Name: high-throughput contractile measurements of hydrogel-embedded intact mouse muscle fibers using an optics-based system
Uploaded: 2023-05-05T13:10:00
Duration: 7 min 35 s
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Les auteurs tiennent à remercier Sylvia Bogaards, Sanna Luijcx, Valentijn Jansen, Michiel Helmes et Emmy Manders pour leur expertise technique dans le développement de ce protocole. Ce travail a été soutenu par des prix de la Muscular Dystrophy Association (Development Award MDA603238 à T.J.K), de la Dutch Cardiovascular Alliance (Talent Grant to T.J.K) et du National Health and Medical Research Council (NHMRC, Australie; Fellowship APP1121651 à M.Y).

Pour les études de contraction ex vivo , les tissus post-mortem ont été obtenus à partir d’animaux sacrifiés pour d’autres projets de recherche approuvés et/ou de surplus de reproduction de l’Université VU conformément à la directive du Conseil européen (2010/63/UE) avec l’autorisation de la loi sur la recherche animale des Pays-Bas.
1. Préparation du matériel
<ol><li>Préparer les pipettes pour la trituration (conserver dans de l’éthanol à 70 % dans une armoire à écoulement jusqu’à utilisation). Coupez les extrémités de deux pointes P1,000 pour créer différentes tailles de trous; Assurez-vous que le trou est juste assez grand pour que le muscle puisse passer à travers sans bloquer la pipette. Faites passer les extrémités coupées à travers une flamme pour qu’elles deviennent lisses.</li>
	<li>Préparer les plats Sylgard comme décrit ailleurs32, et stériliser à l’avance avec de l’éthanol à 70% pour sécuriser la patte et le muscle pendant l’isolement. REMARQUE: Les plats Sylgard peuvent être réutilisés après un nettoyage en profondeur avec de l’eau désionisée et de l’éthanol à 70%.</li>
	<li>Préparer les solutions suivantes avant la procédure d’isolement : milieu de dissection, milieu de culture de fibrine et milieu de digestion musculaire (voir tableau 1). REMARQUE: Le milieu de digestion musculaire doit être stérilisé par filtre à l’aide d’un filtre de 0,22 μm. Toutes les solutions préparées doivent être équilibrées dans un incubateur de culture cellulaire standard à 37 °C et 5% de CO2 pendant au moins 30 minutes avant utilisation.</li>
	<li>Après la digestion musculaire, préparez les solutions suivantes pour couler l’hydrogel: mélange cellulaire et mélange matriciel (voir tableau 2). Combiner le mélange cellulaire et le mélange matriciel dans un rapport de 1:1 pour une concentration finale de fibrine de 2,5 mg/mL. REMARQUE : Préparez la matrice sur de la glace et utilisez des pointes de pipette prérefroidies pour éviter la polymérisation prématurée de la matrice membranaire basale. Le rapport thrombine/fibrinogène de 1:10 (unités par mg de fibrinogène) utilisé ici a été optimisé pour un temps de polymérisation de 30 min. Si le gel polymérise dans les 30 minutes, une concentration de thrombine plus faible doit être utilisée. Voir la discussion pour plus d’informations.</li>
</ol>2. Curage musculaire FDB
<ol><li>Euthanasier la souris par luxation cervicale. Désinfectez le membre postérieur avec de l’alcool à 70%.</li>
	<li>Coupez la jambe postérieure inférieure au-dessus de la cheville. Coupez la peau sur la face dorsale du pied vers les orteils. REMARQUE: Coupez la jambe postérieure inférieure à l’articulation de la cheville pour éviter d’endommager les muscles des membres inférieurs et le tibia s’ils sont nécessaires plus tard.</li>
	<li>Pelez soigneusement la peau vers les orteils. Veillez à ne pas endommager le muscle. Le FDB est le muscle le plus superficiel de la face ventrale du pied.</li>
	<li>Placer le pied disséqué dans un plat Sylgard avec 10 ml de milieu de dissection préchauffé à 37 °C. Épinglez le pied à travers la peau qui est encore attachée aux orteils et épinglez la jambe au-delà de la cheville.</li>
	<li>Retirez soigneusement le tissu conjonctif sur le dessus du muscle. Coupez le tendon au talon et soulevez le muscle par son tendon.</li>
	<li>Couper le long et sous le muscle à travers le tissu conjonctif. Continuez à couper jusqu’à ce que les tendons des orteils soient exposés.</li>
	<li>Lorsque la moitié de la longueur des trois tendons est exposée, coupez les tendons et relâchez le muscle du pied. FACULTATIF: Coupez le quatrième tendon latéral et ses fibres musculaires.</li>
	<li>Nettoyez le tissu conjonctif du muscle et transférez-le dans un tube contenant un milieu de dissection préchauffé.</li>
</ol>3. Digestion musculaire FDB
<ol><li>Préparer le milieu de digestion musculaire conformément au tableau 1.</li>
	<li>Transférer les muscles FDB dans le milieu de digestion musculaire à l’aide d’une pipette sérologique. Incuber dans un incubateur de culture tissulaire à 37 °C et 5% de CO2 pendant 80 min. REMARQUE: Ce temps doit être optimisé pour chaque lot de collagénase. La digestion est terminée lorsque le muscle commence à s’effilocher et semble élargi. Voir la discussion pour l’optimisation du temps de digestion.</li>
	<li>Après la digestion, transférer le muscle dans un tube de 15 mL contenant 3 mL de milieu de dissection et incuber pendant 30 minutes avant la trituration.</li>
</ol>4. Trituration musculaire FDB et sédimentation par gravité
<ol><li>Triturez le muscle à l’aide des pointes de trituration préalablement préparées (étape 1.1) en pipetant le muscle, en allant de la plus grande à la plus petite taille. Si cette étape dure plus de 5 minutes, placez le muscle dans l’incubateur pendant 5 minutes pour lui permettre de se reposer.</li>
	<li>Triturer jusqu’à ce que les fibres musculaires se soient principalement détachées du tendon et que le tendon puisse passer à travers une pointe P200. Retirez les tendons.</li>
	<li>Ajouter les fibres FDB dissociées à un tube de 15 mL contenant 10 mL de milieu de dissection et laisser les fibres se déposer dans l’incubateur pendant 20 min. Observez la pastille formée.</li>
	<li>Facultatif : Retirez 10 ml de milieu par le haut et répétez l’étape 4.3. Cette étape facilite l’élimination des débris en excès et des cellules mononucléées associées.</li>
</ol>5. Intégration de fibres FDB
