Name: a gmp-compliant procedure for the generation of gene-modified t cells
Uploaded: 2023-10-06T14:40:00
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この研究は、RESEARCH - CREATE - INNOVATE(プロジェクトコード:T2EDK-00474)の呼びかけの下、Operational Program Competitiveness, Entrepreneurship, and Innovationを通じて、欧州連合とギリシャの国家基金から共同出資されています。また、細胞治療研究所のGMPラボ「Dimitris Lois」に継続的にご支援を賜り、誠にありがとうございます。

この研究は、パトラス大学の倫理委員会とパトラス大学総合病院の治験審査委員会によって承認されました。生物学的標本を取得する前に、健康な個人からインフォームドコンセントが得られました。参加者の適格性評価は、施設の手順に従って、白血球アフェレーシスのJACIE基準に準拠して実施されました。このプロトコルを臨床ACT設定で実施する場合、すべての手順は適正製造基準(GMP)ガ...

<ol>
	<li>Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).</li><li>Brentjens, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra38 (2013).</li><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li><li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li><li>Schuster, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+remissions+following+chimeric+antigen+receptor+modified+T+cells+directed+against+CD19+(CTL019)+in+patients+with+relapsed+or+refractory+CD19++lymphomas.">Sustained remissions following chimeric antigen receptor modified T cells directed against CD19 (CTL019) in patients with relapsed or refractory CD19+ lymphomas.</a> Blood. 126 (23), 183 (2015).</li><li>Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+manufacturing+of+CAR+T+cell+therapy.">Global manufacturing of CAR T cell therapy.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 4, 92-101 (2017).</li><li>Wang, X., Rivi&#232;re, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+manufacturing+of+CAR+T+cells:+foundation+of+a+promising+therapy.">Clinical manufacturing of CAR T cells: foundation of a promising therapy.</a> Molecular Therapy - Oncolytics. 3, 16015 (2016).</li><li>Iancu, E. M., Kandalaft, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+advantages+of+cell+therapy+manufacturing+under+Good+Manufacturing+Practices+within+the+hospital+setting.">Challenges and advantages of cell therapy manufacturing under Good Manufacturing Practices within the hospital setting.</a> Current Opinion in Biotechnology. 65, 233-241 (2020).</li><li>Kaiser, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+commercial+process+for+the+manufacture+of+genetically+modified+T+cells+for+therapy.">Towards a commercial process for the manufacture of genetically modified T cells for therapy.</a> Cancer Gene Therapy. 22 (2), 72-78 (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+on+quality,+non-clinical+and+clinical+aspects+of+medicinal+products+containing+genetically+modified+cells.">Guidelines on quality, non-clinical and clinical aspects of medicinal products containing genetically modified cells.</a> European Medicines Agency. , (2020).</li><li>Castella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point-of-care+CAR+T-Cell+production+(ARI-0001)+using+a+closed+semi-automatic+bioreactor:+experience+from+an+academic+phase+I+clinical+trial.">Point-of-care CAR T-Cell production (ARI-0001) using a closed semi-automatic bioreactor: experience from an academic phase I clinical trial.</a> Frontiers in Immunology. 11, 482 (2020).</li><li>Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviruses+as+gene+transfer+agents+for+delivery+to+non-dividing+cells.">Lentiviruses as gene transfer agents for delivery to non-dividing cells.</a> Current Opinion in Biotechnology. 9 (5), 457-463 (1998).</li><li>Ausubel, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+CGMP-grade+lentiviral+vectors.">Production of CGMP-grade lentiviral vectors.</a> Bioprocess International. 10 (2), 32-43 (2012).</li><li>Van der Loo, J. C. M., Wright, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+challenges+in+viral+vector+manufacturing.">Progress and challenges in viral vector manufacturing.</a> Human Molecular Genetics. 25 (R1), R42-R52 (2016).</li><li>Rad, S. M. . A. H., Poudel, A., Tan, G. M. Y., McLellan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+choice:+Who+should+drive+the+CAR+in+T+cells.">Promoter choice: Who should drive the CAR in T cells.</a> PLoS One. 15 (7), e0232915 (2020).</li><li>Sandrin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+pseudotyped+with+a+modified+RD114+envelope+glycoprotein+show+increased+stability+in+sera+and+augmented+transduction+of+primary+lymphocytes+and+CD34++cells+derived+from+human+and+nonhuman+primates.">Lentiviral vectors pseudotyped with a modified RD114 envelope glycoprotein show increased stability in sera and augmented transduction of primary lymphocytes and CD34+ cells derived from human and nonhuman primates.