate+superior+antitumor+effects.">Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects.</a> Protein Cell. 10 (10), 764-769 (2019).</li><li>Ghassemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+manufacturing+of+non-activated+potent+CAR+T+cells.">Rapid manufacturing of non-activated potent CAR T cells.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (2), 118-128 (2022).</li><li>Wang, R. -. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protocols+for+&#947;&#948;+T+cell+expansion+and+lentiviral+transduction.">Optimized protocols for &#947;&#948; T cell expansion and lentiviral transduction.</a> Molecular Medicine Reports. 19 (3), 1471-1480 (2019).</li><li>Yuan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+and+optimization+of+protocols+for+producing+recombinant+lentivirus+carrying+the+anti-Her2+chimeric+antigen+receptor+gene.">Comparative analysis and optimization of protocols for producing recombinant lentivirus carrying the anti-Her2 chimeric antigen receptor gene.</a> The Journal of Gene Medicine. 20 (7-8), e3027 (2018).</li><li>Zhu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closed-system+manufacturing+of+CD19+and+dual-targeted+CD20/19+chimeric+antigen+receptor+T+cells+using+the+CliniMACS+Prodigy+device+at+an+academic+medical+center.">Closed-system manufacturing of CD19 and dual-targeted CD20/19 chimeric antigen receptor T cells using the CliniMACS Prodigy device at an academic medical center.</a> Cytotherapy. 20 (3), 394-406 (2018).</li><li>Mock, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+manufacturing+of+chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+adoptive+immunotherapy+using+CliniMACS+Prodigy.">Automated manufacturing of chimeric antigen receptor T cells for adoptive immunotherapy using CliniMACS Prodigy.</a> Cytotherapy. 18 (8), 1002-1011 (2016).</li></ol>

تعتبر ناقلات الفيروسات العدسية كمركبات لتوصيل الجينات أدوات مهمة في مجال العلاج بالخلايا والجينات بسبب قدرتها على تحويل كل من الخلايا المنقسمة وغير المنقسمة12. ومع ذلك ، لا يزال الإنتاج الواسع النطاق للنواقل الفيروسية العدسية باستخدام طرق متوافقة مع GMP يمثل تحديا بسبب المعل?...

أدى ظهور علاجات الخلايا المتبنية (ACT) والخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CAR) إلى إحداث تحول ثوري في الممارسة السريرية الحديثة ، مما أدى إلى إنشاء نموذج جديد للطب الشخصي. على وجه الخصوص ، أظهرت الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية التي تستهدف CD19 استجابات سريرية استثنائية وتمثل العلاج بالخلايا التائية الأكثر تقدما لأورام الخلايا البائيةالخبيثة 1،2،3،4،5. ومع ذلك ، فإن علاجات الخلايا التائية المعدلة جينيا التجارية الحالية تعتمد بشكل كبير على النواقل الفيروسية لنقل الجينات. يمثل تنفيذ النواقل الفيروسية في ACT ، خاصة في ظل ظروف ممارسات التصنيع الجيدة (GMP) في إطار أكاديمي ، تحديات كبيرة بسبب قيود قابلية التوسع ، ومتطلبات المعدات المتخصصة ، والحاجة إلى موظفين ذوي مهارات عالية ، واستخدام الكواشف المتوافقة مع GMP لإنتاج الجسيمات الفيروسية بوساطة البلازميد6،7،8.
وبالتالي ، فإن عملية تصنيع علاجات الخلايا التائية المعدلة جينيا معقدة وتبدأ عادة بعزل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) من منتج فصادة الكريات البيض. غالبا ما يتم إثراء الخلايا التائية من تجمع PBMC وتنشيطها باستخدام المجمعات الدقيقة المضادة ل CD3 / CD28 7,9. بعد ذلك ، يتم تعديل الخلايا التائية وراثيا باستخدام ناقلات فيروسية أو غير فيروسية ، والتي يمكن إنتاجها في الموقع أو الاستعانة بمصادر خارجية. للحصول على أعداد الخلايا المطلوبة للتسريب ، يتم توسيع الخلايا المعدلة جينيا قبل الصياغة النهائية و / أو الحفظ بالتبريد. أخيرا ، يجب أن يفي منتج الخلية بمعايير الإطلاق المختلفة بناء على فحوصات مراقبة الجودةالمتعددة 9.
يقدم هذا البروتوكول منهجية شاملة تستخدم تقنيات بسيطة للتلاعب خارج الجسم الحي ل PBMCs الصحية لتصنيع منتج الخلايا التائية المعدلة جينيا في ظل ظروف متوافقة مع GMP. يتضمن البروتوكول استخدام ناقل عدسي فيروسي ، والذي يمكن الاستعانة بمصادر خارجية لشركة إنتاج فيروسي توفر جميع الاختبارات الكمية / الوظيفية والنقاء والسلامة اللازمة (على سبيل المثال ، العيار الفيروسي ، والكشف عن الفيروس العدسي المختص بتكرار الحمض النووي للخلية المضيفة). بالنسبة لهذه الدراسة ، فإن الناقل المستخدم هو ناقل فيروسي عدسي من الجيل الثاني قائم على VSV-g (بروتين فيروس التهاب الفم الحويصلي G) مع بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) ، باعتباره الجين محل الاهتمام ، في التعبير التأسيسي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well TC-treated plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL FACS tube&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Greiner biomedica</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well TC-treated plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-AAD</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS CANTO II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>V96300084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counter&#160;</td>
			<td>Corning Cell Cytosmart</td>
			<td>J21E0081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>Greiner biomedica</td>
			<td>122263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Buffer (1x D-PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software v10.6.2&#160;</td>
			<td>TreeStar Inc</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco CTS Opti-MEM I Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A4124801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP rhIL-15</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>170-076-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP rhIL-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>170-076-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP rhIL-7</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>170-076-111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPA Whitley H35 Hypoxystation</td>
			<td>Don Whitley Scientific</td>
			<td>HA0315172H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin (HSA)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>B05AA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Junior LB 9509 Portable Luminometer</td>
			<td>Berthold Technologies</td>
			<td>6506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X Provirus Quantitation Kit</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS GMP T cell TransAct</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>170-076-156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human&#160; CD3 (Clone: UCHT-1)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Plus Detection kit</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>LT07-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm ultra-expandable closing film tape 5 cm x 75 m</td>
			<td>D.Dutscher</td>
			<td>90261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PeriStem PS-650-DB (apheresis bag)</td>
			<td>Biomed Device</td>
			<td>SC00816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planer Kryo10 Series III</td>
			<td>Planer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>Greiner biomedica</td>
			<td>658175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue, 0.4% solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectofusin-1 GMP</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>170-076-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVOTM 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>A1048501</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a gmp-compliant procedure for the generation of gene-modified t cells