<ol><li>Retirez délicatement tout le milieu du haut de la pastille de fibre. Remettez les cellules en suspension dans 875 μL de mélange cellulaire par muscle FDB (sur glace). REMARQUE: Un muscle FDB produit suffisamment de fibres pour sept puits d’une plaque de 24 puits. Cette densité peut être ajustée en fonction des besoins de l’expérience. Le volume de gel suivant (250 μL) est optimisé pour un format de 24 puits, mais peut être mis à l’échelle en conséquence pour d’autres formats.</li>
	<li>Aliquote 125 μL de la cellule se mélangent dans des tubes microcentrifugés simples.</li>
	<li>Un puits à la fois, ajouter 125 μL de mélange matriciel à une aliquote de suspension cellulaire et mélanger en pipetant soigneusement de haut en bas, en évitant la formation de bulles.</li>
	<li>Transférer immédiatement le mélange final dans un puits. REMARQUE: Assurez-vous de pipeter le mélange au milieu du puits. Répétez les étapes 5.3 et 5.4 pour chaque puits.</li>
	<li>Solidifier les gels dans un incubateur pendant 30-45 min. Après solidification, ajouter soigneusement le milieu de culture dans les puits. REMARQUE: Un pipetage rapide peut détacher l’hydrogel du puits. À partir de ce moment, les fibres peuvent être stimulées et mesurées. Cependant, d’après notre expérience, laisser les fibres s’adapter aux conditions de culture pendant 24 heures peut améliorer la contractilité des fibres.</li>
	<li>Pour une culture plus longue, reconstituer le milieu de culture d’un demi-changement tous les 2 jours. Pour ce faire, retirez la moitié du milieu de culture et remplacez-le par une quantité égale de milieu frais.</li>
</ol>6. Mesures contractiles optiques
<ol><li>Allumez le système de mesure des contractiles optique (voir le tableau des matériaux), la lampe à fluorescence, le stimulateur de cellule électrique et l’ordinateur. Réglez le stimulateur électrique sur 1,0 Hz, 10,0 V et une durée d’impulsion de 5,00 ms pour stimuler les fibres musculaires isolées.</li>
	<li>Insérez la plaque dans le système de mesure. Connectez le pacer à l’insert de stimulation et insérez-le dans la plaque de culture.</li>
	<li>Ouvrez le programme IonWizard, et ouvrez un nouveau fichier en cliquant sur Fichier (en haut à gauche de l’écran) | Nouveau.</li>
	<li>Vérifiez si le programme est sur la bonne expérience, Sarcomère squelettique, en cliquant sur Nouveau | Collectez l’expérience. Pour modifier l’expérience, cliquez sur l’expérience souhaitée et appuyez sur Ajouter. Pour l’expérience du sarcomère squelettique, appliquez les paramètres suivants : Sarc 20x, lignes moyennes, FFT unique, taux d’échantillonnage de 250 Hz et temps d’acquisition de 10 s. REMARQUE : Les paramètres expérimentaux doivent être préparés avant l’expérience. Les paramètres peuvent être ajustés aux besoins de l’expérience.</li>
	<li>Réglez la température du système de mesure à 25 °C. Cliquez sur ouvrir le localisateur de cellules sous la barre d’outils et attendez qu’un nouvel écran apparaisse. En haut à droite de cet écran, sélectionnez le type de plaque et les puits actifs. REMARQUE: Les mesures sont effectuées à 25 ° C pour réduire la vitesse de contraction des fibres musculaires FDB à contraction rapide, empêchant ainsi le sous-échantillonnage de l’événement contractile.</li>
	<li>Mettez les fibres au point en ajustant le curseur de mise au point. Vous pouvez également utiliser les touches W et S pour cette fonction de mise au point.</li>
	<li>Activez le rythme pour démarrer la stimulation électrique. Observez que les fibres commencent maintenant à se contracter. REMARQUE: Si aucune fibre ne tremble, assurez-vous que tous les fils sont connectés et que le pacer est complètement immergé. Si, après cela, il n’y a toujours pas de mouvement, les fibres peuvent ne pas répondre en raison d’une surdigestion ou de dommages excessifs pendant la trituration.</li>
	<li>Concentrez la zone de mesure sur l’extrémité d’une fibre de sorte que les sarcomères courent verticalement. Assurez-vous que les sarcomères sont au point. Si les sarcomères sont au point, un seul pic est visible dans la barre d’outils. Pendant la contraction, ce pic se déplacera vers la droite à mesure que le sarcomère raccourcira. REMARQUE: La zone de mesure violette peut être ajustée avant le début de l’expérience. Pour assurer une mesure correcte, incluez ~20 sarcomères. Si ce pic change de forme pendant la contraction, cela peut indiquer que le sarcomère est obscurci ou flou pendant la contraction, ce qui introduit du bruit.</li>
	<li>Démarrez l’expérience en cliquant sur Démarrer dans la barre d’outils. Appuyez sur la touche Q pour démarrer une mesure et attendez que le programme mesure 10 transitoires de contraction. Si plus de quatre transitoires semblent sans bruit, acceptez la mesure en appuyant sur la touche Z . Si les transitoires ont trop de bruit, rejetez la mesure en appuyant sur la touche X .</li>
	<li>Mesurez entre 10 fibres et 20 fibres par condition. Les emplacements des fibres précédemment mesurées sont conservés.</li>
	<li>Facultatif: Ajouter des composés, après quoi les fibres peuvent être remesurées à ce stade.</li>
	<li>Lorsque l’expérience est terminée, appuyez sur le bouton d’arrêt dans la barre d’outils inférieure pour fermer la fenêtre de recherche de cellules. Enregistrez le fichier et démarrez un nouveau fichier.</li>
	<li>Pour analyser les données, ouvrez le programme « Cytosolver desktop ». Cliquez sur importer et sélectionnez le(s) fichier(s) à analyser.</li>
	<li>Une fois l’analyse terminée par le programme, recherchez les pics bleus, rouges et gris. Les pics bleus sont des transitoires qui sont acceptés par le programme. Les pics rouges sont des transitoires qui sont rejetés par le programme, et les pics gris sont des transitoires rejetés par l’utilisateur. REMARQUE: Les critères de rejet peuvent être ajustés dans le logiciel d’analyse. En général, les valeurs sont rejetées si elles dépassent une limite de dérivée maximale, et les transitoires sont rejetés sur la base de valeurs d’ajustement de courbe R2 de <0,95.</li>
	<li>Cliquez sur exporter. Cochez les cases suivantes : Données transitoires moyennées et exportation vers Excel.</li>
