Name: high-throughput contractile measurements of hydrogel-embedded intact mouse muscle fibers using an optics-based system
Uploaded: 2023-05-05T13:10:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Contractile Measurements of Hydrogel-Embedded Intact Mouse Muscle Fibers Using an Optics-Based System at JoVE.com

Авторы выражают благодарность Сильвии Богаардс, Санне Луйкс, Валентину Янсену, Михелю Хелмсу и Эмми Мандерс за их техническую помощь в разработке этого протокола. Эта работа была поддержана наградами Ассоциации мышечной дистрофии (Премия за развитие MDA603238 T.J.K.), Голландского сердечно-сосудистого альянса (грант талантов для T.J.K) и Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям (NHMRC, Австралия; Стипендия APP1121651 М.Я.).

<ol>
	<li>Smith, L. R., Meyer, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+explants:+Ex-vivo+models+to+study+cellular+behavior+in+a+complex+tissue+environment.">Skeletal muscle explants: Ex-vivo models to study cellular behavior in a complex tissue environment.</a> Connective Tissue Research. 61 (3-4), 248-261 (2020).</li><li>Khodabukus, A., Prabhu, N., Wang, J., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+tissue-engineered+skeletal+muscle+models+for+studying+muscle+physiology+and+disease.">In vitro tissue-engineered skeletal muscle models for studying muscle physiology and disease.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (15), 1701498 (2018).</li><li>Fernandez-Costa, J. M., Fernandez-Garibay, X., Velasco-Mallorqui, F., Ramon-Azcon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+in+vitro+skeletal+muscles+as+new+tools+for+muscular+dystrophies+preclinical+studies.">Bioengineered in vitro skeletal muscles as new tools for muscular dystrophies preclinical studies.</a> Journal of Tissue Engineering. 12, 2041731420981339 (2021).</li><li>Romagnoli, C., Iantomasi, T., Brandi, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Available+in+vitro+models+for+human+satellite+cells+from+skeletal+muscle.">Available in vitro models for human satellite cells from skeletal muscle.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (24), 13221 (2021).</li><li>Dessauge, F., Schleder, C., Perruchot, M. -. H., Rouger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+in+vitro+models+of+skeletal+muscle:+Myopshere,+myobundle+and+bioprinted+muscle+construct.">3D in vitro models of skeletal muscle: Myopshere, myobundle and bioprinted muscle construct.</a> Veterinary Research. 52 (1), 72 (2021).</li><li>Hosoyama, T., Meyer, M. G., Krakora, D., Suzuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+in+vitro+propagation+of+human+skeletal+muscle+progenitor+cells+from+fetal+muscle.">Isolation and in vitro propagation of human skeletal muscle progenitor cells from fetal muscle.</a> Cell Biology International. 37 (2), 191-196 (2013).</li><li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+functional+human+skeletal+myotubes+in+a+defined+system.">In vitro differentiation of functional human skeletal myotubes in a defined system.</a> Biomaterials Science. 2 (1), 131-138 (2014).</li><li>Denes, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+C2C12+myotubes+on+micromolded+gelatin+hydrogels+accelerates+myotube+maturation.">Culturing C2C12 myotubes on micromolded gelatin hydrogels accelerates myotube maturation.</a> Skeletal Muscle. 9 (1), 17 (2019).</li><li>Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+mature+myofibers+for+live+imaging.">In vitro differentiation of mature myofibers for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).</li><li>Khodabukus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+skeletal+muscle+models+to+study+muscle+function,+plasticity,+and+disease.">Tissue-engineered skeletal muscle models to study muscle function, plasticity, and disease.</a> Frontiers in Physiology. 12, 619710 (2021).</li><li>Engler, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotubes+differentiate+optimally+on+substrates+with+tissue-like+stiffness:+Pathological+implications+for+soft+or+stiff+microenvironments.">Myotubes differentiate optimally on substrates with tissue-like stiffness: Pathological implications for soft or stiff microenvironments.</a> Journal of Cell Biology. 166 (6), 877-887 (2004).</li><li>Huang, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotube+assembly+on+nanofibrous+and+micropatterned+polymers.">Myotube assembly on nanofibrous and micropatterned polymers.</a> Nano Letters. 6 (3), 537-542 (2006).</li><li>Earle, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+lamins+cause+nuclear+envelope+rupture+and+DNA+damage+in+skeletal+muscle+cells.">Mutant lamins cause nuclear envelope rupture and DNA damage in skeletal muscle cells.