تم إحداث ثورة في مجال العلاج بالخلايا بالتبني (ACT) من خلال تطوير الخلايا المعدلة وراثيا ، وتحديدا الخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CAR). أظهرت هذه الخلايا المعدلة استجابات سريرية ملحوظة في المرضى الذين يعانون من الأورام الخبيثة الدموية. ومع ذلك ، فإن التكلفة العالية لإنتاج هذه العلاجات وإجراء تقييمات شاملة لمراقبة الجودة قد حدت من إمكانية وصولها إلى مجموعة أوسع من المرضى. لمعالجة هذه المشكلة ، تستكشف العديد من المؤسسات الأكاديمية جدوى التصنيع الداخلي للخلايا المعدلة وراثيا ، مع الالتزام بالمبادئ التوجيهية التي وضعتها الوكالات التنظيمية الوطنية والدولية.
يمثل تصنيع منتجات الخلايا التائية المعدلة وراثيا على نطاق واسع العديد من التحديات ، لا سيما من حيث القدرات الإنتاجية للمؤسسة والحاجة إلى تلبية متطلبات كمية التسريب. ينطوي أحد التحديات الرئيسية على إنتاج ناقلات فيروسية واسعة النطاق بموجب إرشادات ممارسات التصنيع الجيدة (GMP) ، والتي غالبا ما يتم الاستعانة بمصادر خارجية لشركات خارجية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يساعد تبسيط عملية نقل الخلايا التائية في تقليل التباين بين دفعات الإنتاج ، وخفض التكاليف ، وتسهيل تدريب الموظفين. في هذه الدراسة ، نحدد عملية مبسطة لنقل الفيروسات العدسية للخلايا التائية البشرية الأولية مع علامة الفلورسنت كجين مهم. تلتزم العملية برمتها بالمعايير المتوافقة مع GMP ويتم تنفيذها داخل مؤسستنا الأكاديمية.

تقييم كفاءة النقل تم تقييم الخلايا المحولة للتعبير عن الجين محل الاهتمام (GFP) باستخدام قياس التدفق الخلوي. النتائج التمثيلية موضحة في الشكل 1. في اليوم 14 ، كان أكثر من 95٪ من الخلايا CD3 + ، مما يشير إلى نجاح تنشيط الخلايا التائية وتوسعها. تم قياس كفا...