	<li>Lorsque vous avez terminé, éteignez toutes les machines. Sortez la plaque de culture et jetez-la. Nettoyez les électrodes du pacer avec de l’eau désionisée et de l’éthanol à 70%.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Smith, L. R., Meyer, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+explants:+Ex-vivo+models+to+study+cellular+behavior+in+a+complex+tissue+environment.">Skeletal muscle explants: Ex-vivo models to study cellular behavior in a complex tissue environment.</a> Connective Tissue Research. 61 (3-4), 248-261 (2020).</li><li>Khodabukus, A., Prabhu, N., Wang, J., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+tissue-engineered+skeletal+muscle+models+for+studying+muscle+physiology+and+disease.">In vitro tissue-engineered skeletal muscle models for studying muscle physiology and disease.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (15), 1701498 (2018).</li><li>Fernandez-Costa, J. 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C., Abusara, Z., Herzog, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+sarcomere+lengths+and+sarcomere+elongations+are+not+uniform+across+an+intact+muscle.">In vivo sarcomere lengths and sarcomere elongations are not uniform across an intact muscle.</a> Frontiers in Physiology. 7, 187 (2016).</li><li>Moo, E. K., Leonard, T. R., Herzog, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sarcomere+force-length+relationship+in+an+intact+muscle-tendon+unit.">The sarcomere force-length relationship in an intact muscle-tendon unit.</a> Journal of Experimental Biology. 223, 215020 (2020).</li><li>Schuler, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+remodeling+of+the+extracellular+matrix+during+aging+contributes+to+age-dependent+impairments+of+muscle+stem+cell+functionality.">Extensive remodeling of the extracellular matrix during aging contributes to age-dependent impairments of muscle stem cell functionality.</a> Cell Reports. 35 (10), 109223 (2021).</li><li>Carberry, S., Zweyer, M., Swandulla, D., Ohlendieck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+reveals+drastic+increase+of+extracellular+matrix+proteins+collagen+and+dermatopontin+in+the+aged+mdx+diaphragm+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Proteomics reveals drastic increase of extracellular matrix proteins collagen and dermatopontin in the aged mdx diaphragm model of Duchenne muscular dystrophy.</a> International Journal of Molecular Medicine. 30 (2), 229-234 (2012).</li><li>Tarpey, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+utilization+of+the+flexor+digitorum+brevis+for+assessing+skeletal+muscle+function.">Characterization and utilization of the flexor digitorum brevis for assessing skeletal muscle function.</a> Skeletal Muscle. 8 (1), 14 (2018).</li></ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Ici, nous détaillons un protocole pour effectuer l’isolement enzymatique et la culture des fibres musculaires FDB dans un format de culture 3D, suivi de mesures contractiles à l’aide d’un système de mesure contractile basé sur l’optique. Ce protocole présente un certain nombre d’avantages, notamment le 1) isolement direct et opportun de nombreuses fibres musculaires intactes à partir d’un seul muscle; 2) l’incorporation des fibres musculaires dans une matrice d’hydrogel accordable; 3) la réalisation de mesures de contractilité à haut débit à l’aide du système optique; et 4) la capacité d’effectuer des mesures répétées des mêmes fibres musculaires après une intervention. L’isolement de fibres musculaires vivantes uniques fournit des cellules musculaires matures qui conservent leur fonction contractile. Comme les fibres musculaires obtenues à partir de la souris FDB sont relativement petites, elles sont facilement manipulées pendant l’isolement et conservent leur forme droite, ce qui permet des mesures contractiles en aval. Bien que le système ait été principalement développé pour étudier la contraction des cardiomyocytes, les fibres musculaires squelettiques contiennent la même machinerie contractile avec des motifs de sarcomères facilement distinguables et, par conséquent, peuvent également être mesurées à l’aide de ce système29. Le couplage de mesures contractiles unicellulaires avec une culture de fibres musculaires ex vivo vivantes est un outil puissant pour évaluer la santé et la fonction des fibres musculaires matures en réponse à l’activation électrique. 
Une limitation de l’utilisation de fibres musculaires dissociées est l’absence de forces externes (c.-à-d. étirement passif) appliquées aux fibres, ce qui entraîne des longueurs de sarcomère au repos inférieures à celles trouvées in vivo. Bien qu’une longueur de sarcomère de 2,4 à 2,5 μm assure une production de force optimale, la longueur du sarcomère au repos peut varier considérablement33. Bien que la longueur du sarcomère au repos in vivo du FDB n’ait pas encore été décrite, nos propres données non publiées suggèrent une longueur moyenne de 2,2 μm. Les résultats actuels montrent une longueur moyenne de sarcomère au repos de ~1,95 μm dans les fibres FDB déchargées après 24 heures en culture (Figure 3). Bien que cette longueur de sarcomère au repos inférieure entraînerait une production de force plus faible, une longueur de ~1,95 μm devrait toujours produire >90% de la force maximale34. En tant que telles, ces longueurs de sarcomère devraient être suffisantes pour déterminer les différences de fonction des fibres entre différents modèles génétiques ou après des traitements médicamenteux. De plus, l’incorporation de fibres dans un hydrogel fournit de nombreux points d’adhérence supplémentaires par rapport aux fibres cultivées 2D flottantes librement, ce qui limiterait le raccourcissement supplémentaire du sarcomère au fil du temps.