</a> Nature Materials. 19 (4), 464-473 (2020).</li><li>Stange, K., Ahrens, H. E., von Maltzahn, J., Rontgen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+ex+vivo+cultivation+of+single+myofibers+from+porcine+muscle.">Isolation and ex vivo cultivation of single myofibers from porcine muscle.</a> In Vitro Cellular and Developmental Biology. Animal. 56 (8), 585-592 (2020).</li><li>Ravenscroft, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociated+flexor+digitorum+brevis+myofiber+culture+system--A+more+mature+muscle+culture+system.">Dissociated flexor digitorum brevis myofiber culture system--A more mature muscle culture system.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (10), 727-738 (2007).</li><li>Ramsey, R. W., Street, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isometric+length-tension+diagram+of+isolated+skeletal+muscle+fibers+of+the+frog.">The isometric length-tension diagram of isolated skeletal muscle fibers of the frog.</a> Journal of Cellular and Comparative Physiology. 15 (1), 11-34 (1940).</li><li>Selvin, D., Hesse, E., Renaud, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+single+FDB+fibers+following+a+collagenase+digestion+for+studying+contractility,+fatigue,+and+pCa-sarcomere+shortening+relationship.">Properties of single FDB fibers following a collagenase digestion for studying contractility, fatigue, and pCa-sarcomere shortening relationship.</a> American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), R467-R479 (2015).</li><li>Renzini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+conditions+influence+satellite+cell+activation+and+survival+of+single+myofibers.">Culture conditions influence satellite cell activation and survival of single myofibers.</a> European Journal of Translational Myology. 28 (2), 7567 (2018).</li><li>Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+individual+myofibers+and+their+satellite+cells+from+adult+skeletal+muscle.">Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).</li><li>Holmberg, J., Durbeej, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin-211+in+skeletal+muscle+function.">Laminin-211 in skeletal muscle function.</a> Cell Adhesion and Migration. 7 (1), 111-121 (2013).</li><li>Stuelsatz, P., Keire, P., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+immunostaining+of+skeletal+muscle+myofibers+from+wildtype+and+nestin-GFP+mice+as+a+means+to+analyze+satellite+cell.">Isolation, culture, and immunostaining of skeletal muscle myofibers from wildtype and nestin-GFP mice as a means to analyze satellite cell.</a> Methods in Molecular Biology. 1556, 51-102 (2017).</li><li>Alkhateeb, H., Chabowski, A., Bonen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+of+the+isolated+soleus+muscle+during+long-term+incubation.">Viability of the isolated soleus muscle during long-term incubation.</a> Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism. 31 (4), 467-476 (2006).</li><li>Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+maximum+isometric+force+generated+by+permeabilized+skeletal+muscle+fibers.">Measurement of maximum isometric force generated by permeabilized skeletal muscle fibers.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), e52695 (2015).</li><li>Ottenheijm, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+myofilament+function+depresses+force+generation+in+patients+with+nebulin-based+nemaline+myopathy+(NEM2).">Altered myofilament function depresses force generation in patients with nebulin-based nemaline myopathy (NEM2).</a> Journal of Structural Biology. 170 (2), 334-343 (2010).</li><li>Rausch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+skeletal+muscle+fiber+contractility+with+high-speed+traction+microscopy.">Measurement of skeletal muscle fiber contractility with high-speed traction microscopy.</a> Biophysical Journal. 118 (3), 657-666 (2020).</li><li>de Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KBTBD13+is+an+actin-binding+protein+that+modulates+muscle+kinetics.">KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 754-767 (2020).</li><li>Wijnker, P. J. M., vander Velden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation-specific+pathology+and+treatment+of+hypertrophic+cardiomyopathy+in+patients,+mouse+models+and+human+engineered+heart+tissue.+Biochimica+et+Biophysica+Acta.">Mutation-specific pathology and treatment of hypertrophic cardiomyopathy in patients, mouse models and human engineered heart tissue. Biochimica et Biophysica Acta.</a> Molecular Basis of Disease. 1866 (8), 165774 (2020).