</a> Blood. 100 (3), 823-832 (2002).</li><li>Costello, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+stimulated+and+unstimulated+T+lymphocytes+by+HIV-1-derived+lentiviral+vectors.">Gene transfer into stimulated and unstimulated T lymphocytes by HIV-1-derived lentiviral vectors.</a> Gene Therapy. 7 (7), 596-604 (2000).</li><li>Radek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vectofusin-1+improves+transduction+of+primary+human+cells+with+diverse+retroviral+and+lentiviral+pseudotypes,+enabling+robust,+automated+closed-system+manufacturing.">Vectofusin-1 improves transduction of primary human cells with diverse retroviral and lentiviral pseudotypes, enabling robust, automated closed-system manufacturing.</a> Hum Gene Therapy. 30 (12), 1477-1493 (2019).</li><li>Hanenberg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+retrovirus+and+target+cells+on+specific+fibronectin+fragments+increases+genetic+transduction+of+mammalian+cells.">Colocalization of retrovirus and target cells on specific fibronectin fragments increases genetic transduction of mammalian cells.</a> Nature Medicine. 2 (8), 876-882 (1996).</li><li>Lamers, C. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retronectin-assisted+retroviral+transduction+of+primary+human+T+lymphocytes+under+good+manufacturing+practice+conditions:+tissue+culture+bag+critically+determines+cell+yield.">Retronectin-assisted retroviral transduction of primary human T lymphocytes under good manufacturing practice conditions: tissue culture bag critically determines cell yield.</a> Cytotherapy. 10 (4), 406-416 (2008).</li><li>O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+spinoculation+enhances+infection+through+virus+binding.">Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding.</a> Journal of Virology. 74 (21), 10074-10080 (2000).</li><li>Cieri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7+and+IL-15+instruct+the+generation+of+human+memory+stem+T+cells+from+naive+precursors.">IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors.</a> Blood. 121 (4), 573-584 (2013).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+(CAR-T)+cells+expanded+with+IL-7/IL-15+mediate+superior+antitumor+effects.">Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects.</a> Protein Cell. 10 (10), 764-769 (2019).</li><li>Ghassemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+manufacturing+of+non-activated+potent+CAR+T+cells.">Rapid manufacturing of non-activated potent CAR T cells.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (2), 118-128 (2022).</li><li>Wang, R. -. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protocols+for+&#947;&#948;+T+cell+expansion+and+lentiviral+transduction.">Optimized protocols for &#947;&#948; T cell expansion and lentiviral transduction.</a> Molecular Medicine Reports. 19 (3), 1471-1480 (2019).</li><li>Yuan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+and+optimization+of+protocols+for+producing+recombinant+lentivirus+carrying+the+anti-Her2+chimeric+antigen+receptor+gene.">Comparative analysis and optimization of protocols for producing recombinant lentivirus carrying the anti-Her2 chimeric antigen receptor gene.</a> The Journal of Gene Medicine. 20 (7-8), e3027 (2018).</li><li>Zhu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closed-system+manufacturing+of+CD19+and+dual-targeted+CD20/19+chimeric+antigen+receptor+T+cells+using+the+CliniMACS+Prodigy+device+at+an+academic+medical+center.">Closed-system manufacturing of CD19 and dual-targeted CD20/19 chimeric antigen receptor T cells using the CliniMACS Prodigy device at an academic medical center.</a> Cytotherapy. 20 (3), 394-406 (2018).</li><li>Mock, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+manufacturing+of+chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+adoptive+immunotherapy+using+CliniMACS+Prodigy.">Automated manufacturing of chimeric antigen receptor T cells for adoptive immunotherapy using CliniMACS Prodigy.</a> Cytotherapy. 18 (8), 1002-1011 (2016).</li></ol>

遺伝子送達担体としてのレンチウイルスベクターは、分裂細胞と非分裂細胞の両方を形質導入する能力があるため、細胞および遺伝子治療の分野で重要なツールです12。しかし、GMP適合法を用いたレンチウイルスベクターの大量生産は、トランスフェクション法や精製ステップなどのさまざまなパラメータにより、レンチウイルスバッチにばらつきが生じる可能性があるた?...