L’un des avantages de ce protocole d’isolation des fibres musculaires est l’utilisation d’un muscle à contraction rapide facilement disséqué composé de fibres musculaires relativement petites par rapport à d’autres muscles, tels que l’extenseur digitorum longus (EDL). Leur taille plus petite rend l’isolement musculaire plus approprié pour la séparation basée sur la trituration, réduisant ainsi le risque de dommages induits par la pipette ou l’enchevêtrement des fibres musculaires. La matrice extracellulaire des muscles FDB peut être facilement digérée enzymatiquement avec de la collagénase, ce qui permet d’isoler des centaines de fibres musculaires en peu de temps. Cependant, une surdigestion peut endommager les fibres musculaires. La surdigestion des fibres musculaires peut être reconnue lorsque le muscle se désagrège presque instantanément lors de la trituration du muscle ou lorsqu’une grande partie du volume cellulaire est hypercontractée pendant la procédure d’ensemencement cellulaire. Pour éviter la surdigestion du muscle, le temps de digestion doit être optimisé pour chaque lot de collagénase. Pour tester cela, deux muscles FDB doivent être digérés en parallèle avec un temps de digestion décalé de 5 minutes entre eux. Le temps de digestion avec le rendement le plus élevé en fibres musculaires viables doit être choisi. Cette optimisation doit ensuite être effectuée une seconde fois, toujours avec 5 min de séparation en temps de digestion. Le temps de digestion produisant les fibres musculaires les plus viables doit être utilisé comme temps de digestion optimal pour le lot actuel de collagénase. Une autre façon de limiter la variabilité de la collagénase d’un lot à l’autre serait de calculer directement les unités d’activité par millilitre de solution mère, puis de reconstituer les lots de collagénase suivants à la même quantité. Enfin, les temps de digestion peuvent devoir être optimisés pour différentes souches de souris, par exemple, si vous étudiez des animaux âgés ou malades qui présentent une augmentation du dépôt de matrice extracellulaire35,36.
La possibilité de pipeter des fibres musculaires isolées viables ouvre des possibilités de culture de fibres musculaires FDB dans diverses conditions de culture. L’une de ces options est la culture de ces fibres dans des hydrogels pour imiter l’environnement de culture tissulaire indigène. Ce protocole d’encastrement garantit que les fibres restent en place pendant les mesures contractiles et a été optimisé pour permettre aux fibres de se déposer au fond de la plaque avant la prise du gel. Cependant, ce protocole peut devoir être ajusté pour tenir compte des différences dans les stocks de thrombine et de fibrinogène. Si l’activité de la thrombine est trop élevée, le gel prendra prématurément et les fibres peuvent rester suspendues à des endroits plus élevés en dehors du plan focal du microscope. Si cela se produit, le rapport thrombine:fibrinogène doit être ajusté. Cela peut être testé en plaquant des fibres à des concentrations de thrombine de plus en plus faibles et en prenant note de la durée de la polymérisation. En règle générale, cela ne devrait pas se produire plus vite que 30 minutes. Cependant, avoir une concentration de thrombine trop faible peut également nuire au processus de polymérisation. Une autre méthode pour s’assurer que les fibres sont dans le bon plan focal consiste à les ensemencer d’abord à l’aide d’un protocole 2D, puis à ajouter une couche d’hydrogel sur les fibres après qu’elles aient adhéré à la plaque de culture. Cependant, il faut savoir que l’élimination du milieu des fibres peut induire une hypercontraction, car elles sont sensibles au dessèchement. On ne sait pas non plus si l’hydrogel se fixera complètement à la plaque de culture, et il pourrait se détacher plus facilement. Par conséquent, cette procédure d’encastrement est préférable pour maintenir les fibres viables et en place pour les mesures de contraction.
L’utilisation de ce protocole permet l’étude de la dynamique contractile des fibres musculaires matures ex vivo et peut être appliquée à la fois aux souris saines et à celles porteuses de mutations génétiques pour les maladies musculaires. De même, il permet de tester comment les conditions de culture ou l’ajout de composés affectent la fonction des fibres musculaires. Les données contractiles obtenues à l’aide du système optique donnent une indication de la capacité contractile des fibres musculaires simples vivantes, et les changements dans cette capacité peuvent être corrélés à la santé des fibres. Ces données seules ne sont toutefois pas suffisantes pour déterminer si ces changements se produisent aux stades de transition croisée actine-myosine ou de libération de calcium de la contraction musculaire. Bien que nous ne décrivions pas les méthodes de mesure de la signalisation du calcium dans ce protocole, cette configuration est également capable de mesurer les transitoires de calcium à base de Fura dans les cellules musculaires contractantes29. Un inconvénient de ce système est que le muscle FDB ne contient que des fibres musculaires de type IIa/IIx à contraction rapide, et les muscles contenant des fibres de type I à contraction lente de cette taille n’ont pas encore été décrits37. Cela élimine la possibilité d’étudier le fonctionnement spécifique du type de fibre à l’aide de cette méthode. Le protocole que nous proposons ici pourrait potentiellement être adapté à d’autres muscles tels que l’EDL ou le soléaire pour étudier les différences de type de fibre. En raison de leur plus grande taille, ce protocole devrait être optimisé davantage pour ces muscles. Les fibres plus longues ont tendance à s’emmêler pendant l’étape de sédimentation par gravité et se rompront si elles sont manipulées par pipetage, ce qui entraînerait un rendement plus faible. En raison de leur incompatibilité avec le pipetage, les fibres plus longues sont donc également moins compatibles avec la technique d’enrobage de gel. Les mesures de ces fibres peuvent toujours être effectuées dans un format de culture 2D, mais les fibres peuvent se déplacer davantage pendant la contraction en raison de leur taille, affectant ainsi le rapport signal sur bruit. Une autre limitation de ce système est l’incapacité d’effectuer des mesures de force parallèlement aux mesures contractiles, telles que les mesures de force qui peuvent être obtenues en utilisant d’autres préparations de fibres musculaires intactes28. Cependant, cette limitation peut être contournée en estimant la force générée par la fibre musculaire. La force générée des fibres musculaires peut être estimée si la forme des fibres musculaires pendant les états contractés et détendus ainsi que le module de Young de la matrice sont connus25. Néanmoins, ce système optique offre une approche facile à utiliser et à haut débit pour étudier la fonction contractile musculaire et ouvre une gamme de nouvelles possibilités pour l’étude des maladies musculaires génétiques et des interventions thérapeutiques.