</li><li>Cheng, A. J., Westerblad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+isolation,+and+measurement+of+force+and+myoplasmic+free+[Ca(2+)]+in+fully+intact+single+skeletal+muscle+fibers.">Mechanical isolation, and measurement of force and myoplasmic free [Ca(2+)] in fully intact single skeletal muscle fibers.</a> Nature Protocols. 12 (9), 1763-1776 (2017).</li><li>Cao, L., Manders, E., Helmes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+detection+of+adult+cardiomyocyte+for+high+throughput+measurements+of+calcium+and+contractility.">Automatic detection of adult cardiomyocyte for high throughput measurements of calcium and contractility.</a> PLoS One. 16 (9), e0256713 (2021).</li><li>Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirci, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics.">Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics.</a> Nanomedicine. 5 (3), 469-484 (2010).</li><li>Lin, C. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG+hydrogels+for+the+controlled+release+of+biomolecules+in+regenerative+medicine.">PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative medicine.</a> Pharmaceutical Research. 26 (3), 631-643 (2009).</li><li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sylgard-coated+coverslips+and+petri+dishes.">Sylgard-coated coverslips and petri dishes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2022 (8), (2022).</li><li>Moo, E. K., Fortuna, R., Sibole, S. C., Abusara, Z., Herzog, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+sarcomere+lengths+and+sarcomere+elongations+are+not+uniform+across+an+intact+muscle.">In vivo sarcomere lengths and sarcomere elongations are not uniform across an intact muscle.</a> Frontiers in Physiology. 7, 187 (2016).</li><li>Moo, E. K., Leonard, T. R., Herzog, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sarcomere+force-length+relationship+in+an+intact+muscle-tendon+unit.">The sarcomere force-length relationship in an intact muscle-tendon unit.</a> Journal of Experimental Biology. 223, 215020 (2020).</li><li>Schuler, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+remodeling+of+the+extracellular+matrix+during+aging+contributes+to+age-dependent+impairments+of+muscle+stem+cell+functionality.">Extensive remodeling of the extracellular matrix during aging contributes to age-dependent impairments of muscle stem cell functionality.</a> Cell Reports. 35 (10), 109223 (2021).</li><li>Carberry, S., Zweyer, M., Swandulla, D., Ohlendieck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+reveals+drastic+increase+of+extracellular+matrix+proteins+collagen+and+dermatopontin+in+the+aged+mdx+diaphragm+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Proteomics reveals drastic increase of extracellular matrix proteins collagen and dermatopontin in the aged mdx diaphragm model of Duchenne muscular dystrophy.</a> International Journal of Molecular Medicine. 30 (2), 229-234 (2012).</li><li>Tarpey, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+utilization+of+the+flexor+digitorum+brevis+for+assessing+skeletal+muscle+function.">Characterization and utilization of the flexor digitorum brevis for assessing skeletal muscle function.</a> Skeletal Muscle. 8 (1), 14 (2018).</li></ol>

У авторов нет конфликтов интересов, о которых можно было бы заявить.

Здесь мы подробно описываем протокол для выполнения ферментативной изоляции и культивирования мышечных волокон FDB в формате 3D-культуры с последующими сократительными измерениями с использованием системы измерения сократительности на основе оптики. Этот протокол имеет ряд преимуществ, среди которых: 1) прямая и своевременная изоляция многих интактных мышечных волокон из одной мышцы; 2) встраивание мышечных волокон в перестраиваемую гидрогелевую матрицу; 3) проведение высокопроизводительных измерений сократительной способности с использованием системы на основе оптики; и 4) возможность проводить повторные измерения одних и тех же мышечных волокон после вмешательства. Выделение единичных живых мышечных волокон обеспечивает зрелые мышечные клетки, которые сохраняют свою сократительную функцию. Поскольку мышечные волокна, полученные из FDB мыши, относительно невелики, ими легко манипулировать во время изоляции и они сохраняют свою прямую форму, что позволяет проводить последующие сократительные измерения. Хотя система была в первую очередь разработана для изучения сокращения кардиомиоцитов, волокна скелетных мышц содержат тот же сократительный механизм с легко различимым рисунком саркомера и, таким образом, также могут быть измерены с помощью этой системы29. Сочетание одноклеточных сократительных измерений с живой культурой мышечных волокон ex vivo является мощным инструментом для оценки здоровья и функционирования зрелых мышечных волокон в ответ на электрическую активацию. 