養子細胞療法(ACT)とキメラ抗原受容体(CAR)-T細胞の出現は、現代の臨床診療に革命的な変化をもたらし、個別化医療の新しいパラダイムを確立しました。特に、CD19を標的とするCAR-T細胞は、優れた臨床反応を示しており、B細胞悪性腫瘍に対する最先端のT細胞療法を表しています1,2,3,4,5。しかし、現在市販されている遺伝子改変T細胞治療は、遺伝子導入をウイルスベクターに大きく依存しています。ACTにおけるウイルスベクターの実装は、特に学術環境における適正製造基準(GMP)条件下では、スケーラビリティの制限、特殊な機器要件、高度なスキルを持つ人材の必要性、およびプラスミドを介したウイルス粒子生産のためのGMP準拠の試薬の使用により、大きな課題を提示します6,7,8。
その結果、遺伝子改変T細胞治療の製造プロセスは複雑であり、通常、白血球アフェレーシス製品から末梢血単核細胞(PBMC)を分離することから始まります。T細胞はしばしばPBMCプールから濃縮され、抗CD3/CD28マイクロ複合体を用いて活性化される7,9。その後、T細胞はウイルスまたは非ウイルスベクターのいずれかで遺伝子改変され、その場で生産することも、外部委託することもできます。注入に必要な細胞数を達成するために、遺伝子改変細胞は、最終的な製剤化および/または凍結保存の前に増殖されます。最後に、細胞産物は、複数の品質管理アッセイに基づく様々な放出基準を満たさなければならない9。
このプロトコルはGMP迎合的な条件の下で遺伝子変更されたT細胞プロダクトを製造するのに健康なPBMCsの 生体外で の処理のための簡単な技術を利用する広範囲の方法論を示す。このプロトコルにはレンチウイルスベクターの使用が組み込まれており、必要なすべての定量的/機能的、純度、および安全性試験(ウイルス力価、宿主細胞DNA複製適格レンチウイルスの検出など)を提供するウイルス製造会社に委託できます。本研究では、VSV-g(水疱性口内炎ウイルスGタンパク質)ベースの第2世代レンチウイルスベクターに、目的遺伝子として緑色蛍光タンパク質(GFP)を構成的に発現させたベクターを採用しました。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well TC-treated plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL FACS tube&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Greiner biomedica</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well TC-treated plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-AAD</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS CANTO II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>V96300084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counter&#160;</td>
			<td>Corning Cell Cytosmart</td>
			<td>J21E0081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>Greiner biomedica</td>
			<td>122263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Buffer (1x D-PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software v10.6.2&#160;</td>
			<td>TreeStar Inc</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco CTS Opti-MEM I Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A4124801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP rhIL-15</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>170-076-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP rhIL-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>170-076-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMP rhIL-7</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>170-076-111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPA Whitley H35 Hypoxystation</td>
			<td>Don Whitley Scientific</td>
			<td>HA0315172H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin (HSA)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>B05AA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Junior LB 9509 Portable Luminometer</td>
			<td>Berthold Technologies</td>
			<td>6506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-X Provirus Quantitation Kit</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS GMP T cell TransAct</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>170-076-156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human&#160; CD3 (Clone: UCHT-1)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Plus Detection kit</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>LT07-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm ultra-expandable closing film tape 5 cm x 75 m</td>
			<td>D.Dutscher</td>
			<td>90261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PeriStem PS-650-DB (apheresis bag)</td>
			<td>Biomed Device</td>
			<td>SC00816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planer Kryo10 Series III</td>
			<td>Planer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>Greiner biomedica</td>
			<td>658175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue, 0.4% solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectofusin-1 GMP</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>170-076-165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVOTM 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium</td>
			<td>Lonza Bioscience</td>
			<td>A1048501</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a gmp-compliant procedure for the generation of gene-modified t cells