Les progrès des techniques de culture cellulaire in vitro ont ouvert de nouvelles possibilités pour étudier les capacités de régénération des tissus, les mécanismes cellulaires physiopathologiques et les stratégies thérapeutiques subséquentes, tout en utilisant des tissus de mammifères dans des conditions bien contrôlées 1,2,3. L’utilisation de systèmes de culture in vitro est bien établie dans le domaine de la recherche musculaire 4,5. En général, on utilise in vitro des myotubes immatures différenciés provenant de cellules progénitrices myogéniques 2,6,7,8. Bien que des progrès aient été réalisés dans le protocole de différenciation pour générer des fibres musculaires plus matures9, leur immaturité limite encore la traduction des résultats à un cadre in vivo 1,10. Un problème central dans le domaine de la biologie musculaire est l’incapacité des myotubes différenciés in vitro à incarner pleinement les structures intracellulaires complexes, les processus de signalisation cellulaire et les interactions extracellulaires observés dans le tissu musculaire natif et, surtout, à récapituler les forces contractiles produites par les fibres musculaires 1,2,10,11,12 . De plus, la contraction non coordonnée des myotubes au cours du processus de différenciation entraîne souvent un détachement spontané des boîtes de culture, ce qui rend l’évaluation contractile des myotubes différenciés in vitro difficile et limitée à une évaluation qualitative ou semi-quantitative 8,11,12,13. Ces limitations nécessitent souvent des expériences in vivo régulières sur des animaux, en particulier si la contractilité musculaire est un résultat expérimental primaire1.
Une alternative à la culture in vitro-différencié des myotubes est la culture ex vivo de fibres musculaires matures isolées 1,14. Au cours de la culture ex vivo, le tissu musculaire mature sur le plan du développement est excisé hors du corps, suivi d’un isolement unicellulaire pour la culture dans des conditions de laboratoire 1,14. Les fibres musculaires matures isolées maintiennent leurs structures cellulaires complexes observées dans le tissu natif14,15, et cette méthode ouvre la possibilité d’interventions directes, telles que la manipulation génétique et le dépistage de médicaments, dans un environnement de culture bien défini et contrôlable. L’un des premiers rapports concernant l’isolement des fibres musculaires squelettiques et la culture ex vivo remonte aux années 1930; Cependant, le rendement en fibres viables de ce protocole était faible16. Avec l’optimisation continue de la procédure d’isolement et des conditions de culture, une amélioration significative de la quantité de fibres musculaires viables et fonctionnelles est maintenant possible 14,15,17,18,19. Une telle amélioration des conditions de culture consiste à enrober les boîtes de culture avec des protéines de matrice extracellulaire pour favoriser l’adhérence des fibres musculaires isolées sur la boîte de culture15,18,20. Habituellement, un revêtement de laminine est utilisé, car la laminine est l’un des éléments les plus abondants dans la matrice extracellulaire des muscles20,21. L’optimisation de la procédure d’isolement combinée au revêtement des boîtes de culture a permis au domaine de la recherche musculaire de conserver des fibres musculaires viables isolées avec une architecture cellulaire intacte et une fonctionnalité contractile en culture pendant de courtes périodes de temps 1,15,18,22.
L’approche la plus conventionnelle utilisée dans le champ musculaire pour mesurer la force et les capacités contractiles consiste à monter des fibres musculaires individuelles entre un moteur conducteur de longueur et un transducteurde force 23,24. En général, les fibres musculaires utilisées pour ces configurations motorisées sont disséquées à partir de tissus surgelés ou frais, suivis d’une perméabilisation ou d’un « écorchage », qui permet l’activation externe du calcium, où des concentrations variables de calcium sont utilisées pour induire la contraction des fibres musculaires24. Bien que cette méthode soit l’étalon-or pour les mesures contractiles des fibres musculaires, une seule fibre musculaire peut être mesurée à la fois, ce qui fait de cette technique une procédure laborieuse et longue25. De plus, la procédure d’isolement et de dépouillement des fibres musculaires perturbe les diverses structures impliquées dans le couplage excitation-contraction (c.-à-d. libération de calcium et recapture ultérieure dans le réticulum sarcoplasmique), ne permettant ainsi pas l’étude de la cinétique de relaxation et de toute maladie qui pourrait affecter ce processus26,27. Une alternative à la préparation de fibres écorchées consiste à utiliser la dissection mécanique pour isoler les fibres musculaires intactes, où les forces contractiles peuvent être mesurées en réponse à l’activation électrique28; Cependant, cette approche est techniquement difficile et prend beaucoup de temps, ce qui entraîne des mesures à faible débit. Enfin, dans les préparations pelées et intactes, les cellules musculaires sont complètement retirées de l’environnement extracellulaire lors des mesures contractiles 24, ce qui rend impossible l’étude de l’effet de la composition/rigidité de la matrice extracellulaire sur la contraction des fibres musculaires24. En conséquence, le développement de méthodes alternatives est nécessaire pour permettre des mesures de contractilité des fibres musculaires isolées intactes de manière à haut débit tout en recréant la connexion entre les fibres musculaires et la matrice extracellulaire.
Récemment, une nouvelle approche basée sur l’optique pour les mesures de contractilité des fibres musculaires à haut débit a été développée29. Ce système basé sur l’optique mesure la périodicité des sarcomères pour évaluer la longueur du sarcomère pendant la contraction en utilisant l’imagerie à grande vitesse. Dans ce système, les cellules restent en place dans la boîte de culture pendant que l’optique est déplacée, minimisant ainsi le temps nécessaire entre les mesures de plusieurs cellules29. Un avantage majeur de l’utilisation de cette approche à haut débit basée sur l’optique est qu’elle permet de développer des conditions de culture similaires à celles du tissu natif. Une approche utilisée pour imiter les conditions in vivo natives consiste à incorporer des cellules dans des hydrogels30. Typiquement, un hydrogel est un matériau viscoélastique capable de maintenir son volume et sa forme, et les hydrogels ont les propriétés des matériaux solides et liquides31. La partie solide est constituée de chaînes de polymères réticulées les unes aux autres, créant une structure qui ressemble à un filet30,31. Les propriétés matérielles des hydrogels peuvent être réglées pour imiter le dépôt matriciel des muscles30,31. Ainsi, la combinaison d’un système optique à haut débit avec des cellules intégrées dans des hydrogels ouvre de nouvelles possibilités pour évaluer les effets de la composition de la matrice extracellulaire et des propriétés mécaniques sur la fonctionnalité des fibres musculaires.
L’objectif global de cet article est de 1) décrire la méthodologie pour l’isolement enzymatique et la culture ex vivo de fibres musculaires dans des conditions imitant l’environnement tissulaire natif et 2) évaluer la contractilité des fibres musculaires en utilisant une approche à haut débit. Nous décrivons une méthodologie détaillée pour isoler facilement un grand nombre de fibres musculaires simples du muscle fléchisseur digitorum brevis (FDB) en utilisant la digestion enzymatique. En outre, nous décrivons une technique pour intégrer les fibres musculaires isolées dans un hydrogel à base de fibrine dans le but d’imiter l’environnement natif des muscles et d’améliorer la viabilité et la contractilité des fibres musculaires. Nous décrivons ensuite une méthode à haut débit de mesure in vitro des contractions de fibres musculaires vivantes à l’aide de ce système récemment développé. Un avantage supplémentaire de cette procédure d’intégration est l’immobilisation des fibres pendant la contraction, ce qui peut améliorer le rapport signal sur bruit de ces mesures. Cette méthode d’incorporation de gel est applicable aux procédures d’encapsulation de gel monopolymère et composite, facilitant l’évaluation des effets de la composition de la matrice extracellulaire sur la contractilité des fibres musculaires.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aprotinin, from Bovine Lung</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AAJ63039MC</td>
			<td>100 mM stock solution in PBS can be stored at -20 &#176;C.&#160; Sterilize stock solution using a 0.22 &#181;m filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 2</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>77336</td>
			<td>10% (w/v) stock solution can be stored at -20 &#176;C. Weighing collagenase should be done in a safety cabinet as inhalation is dangerous.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen from Bovine Plasma</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>50-176-5054</td>
			<td>20 mg/mL stock solution in PBS can be stored at -80 &#176;C. Sterilize stock solution using a 0.22 &#181;m filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1413201</td>
			<td>4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco MEM High glucose + pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11095080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>H1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel GFR Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB-40230</td>
			<td>4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum Replacement 2 (50x)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin, Bovine Plasma</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AAJ63383EXP</td>
			<td>125 U/mL stock in PBS can be stored at -20 &#176;C. Sterilize stock solution using a 0.22 &#181;m filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tranexamic Acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AC228042500</td>
			<td>80 mM stock solution in PBS can be stored at -20 &#176;C.&#160; Sterilize stock solution using a 0.22 &#181;m filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well electrical stimulator</td>
			<td>IonOptix</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiCell Cytocypher</td>
			<td>IonOptix</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyoCam-S3</td>
			<td>IonOptix</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyoPacer</td>
			<td>IonOptix</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 silicone elastomer, Base &#38; Curing Agent&#160;</td>
			<td>Dow corning&#160;</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissor - 25 mm Cutting Edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15002-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoSolver</td>
			<td>IonOptix</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonWizard</td>
			<td>IonOptix</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput contractile measurements of hydrogel-embedded intact mouse muscle fibers using an optics-based system