Watch this Scientific Journal Video about A GMP-Compliant Procedure for the Generation of Gene-Modified T cells at JoVE.com

A GMP-Compliant Procedure for the Generation of Gene-Modified T cells

يحدد هذا البروتوكول عملية تحويل الخلايا التائية البشرية الأولية بجين مهم ، مما يضمن التوافق مع معايير ممارسات التصنيع الجيدة (GMP).

إجراء متوافق مع GMP لتوليد الخلايا التائية المعدلة جينيا

The field of Adoptive Cell Therapy (ACT) has been revolutionized by the development of genetically modified cells, specifically Chimeric Antigen Receptor ...

يصف هذا البروتوكول عملية مبسطة ومتوافقة مع GNP لتحويل الخلايا التائية الأولية البشرية مع الجينات ذات الأهمية. تم تصميم هذه التقنية الخاصة لتكون فعالة من حيث التكلفة ومتوافقة مع الناتج القومي الإجمالي دون استخدام منصات تصنيع النظام المغلق باهظة الثمن المتوفرة حاليا في العديد من المراكز الأكاديمية. يمكن تطبيق هذه الطريقة على توليد علاجات الخلايا المعدلة جينيا ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية ، والتي كانت نقلة نوعية لمعالجة الأورام الخبيثة الدموية.لعزل PBMC عن الخلايا التي تم جمعها بعد فصادة الكريات البيض في دم المتبرع ، قم بإجراء طرد مركزي متدرج الكثافة القائم على السكاريد للعينة ، مع الحفاظ على نسبة الكاشف إلى العينة 1: 2 ، عن طريق الطرد المركزي للخليط عند 800 جم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع إيقاف تشغيل الفرامل. ثم باستخدام micropipette ، وجمع PBMCs في أنبوب 50 ملليلتر نظيفة. اغسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني عن طريق الطرد المركزي.قبل تعليق الخلايا المغسولة في وسائط المكونة للدم الكاملة. تنشيط حوالي 20 مليون خلية تم الحصول عليها عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من كاشف تحفيز الخلايا التائية لكل 2 مليون خلية. بعد ذلك ، بعد إضافة interleukin-2 البشري المؤتلف بمعدل 20 وحدة لكل ملليلتر ، امزج المحلول برفق وانقله إلى صفيحة من ستة آبار.احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 72 ساعة قبل إجراء النقل الفيروسي. في اليوم الثالث ، انقل ثقافة الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر واخلطه جيدا. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 300 جرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لإزالة كاشف التنشيط.تخلص من المادة الطافية تماما وأعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من الوسط الكامل قبل عد الخلايا. اضبط حجم تعليق الخلية باستخدام وسيط كامل لتحقيق تركيز يسمح بطلاء 0.5 مليون خلية لكل بئر في لوحة 24 بئر. أضف إنترلوكين -7 البشري المؤتلف والإنترلوكين البشري المؤتلف -15 إلى الخلايا بتركيزات مناسبة.في أنبوب منفصل ، أضف الكمية المطلوبة من vectofusin-1 إلى وسط Opti-MEM ، مع الأخذ في الاعتبار الحجم الفيروسي النهائي الذي سيتم استخدامه. امزج هذا الخليط مع الفيروس المركز بنسبة واحد إلى واحد ، مما يضمن الخلط الشامل. بعد ذلك ، أضف الخليط الناتج الذي يحتوي على الفيروس إلى الخلايا.اضبط الحجم الكلي لكل بئر على 400 ميكرولتر باستخدام وسيط كامل إذا لزم الأمر. بعد تغطية اللوحة بغطاء ، أغلقها باستخدام فيلم بارافين قبل الطرد المركزي عند 1000 جرام لمدة ساعتين عند 32 درجة مئوية. احتضان اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.في اليوم التالي ، اجمع الخلايا واسحبها من كل بئر إلى أنبوب سعة 50 ملليلتر. بعد ذلك ، قم بطرد الخلايا عند 400 جرام ودرجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد إزالة المادة الطافية بعناية ، أعد تعليق الحبيبات بالكامل في ملليلتر واحد من الوسط الكامل قبل عد الخلايا.ثم اضبط تركيز الخلية مع الوسائط لتحقيق 1 مليون خلية لكل مليلتر وإضافة إنترلوكين 7 البشري المؤتلف وإنترلوكين 15 البشري المؤتلف عند 155 و 290 وحدة لكل مليلتر على التوالي قبل زراعة الخلايا. بمجرد الوصول إلى رقم الخلية المطلوب ، قم بحصاد الخلايا ونقلها إلى أنابيب سعة 50 ملليلتر وأجهزة الطرد المركزي الخاصة بها. بعد إزالة المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من الوسائط لحساب الخلايا.بعد الطرد المركزي مرة أخرى ، تخلص من المادة الطافية تماما وأعد تعليق الحبيبات في محلول حفظ بالتبريد يتكون من 50٪ HSA ، و 40٪ HBSS ، بتركيز 10 ملايين خلية لكل ملليلتر لكل قارورة تبريد. انقل 0.9 ملليلتر من معلق الخلية إلى الأعداد المطلوبة من قوارير التبريد ، وأضف 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد إلى كل قارورة تبريد. ضع قوارير التبريد على الثلج وقم بتحويلها بسرعة إلى مجمد معدل متحكم فيه للحفظ بالتبريد.ثم انقل العينات المحفوظة بالتبريد إلى خزان نيتروجين سائل مراقب للتخزين طويل الأجل. لتقييم كفاءة النقل ، أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS إلى العينة في فرز الخلايا المنشط بالفلورة أو أنبوب FACS. بعد طرد العينة عند 400 جرام ودرجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ، تخلص من المادة الطافية تماما باستخدام ماصة.أعد تعليق الحبيبات في محلول مخفف من واحد إلى خمسة من CD3 في المخزن المؤقت FACS. دوامة العينة واحتضانها لمدة 30 دقيقة على الجليد في الظلام قبل الطرد المركزي كما هو موضح سابقا. بعد ذلك ، بعد التخلص من المادة الطافية تماما ، أعد تعليق الحبيبات في محلول مخفف من واحد إلى 20 من 7-AAD في المخزن المؤقت FACS.دوامة هذا الخليط قبل احتضانه لمدة 10 دقائق على الجليد في بيئة مظلمة. أخيرا ، أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS إليه وتابع تحليل العينة باستخدام مقياس التدفق الخلوي. كشف تحليل صلاحية الخلايا المحولة أنه في اليوم 14 ، كان أكثر من 95٪ من الخلايا إيجابية CD3 وحية بعد استبعاد الخلايا الإيجابية 7-AAD ، مما يشير إلى نجاح تنشيط الخلايا التائية وتوسعها.تم قياس كفاءة النقل داخل السكان الإيجابيين CD3 لتكون 58.7٪ مقارنة بالخلايا غير المحولة ، والتي أظهرت كفاءة نقل بنسبة 0.51٪ عندما تم توسيع الخلايا المحولة من اليوم الرابع حتى اليوم 14 ، مع زراعة فرعية كل يومين ، خضعت الخلايا لتوسع 25 ضعفا. خضع المنتج لاختبارات مختلفة لمراقبة الجودة واستوفى جميع المعايير المحددة ، مما يشير إلى مدى ملاءمته للاستخدام مرة أخرى. يجب تنفيذ الإجراء بأكمله باستخدام تقنيات معقمة بدقة.والخطوة الأكثر صعوبة هي عملية التنبيغ حيث يحتاج المرء إلى مراعاة جميع الكواشف المراد إضافتها من أجل الحفاظ على حجم إجمالي محدد.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Procedure for Lung Engineering