養子細胞療法(ACT)の分野は、遺伝子組み換え細胞、特にキメラ抗原受容体(CAR)-T細胞の開発によって革命を起こしました。これらの改変細胞は、血液悪性腫瘍の患者において顕著な臨床反応を示しています。しかし、これらの治療法を製造し、広範な品質管理評価を実施するには高いコストがかかるため、より幅広い患者がアクセスできるように制限されています。この問題に対処するために、多くの学術機関は、国内外の規制当局によって設定されたガイドラインを遵守しながら、遺伝子組み換え細胞の内製化の実現可能性を模索しています。
遺伝子組み換えT細胞製品を大規模に製造するには、特に施設の生産能力と輸液量の要件を満たす必要性の点で、いくつかの課題があります。大きな課題の1つは、GMP(Good Manufacturing Practice)ガイドラインの下で大規模なウイルスベクターを製造することであり、外部企業に委託することがよくあります。さらに、T細胞形質導入プロセスを簡素化することで、生産バッチ間のばらつきを最小限に抑え、コストを削減し、人材育成を促進することができます。この研究では、蛍光マーカーを目的の遺伝子として用いた初代ヒトT細胞のレンチウイルス形質導入の合理化されたプロセスの概要を説明します。プロセス全体はGMP準拠の基準に準拠しており、当社の学術機関内で実施されています。

形質導入効率の評価 形質導入した細胞は、フローサイトメトリーを用いて目的遺伝子(GFP)の発現を評価しました。代表的な結果を 図1に示します。14日目には、細胞の95%以上がCD3+であり、T細胞の活性化と増殖が成功したことが示されました。CD3+集団内の形質導入効率は58.7%(TD、 図1C)で測定され、形質導入さ?...

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A GMP-Compliant Procedure for the Generation of Gene-Modified T cells

このプロトコルは、適正製造基準(GMP)規格との互換性を確保し、関心のある遺伝子を持つ初代ヒトT細胞を形質導入するプロセスを概説します。

遺伝子改変T細胞の作製のためのGMP準拠手順

The field of Adoptive Cell Therapy (ACT) has been revolutionized by the development of genetically modified cells, specifically Chimeric Antigen Receptor ...