La culture cellulaire in vitro est un outil puissant pour évaluer les processus cellulaires et tester les stratégies thérapeutiques. Pour le muscle squelettique, les approches les plus courantes consistent soit à différencier les cellules progénitrices myogéniques en myotubes immatures, soit à cultiver ex vivo à court terme des fibres musculaires individuelles isolées. L’un des principaux avantages de la culture ex vivo par rapport à la culture in vitro est la conservation de l’architecture cellulaire complexe et des caractéristiques contractiles. Ici, nous détaillons un protocole expérimental pour l’isolement des fibres musculaires intactes du fléchisseur digitorum brevis de souris et leur culture ex vivo ultérieure. Dans ce protocole, les fibres musculaires sont intégrées dans un hydrogel à base de fibrine et à matrice membranaire basale pour immobiliser les fibres et maintenir leur fonction contractile. Nous décrivons ensuite des méthodes pour évaluer la fonction contractile des fibres musculaires à l’aide d’un système de contractilité à haut débit basé sur l’optique. Les fibres musculaires intégrées sont stimulées électriquement pour induire des contractions, après quoi leurs propriétés fonctionnelles, telles que le raccourcissement du sarcomère et la vitesse contractile, sont évaluées à l’aide d’une quantification optique. Le couplage de la culture de fibres musculaires avec ce système permet des tests à haut débit des effets des agents pharmacologiques sur la fonction contractile et des études ex vivo des troubles musculaires génétiques. Enfin, ce protocole peut également être adapté pour étudier les processus cellulaires dynamiques dans les fibres musculaires à l’aide de la microscopie à cellules vivantes.