الداخلي للهندسة الرئة

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

التوليف ، والجمعية ، وتوصيف أحادي الطبقة المحمية الجسيمات النانوية الذهبية للأفلام كهربية البروتين أحادي الطبقة

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

إجراءات Decellularization من القلب التاجي لحم الخنزير من قبل الإرواء الوراء

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

جيل من سمك ثلاثي الأبعاد الجلد كامل أي ما يعادل واصابة الآلي

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

التوليف من ألياف نانوية أساس كيراتين للهندسة الطبية الحيوية

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

في فيفو اثنين من اللون 2-الفوتون التصوير من الخلايا المراسل الموسومة وراثيا في الجلد

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

التوليد القابل للتحجيم من العضيات الدماغية الناضجة من الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القدرات والتوصيف عن طريق المناعة

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Segmenting Growth of Endothelial Cells in 6-Well Plates on an Orbital Shaker for Mechanobiological Studies

تجزئة نمو الخلايا البطانية في لوحات 6-Well على شاكر المداري للدراسات الميكانيكية الحيوية

Shear stress imposed on the arterial wall by the flow of blood affects endothelial cell morphology and function. Low magnitude, oscillatory and ...

Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells

تجميع وتشغيل جهاز Acoustofluidic لتعزيز تسليم المركبات الجزيئية إلى الخلايا

Efficient intracellular delivery of biomolecules is required for a broad range of biomedical research and cell-based therapeutic applications. ...

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

جيل من مكافئات الجلد البشري الوعائية ذاتية التجميع

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...