このプロトコルは興味の遺伝子の人間の第一次T細胞をtransducing簡単であり、GNPの迎合的なプロセスを記述する。この特定の技術は、現在多くの学術センターで利用可能な高価なクローズドシステム製造プラットフォームを使用することなく、費用対効果が高く、GNPに準拠するように設計されています。この方法は、血液悪性腫瘍に取り組むためのパラダイムシフトとなっているCAR-T細胞を含むがこれに限定されない遺伝子改変細胞療法の生成に適用できる可能性があります。ドナー血液の白血球アフェレーシス後に採取した細胞からPBMCを単離するには、試薬とサンプルの比率を1:2に維持しながら、ブレーキをオフにした状態で室温で30分間、混合物を800 Gで遠心分離することにより、サンプルの多糖類ベースの密度勾配遠心分離を行います。次に、マイクロピペットを使用して、PBMCを清潔な50ミリリットルのチューブに集めます。遠心分離により細胞をPBSで2回洗浄します。洗浄した細胞を完全な造血培地に再懸濁する前に。得られた細胞のうち約2,000万個を活性化するには、細胞200万個ごとに10マイクロリットルのT細胞刺激試薬を添加します。次に、組換えヒトインターロイキン-2を1ミリリットルあたり20単位で添加した後、溶液を穏やかに混合し、6ウェルプレートに移します。ウイルス形質導入を行う前に、細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で72時間インキュベートします。3日目に、細胞培養液を50ミリリットルのコニカルチューブに移し、完全に混合します。チューブを室温で300Gで10分間遠心分離し、活性化試薬を除去します。上清を完全に廃棄し、細胞を数える前にペレットを1ミリリットルの完全な培地に再懸濁します。24ウェルプレートでウェルあたり50万個の細胞をプレーティングできる濃度になるように、完全培地を使用して細胞懸濁液量を調整します。組換えヒトインターロイキン-7および組換えヒトインターロイキン-15を適切な濃度で細胞に添加します。別のチューブで、使用する最終的なウイルス量を考慮して、所望の量のベクトフシン-1をOpti-MEM培地に添加します。この混合物を濃縮ウイルスと1対1の比率で混合し、完全に混合します。次に、得られたウイルスを含む混合物を細胞に加えます。必要に応じて、完全培地を使用して各ウェルの総容量を400マイクロリットルに調整します。プレートに蓋をした後、パラフィンフィルムで密封し、1000g、32°Cで2時間遠心分離します。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。翌日、各ウェルから細胞を集めて50ミリリットルのチューブに引き込みます。次に、細胞を400G、室温で5分間遠心分離します。上清を慎重に除去した後、細胞をカウントする前に、ペレットを1ミリリットルの完全な培地に完全に再懸濁します。次に、100万個/ミリリットルになるように培地で細胞濃度を調整し、ヒト組換えインターロイキン-7およびヒト組換えインターロイキン-15をそれぞれ155単位および290単位/ミリリットルで添加してから細胞を培養します。目的の細胞数に達したら、細胞を回収して50ミリリットルのチューブに移し、遠心分離します。上清を除去した後、ペレットを10ミリリットルの培地に再懸濁して細胞をカウントします。再度遠心分離した後、上清を完全に廃棄し、50%HSAおよび40%HBSSからなる凍結保存液に、クライオバイアルあたり1,000万細胞/ミリリットルの濃度でペレットを再懸濁します。0.9ミリリットルの細胞懸濁液を必要な数のクライオバイアルに移し、各クライオバイアルに10%ジメチルスルホキシドを添加します。クライオバイアルを氷上に置き、凍結保存のために制御された速度の冷凍庫にすばやく移します。次に、凍結保存されたサンプルを監視対象の液体窒素タンクに移し、長期保存します。形質導入効率を評価するには、500マイクロリットルのFACSバッファーを蛍光活性化セルソーティングまたはFACSチューブ内のサンプルに添加します。試料を400G、室温で5分間遠心分離した後、ピペットで上清を完全に廃棄します。ペレットをFACS緩衝液中のCD3の1〜5希釈溶液に再懸濁します。サンプルをボルテックスし、暗所の氷上で30分間インキュベートしてから、前述のように遠心分離します。次に、上清を完全に廃棄した後、FACS緩衝液中の7-AADの1〜20希釈溶液にペレットを再懸濁する。この混合物をボルテックスしてから、暗所の氷上で10分間インキュベートします。最後に、200マイクロリットルのFACSバッファーを添加し、フローサイトメーターを使用してサンプルの分析に進みます。形質導入細胞の生存率解析により、14日目に、7-AAD陽性細胞を除外した後、細胞の95%以上がCD3陽性で生存していることが明らかになり、T細胞の活性化と増殖が成功したことが示されました。CD3陽性集団内の形質導入効率は、形質導入されていない細胞と比較して58.7%と測定され、形質導入細胞は0.51%の形質導入効率を示しました形質導入細胞を4日目から14日目まで増殖させ、2日ごとに継代培養すると、細胞は25倍に増殖しました。この製品は、さまざまな品質管理テストを受け、設定されたすべての基準を満たしており、さらなる使用に適していることを示しています。手順全体は、厳密に無菌技術で実行する必要があります。そして、最も厄介なステップは形質導入プロセスで、特定の総量を維持するために添加するすべての試薬を考慮する必要があります。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Procedure for Lung Engineering

肺のエンジニアリングのための手順

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

生物工学

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

合成、組立、および単分子膜のキャラクタリゼーションは、タンパク質単分子層の電気化学のための金ナノ粒子膜を保護

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

逆行性冠灌流によってブタ心臓の脱細胞化するための手順

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

三次元の全層皮膚等価物と自動傷つけ処理の発生

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

医工学のためのケラチンベースのナノファイバーの合成

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

皮膚における遺伝的にタグ付けされたレポーター細胞の生体内2色2光子イメージング

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

ヒト多能性幹細胞からの成熟小脳オルガノイドのスケーラブルな生成と免疫染色による特徴付け

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Segmenting Growth of Endothelial Cells in 6-Well Plates on an Orbital Shaker for Mechanobiological Studies

メカノ生物学的研究のための軌道シェーカー上の6ウェルプレートにおける内皮細胞の成長のセグメント化

Shear stress imposed on the arterial wall by the flow of blood affects endothelial cell morphology and function. Low magnitude, oscillatory and ...

Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells

細胞への分子化合物の送達を強化するためのアキュトー流体デバイスの組立と操作

Efficient intracellular delivery of biomolecules is required for a broad range of biomedical research and cell-based therapeutic applications. ...

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

自己組み立て型血管化ヒト皮膚等価物の生成

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...