À l’aide de ce protocole, des fibres musculaires FDB uniques ont été isolées et intégrées dans de l’hydrogel. Un aperçu de la procédure de dissection musculaire est présenté à la figure 1. Le muscle FDB est exposé avec des tendons intacts et détaché du fascia. Le maintien des tendons des muscles en tant que points de fixation minimise les dommages potentiels aux fibres musculaires pendant la procédure d’isolement. L’excès de tissu conjonctif peut être coupé pour réduire les débris et la croissance des types de cellules secondaires. Une fois que le muscle a été excisé et nettoyé suffisamment, le muscle est digéré enzymatiquement à l’aide de collagénase, et les fibres musculaires simples sont libérées par trituration avant d’incorporer les cellules isolées dans des hydrogels. L’isolement des fibres musculaires FDB fournit des fibres musculaires relativement courtes, qui ont l’avantage d’être facilement manipulables. En raison de leur taille, les fibres musculaires FDB peuvent être pipetées en toute sécurité sans dommages induits par l’enchevêtrement et sont facilement intégrées dans un hydrogel. Comme les fibres musculaires simples n’adhèrent pas très bien aux plaques de culture, l’intégration des fibres dans de l’hydrogel garantit que les fibres restent en place pendant la culture cellulaire et les mesures contractiles. De plus, l’ajout d’une matrice membranaire basale au gel de fibrine permet des interactions entre les fibres musculaires et la matrice, imitant l’environnement in vivo natif. Les fibres musculaires isolées peuvent être manipulées et maintenues en culture pendant plusieurs jours après l’isolement. La figure 2 montre un exemple de fibres FDB isolées incorporées dans une matrice d’hydrogel. Les fibres saines ont des sarcomères visibles et sont tendues droites (flèche bleue), tandis que les fibres incurvées sont généralement endommagées ou non viables (flèche jaune) et doivent être exclues des mesures. Les fibres hypercontractées apparaissent comme des objets sombres dans la matrice (flèche rouge). Si la procédure d’isolement réussit, la proportion de fibres saines devrait être de ~75%. Une plus grande proportion de fibres hypercontractées indique généralement des dommages pendant la procédure d’isolement. La membrane des fibres musculaires peut être endommagée soit par une surdigestion du muscle, soit par des dommages aux fibres pendant la trituration. Les dommages à la trituration se produisent principalement si le muscle est sous-digéré et, par conséquent, ne se sépare pas facilement.
La fonctionnalité et la viabilité des fibres ont été évaluées par des mesures contractiles des fibres musculaires à l’aide d’un système de mesure contractile à haut débit basé sur l’optique. Le système émet plusieurs paramètres, tels que la longueur du sarcomère, le pourcentage de raccourcissement du sarcomère, la vitesse contractile et la vitesse de relaxation. En utilisant le système de mesure contractile, la contraction du sarcomère peut être mesurée par fibre musculaire. La figure 3 montre des exemples de contractions des fibres musculaires mesurées à l’aide du système de mesure. À partir d’un seul transitoire de contraction, on obtient les paramètres suivants : longueur du sarcomère à l’inclusion, durée de contraction, longueur du sarcomère à contraction maximale et durée de relaxation (Figure 3A). Ces paramètres sont utilisés pour calculer le pourcentage de vitesses de raccourcissement, de contraction et de relaxation du sarcomère. Les valeurs de vitesse moyenne peuvent également être calculées à partir des valeurs de durée et de raccourcissement absolu, si nécessaire. Une mesure de contraction valide comporte une ligne de base droite, suivie d’un creux vers le pic et d’un retour à la ligne de base (Figure 3A). Le bruit, les sarcomères non focalisés ou le mouvement aberrant de la fibre peuvent influencer le transitoire de mesure (Figure 3B, C), et ces mesures peuvent être rejetées manuellement ou seront rejetées par le programme d’analyse. Dans cette approche, la visualisation claire des sarcomères est importante pour mesurer les contractions; Ainsi, tout ce qui réduit la visibilité des sarcomères peut introduire du bruit. Cela pourrait se produire s’il y a un mouvement du sarcomère à l’extérieur du plan focal pendant la contraction. Les mesures dans lesquelles une série de contractions diffèrent en vitesse ou en profondeur doivent également être exclues de l’ensemble de données.
Les données contractiles de fibres musculaires uniques obtenues avec ce système peuvent être utilisées pour comparer différentes conditions de culture. L’efficacité du système est illustrée à la figure 4. Ici, nous avons mesuré les contractions des fibres musculaires FDB dans des formats de culture 2D (plaques de culture enrobées de laminine) et 3D (hydrogel de fibrine). Un pourcentage plus élevé de mesures utilisables a été obtenu en 3D, car l’incorporation des fibres dans le gel empêchait les mouvements latéraux et autres artefacts de mouvement d’influencer la mesure (Figure 4A). L’incorporation des fibres n’a eu aucun effet significatif sur le raccourcissement du sarcomère ou les valeurs de vitesse de contraction maximale par rapport aux fibres cultivées en 2D (Figure 4B). Pour illustrer comment différentes matrices influencent la contraction des fibres musculaires FDB, nous avons également comparé cet hydrogel de fibrine à une matrice membranaire basale pure (4 mg/mL) (Figure 4C). La contractilité réduite observée dans la matrice membranaire basale pure était probablement due à la rigidité du gel ou à l’augmentation des interactions cellule-matrice. Des concentrations de fibrine allant jusqu’à 7 mg/mL ont également été testées, sans effet significatif sur la vitesse contractile et le raccourcissement (données non publiées). L’utilisation de cet hydrogel à base de fibrine assure une interférence minimale avec les paramètres contractiles.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65103/65103fig01.jpg"> Figure 1 : Vue d’ensemble de la procédure de dissection musculaire FDB. (A) Le membre postérieur est coupé au-dessus de la cheville (ligne pointillée rouge), et (B) la peau est enlevée en coupant le long du dessus du pied le long de la ligne pointillée bleue. (C) Le pied est coincé à travers la cheville et la peau aux orteils. (D) Vue microscopique du muscle exposé et de son tissu conjonctif environnant. Le fascia est visible sous la forme d’une couche blanche opaque à travers laquelle le système vasculaire passe. (E) Le fascia est retiré du muscle et le tendon est coupé le long de la ligne pointillée rouge. (F) Le muscle FDB est séparé du tissu sous-jacent en soulevant et en coupant sous et à côté du muscle. (G) Lorsque les tendons des orteils sont clairement visibles, le FDB est coupé le long de la ligne pointillée rouge. (H) Le FDB est fixé par les tendons, et le quatrième tendon latéral et ses fibres peuvent être enlevés en coupant le long de la ligne pointillée rouge. L’excès de fascia peut maintenant être coupé. (I) Après le nettoyage, le muscle FDB est transféré dans la solution de collagénase. Barres d’échelle = (D-I) 2 mm. Abréviation : FDB = fléchisseur digitorum brevis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65103/65103fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65103/65103fig02.jpg"> Figure 2 : Image microscopique de fibres musculaires FDB incorporées dans de l’hydrogel après 24 h de culture. Flèche bleue : Exemple d’une fibre musculaire FDB viable. Flèche jaune : Exemple d’une fibre musculaire FDB tordue. Les fibres musculaires tordues peuvent avoir une viabilité réduite et des contractions altérées et, par conséquent, devraient être exclues des mesures. Flèche rouge : Exemple d’une fibre musculaire FDB hypercontractée. L’hypercontraction excessive se produit lorsque la trituration est effectuée trop vigoureusement ou peut être causée par une surdigestion de la collagénase ou l’utilisation d’un milieu de culture non équilibré. Barre d’échelle = 100 μm. Abréviation : FDB = fléchisseur digitorum brevis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65103/65103fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65103/65103fig03.jpg"> Figure 3 : Exemple de transitoires de contraction de fibres mesurés à l’aide du système contractile à haut débit basé sur l’optique. (A) Exemple d’un transitoire de contraction normale. Ce transitoire est obtenu à partir des sarcomères entourés par le carré violet indiqué dans la barre d’outils inférieure. Le transitoire comprend les composantes suivantes : longueur du sarcomère à la ligne de base (vert), durée de contraction (bleu), longueur du sarcomère à contraction maximale (violet) et durée de relaxation (rouge). Des paramètres tels que la vitesse et le pourcentage de contraction sont calculés à partir de ces valeurs. (B) Exemple d’un transitoire de contraction inadéquat. Ces mesures se produisent lorsque le signal du sarcomère n’est pas capté en raison du bruit (voir flèches rouges). (C) Exemple d’un transitoire de contraction qui a un artefact de mouvement (voir flèches vertes). Les artefacts de mouvement se produisent lorsque la fibre musculaire se déplace en dehors de la mise au point pendant la contraction. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65103/65103fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65103/65103fig04.jpg"> Figure 4 : Données représentatives obtenues à l’aide du système contractile à haut débit basé sur l’optique lors de la comparaison des conditions 2D par rapport aux conditions 3D et de différents hydrogels. (A) Pourcentage de mesures de contraction acceptées et rejetées trouvées par le programme d’analyse de données en culture 2D et en culture 3D sur la base de 30 mesures. (B) Comparaison de la vitesse maximale de contraction dans des fibres musculaires cultivées en 2D et en culture 3D isolées chez trois souris après 24 h de culture. (C) Comparaison du raccourcissement du sarcomère dans des fibres musculaires cultivées en 2D et en culture 3D isolées chez trois souris après 24 h de culture. (D) Comparaison de la vitesse maximale de contraction des fibres musculaires à matrice membranaire basale pure (Matrigel) et incorporées dans l’hydrogel de fibrine isolées chez trois souris après 24 h de culture. (E) Comparaison du raccourcissement du sarcomère des fibres musculaires incorporées dans la matrice membranaire basale pure (Matrigel) et de l’hydrogel de fibrine isolées de trois souris après 24 h de culture. Les données ont été analysées à l’aide d’un test t de Student et sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type. Chaque point de données est une fibre musculaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65103/65103fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau 1 : Composition du milieu de dissection utilisé pour disséquer le muscle, du milieu de culture de fibrine utilisé pour cultiver les fibres musculaires isolées et du milieu de digestion musculaire utilisé pour digérer enzymatiquement les muscles isolés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65103/65103_JoVE%20Table%201.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 2 : Composition du mélange cellulaire utilisé pour couler les hydrogels et du mélange matriciel utilisé pour couler les hydrogels. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65103/65103_JoVE%20Table%202.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>