Ограничением использования диссоциированных мышечных волокон является отсутствие внешних сил (т.е. пассивного растяжения), приложенных к волокнам, что приводит к более низкой длине саркомера в состоянии покоя по сравнению с теми, которые обнаруживаются in vivo. Хотя длина саркомера 2,4-2,5 мкм обеспечивает оптимальное производство силы, длина саркомера в состоянии покоя может сильно варьироваться33. В то время как длина саркомера в покое in vivo FDB еще не описана, наши собственные неопубликованные данные предполагают среднюю длину 2,2 мкм. Текущие результаты показывают среднюю длину саркомера в состоянии покоя ~ 1,95 мкм в ненагруженных волокнах FDB после 24 ч в культуре (рис. 3). Хотя эта меньшая длина саркомера в покое приведет к снижению выработки силы, длина ~ 1,95 мкм все равно должна производить >90% от максимальной силы34. Таким образом, этих длин саркомеров должно быть достаточно для определения различий в функции волокон между различными генетическими моделями или после медикаментозного лечения. Кроме того, встраивание волокон в гидрогель обеспечивает много дополнительных точек адгезии по сравнению со свободно плавающими 2D-культивируемыми волокнами, что ограничивает дальнейшее укорочение саркомера с течением времени.
Одним из преимуществ этого протокола изоляции мышечных волокон является использование легко рассекаемой быстро сокращающейся мышцы, состоящей из относительно небольших мышечных волокон по сравнению с другими мышцами, такими как длинный разгибатель пальцев (EDL). Их меньший размер делает мышечную изоляцию более подходящей для разделения на основе растирания, тем самым снижая вероятность повреждения мышечных волокон, вызванного пипеткой или клубком. Внеклеточный матрикс мышц FDB может быть легко ферментативно переварен с помощью коллагеназы, что позволяет изолировать сотни мышечных волокон за короткий промежуток времени. Однако чрезмерное переваривание может привести к повреждению мышечных волокон. Чрезмерное переваривание мышечных волокон можно распознать, когда мышца разваливается почти мгновенно при растирании мышцы или когда большая часть объема клеток гиперсокращается во время процедуры посева клеток. Чтобы предотвратить чрезмерное переваривание мышц, время переваривания должно быть оптимизировано для каждой партии коллагеназы. Чтобы проверить это, две мышцы FDB следует переваривать параллельно с поэтапным временем переваривания 5 минут между ними. Следует выбирать время переваривания с наибольшим выходом жизнеспособных мышечных волокон. Затем эту оптимизацию следует выполнить во второй раз, снова с 5-минутным разделением во время переваривания. Время переваривания, дающее самые жизнеспособные мышечные волокна, следует использовать в качестве оптимального времени переваривания для текущей партии коллагеназы. Другой способ ограничить вариабельность коллагеназы от партии к партии - это напрямую рассчитать единицы активности на миллилитр исходного раствора, а затем восстановить последующие партии коллагеназы до того же количества. Наконец, время пищеварения, возможно, потребуется оптимизировать для разных штаммов мышей, например, при изучении старых или больных животных, у которых наблюдается повышенное отложение внеклеточного матрикса35,36.