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High-Throughput Contractile Measurements of Hydrogel-Embedded Intact Mouse Muscle Fibers Using an Optics-Based System

La fonction musculaire squelettique peut être évaluée en quantifiant la contractilité de fibres musculaires isolées, traditionnellement en utilisant des approches laborieuses à faible débit. Ici, nous décrivons une méthode optique à haut débit pour quantifier la contractilité des fibres musculaires incorporées dans l’hydrogel. Cette approche a des applications pour le dépistage de médicaments et le développement thérapeutique.

Mesures contractiles à haut débit de fibres musculaires de souris intactes incorporées dans un hydrogel à l’aide d’un système optique

In vitro cell culture is a powerful tool to assess cellular processes and test therapeutic strategies. For skeletal muscle, the most common approaches ...

Ce protocole peut être utilisé pour évaluer l’impact des mutations génétiques sur la fonction des fibres musculaires. En outre, il peut être utilisé pour des études de dépistage de médicaments visant à améliorer la santé musculaire. Cette technique peut être utilisée pour isoler et mesurer la contractilité dans un grand nombre de fibres musculaires dans un laps de temps relativement court sans avoir besoin d’entraînement avancé.La composition des hydrogels peut être modifiée afin d’attester de l’effet des signaux environnementaux dans les muscles sains et malades. La partie la plus difficile de la procédure est la dissection initiale du muscle. Si suffisamment de soins ne sont pas pris, les dommages au muscle peuvent entraîner une diminution de la viabilité des fibres musculaires.Leander Vonk, technicien de recherche, et Osman Esen, candidat au doctorat dans mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Commencez par couper la patte postérieure inférieure de la souris euthanasiée juste au-dessus de la cheville. Faites une incision sur la peau du côté dorsal du pied vers les orteils.Pelez soigneusement la peau vers les orteils en prenant soin de ne pas endommager le muscle. Placez le pied disséqué dans un plat de protection d’étanchéité contenant 10 millilitres de milieu de dissection préchauffé à 37 degrés Celsius. Épinglez le pied à travers la peau encore attachée aux orteils.Épinglez la jambe au-delà de la cheville et excisez soigneusement le tissu conjonctif sur le dessus du muscle. Coupez le tendon au talon et soulevez le muscle. Couper le long et sous le muscle à travers le tissu conjonctif jusqu’à ce que les tendons des orteils soient exposés.Coupez les tendons lorsque la moitié de la longueur de trois tendons est exposée. Relâchez le muscle du pied et épinglez les tendons des muscles FDB. Retirez tout tissu conjonctif restant du muscle.Transférer le tissu musculaire propre dans un tube contenant un milieu de dissection préchauffé. Utilisez une pipette sérologique pour transférer le muscle brevis dans un tube contenant le milieu de digestion musculaire. Placez le tissu dans un incubateur à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone pendant 80 minutes.Transférer le muscle dans un tube de 15 millilitres contenant trois millilitres de milieu de dissection. À l’aide d’embouts de trituration préparés, pipeter le muscle du plus grand au plus petit et continuer la trituration jusqu’à ce que les fibres musculaires se soient détachées du tendon. Les tendons peuvent être enlevés avec une pointe P200.Transférer les fibres musculaires dissociées dans un tube de 15 millilitres contenant 10 millilitres de milieu de dissection. Laissez les fibres se déposer dans l’incubateur pendant 20 minutes jusqu’à ce qu’une pastille se forme. Pipeter soigneusement tout le milieu du haut de la pastille de fibre.Sur la glace, remettre les cellules en suspension dans 875 microlitres de mélange cellulaire par muscle. Ajouter 125 microlitres de mélange de cellules matricielles dans des tubes contenant 125 microlitres de suspension cellulaire aliquote. Mélanger par pipetage doux, en évitant la formation de bulles.Transférer immédiatement le mélange final dans un puits. Vérifiez la viabilité des fibres musculaires au microscope. Placez les gels dans un incubateur pendant 30 à 45 minutes pour favoriser la solidification.Une fois cela fait, ajoutez soigneusement 500 microlitres de milieu de culture dans chaque puits. Allumez le système de mesure contractile optique, la lampe fluorescente, le stimulateur de cellule électrique et l’ordinateur. Réglez le stimulateur électrique à 1,0 hertz à 10 volts avec une durée d’impulsion de cinq millisecondes pour stimuler les fibres musculaires isolées.Insérez la plaque dans le système de mesure. Connectez le pacer à l’insert et insérez-le dans la plaque de culture. Ouvrez le programme IonWizard.Cliquez sur OK. Ouvrez un nouveau fichier en cliquant sur l’icône Fichier, puis cliquez sur Nouveau. Sélectionnez Collecter l’expérience pour vérifier si le programme est sur le bon sarcomère squelettique expérimental. Pour modifier l’expérience, cliquez sur l’expérience souhaitée, puis appuyez sur Ajouter.Appliquez les paramètres SARC 20X, lignes moyennes, FFT unique, taux d’échantillonnage de 250 hertz et temps d’acquisition de 10 secondes. Changez la température du système de mesure à 25 degrés Celsius. Cliquez sur le chercheur de cellules ouvertes pour créer une nouvelle fenêtre contextuelle d’écran.Sélectionnez Type de plaque et Puits actifs. Concentrez les fibres en ajustant la barre de défilement de mise au point. Permettre à la stimulation d’induire une stimulation électrique et d’observer les contractions des fibres.En gardant les sarcomères au point, assurez-vous que la zone de mesure est fixée sur l’extrémité de la fibre de sorte que les sarcomères courent verticalement. Lorsque les sarcomères sont focalisés, un seul pic est visible dans la barre d’outils qui se déplacera vers la droite lors de la contraction. Mesurez les fibres sur le système de mesure.Cliquez sur Démarrer pour commencer l’expérience. Appuyez sur la touche Q pour commencer à mesurer 10 transitoires de contraction. Si plus de quatre transitoires semblent sans bruit, acceptez la mesure en appuyant sur la touche Z.Si les transitoires contiennent trop de bruit, rejetez les mesures. Appuyez sur Arrêter pour fermer la fenêtre du chercheur de cellules une fois l’expérience terminée. Enregistrez le fichier et créez un nouveau fichier.Ouvrez le bureau du programme CytoSolver, puis cliquez sur Importer et sélectionnez les fichiers à analyser. Une fois l’analyse terminée, identifiez les pics bleu, rouge et gris. Cliquez sur Exporter.Cochez les cases intitulées Données moyennes à données transitoires et exportez vers Excel. Un pourcentage plus élevé de mesures utilisables du muscle contractile a été obtenu dans l’hydrogel de fibrine 3D, car il empêchait les mouvements latéraux et d’autres facteurs d’influence. L’incorporation de fibres n’a pas eu d’effet significatif sur la vitesse de contraction maximale ou le raccourcissement du sarcomère.Une contraction réduite dans la matrice basale pure a été observée, probablement en raison de la rigidité du gel ou de l’interaction accrue de la matrice cellulaire. De même, l’incorporation de la matrice basale a également réduit le raccourcissement du sarcomère par rapport à l’hydrogel de fibrine. Il est important de se rappeler que les fibres musculaires isolées sont assez fragiles et qu’il faut prendre des précautions supplémentaires pour ne pas les endommager pendant le pipetage.Après la procédure d’isolement, des méthodes telles que l’immunomarquage, l’isolement des protéines et de l’ARN peuvent également être effectuées. Le développement de cette technique a ouvert de nouvelles possibilités pour étudier la fonction des fibres musculaires matures de manière à haut débit.

Research

JoVE Journal

Biology

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procédures pour Rat<em&gt; In situ</em&gt; Propriétés contractiles musculaires squelettiques

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

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