Возможность пипетки жизнеспособных изолированных мышечных волокон открывает возможности для культивирования мышечных волокон FDB в различных условиях культивирования. Одним из таких вариантов является культивирование этих волокон в гидрогелях для имитации нативной среды культивирования тканей. Этот протокол встраивания гарантирует, что волокна остаются на месте во время сократительных измерений, и был оптимизирован для того, чтобы волокна оседали на дно пластины до того, как гель застынет. Тем не менее, этот протокол, возможно, должен быть скорректирован с учетом различий в запасах тромбина и фибриногена. Если активность тромбина слишком высока, гель преждевременно застынет, и волокна могут оставаться во взвешенном состоянии в более высоких местах за пределами фокальной плоскости микроскопа. Если это произойдет, соотношение тромбин:фибриноген необходимо скорректировать. Это можно проверить, наложив волокна на все более низкие концентрации тромбина и обратив внимание на то, сколько времени занимает полимеризация. Как правило, это не должно происходить быстрее, чем через 30 минут. Однако слишком низкая концентрация тромбина также может ухудшить процесс полимеризации. Другой способ убедиться, что волокна находятся в правильной фокальной плоскости, заключается в том, чтобы сначала засеять их с использованием 2D-протокола, а затем добавить слой гидрогеля поверх волокон после того, как они прилипнут к культуральной пластине. Однако следует знать, что удаление среды из волокон может вызвать гиперсокращение, поскольку они чувствительны к высыханию. Также неясно, будет ли гидрогель полностью прикрепляться к культуральной пластине, и он может легче отсоединиться. Следовательно, эта процедура встраивания предпочтительна для поддержания жизнеспособности волокон и на месте для измерений сокращения.
Использование этого протокола позволяет изучать сократительную динамику зрелых мышечных волокон ex vivo и может быть применено как к здоровым мышам, так и к мышам, несущим генетические мутации мышечных заболеваний. Кроме того, он позволяет проверить, как условия культивирования или добавление соединений влияют на функцию мышечных волокон. Сократительные данные, полученные с помощью системы на основе оптики, дают представление о сократительной способности живых отдельных мышечных волокон, и изменения этой способности могут быть коррелированы со здоровьем волокон. Однако одних этих данных недостаточно, чтобы определить, происходят ли эти изменения на стадиях актин-миозинового перекрестного мостика или высвобождения кальция при мышечном сокращении. Хотя мы не описываем методы измерения кальциевой сигнализации в этом протоколе, эта установка также способна измерять кальциевые переходные процессы на основе фуры в сокращающихся мышечных клетках29. Недостатком этой системы является то, что мышца FDB содержит только быстро сокращающиеся мышечные волокна типа IIa/IIx, а мышцы, содержащие медленно сокращающиеся волокна типа I такого размера, еще не описаны37. Это исключает возможность изучения специфического функционирования оптоволокна с помощью этого метода. Протокол, который мы предлагаем здесь, потенциально может быть адаптирован для других мышц, таких как EDL или камбаловидная мышца, для изучения различий в типах волокон. Из-за их большего размера этот протокол необходимо будет дополнительно оптимизировать для этих мышц. Более длинные волокна имеют тенденцию запутываться на этапе гравитационного осаждения и разрываются при манипулировании пипеткой, что приведет к снижению выхода. Поэтому из-за их несовместимости с пипетированием более длинные волокна также менее совместимы с техникой заделки геля. Измерения этих волокон все еще могут быть выполнены в формате 2D-культуры, но волокна могут больше перемещаться во время сокращения из-за их размера, что влияет на отношение сигнал/шум. Другим ограничением этой системы является невозможность выполнять измерения силы наряду с сокращенными измерениями, такими как те измерения силы, которые могут быть получены с использованием других препаратов28 интактных мышечных волокон. Однако это ограничение можно обойти, оценив силу, создаваемую мышечным волокном. Генерируемую силу мышечных волокон можно оценить, если известны форма мышечных волокон в сокращенном и расслабленном состояниях, а также модуль Юнга матрицы25. Тем не менее, эта оптическая система обеспечивает простой в использовании и высокопроизводительный подход к изучению сократительной функции мышц и открывает ряд новых возможностей для изучения генетических заболеваний мышц и терапевтических вмешательств.

Достижения в методах культивирования клеток in vitro открыли новые возможности для изучения регенеративных возможностей тканей, патофизиологических клеточных механизмов и последующих терапевтических стратегий, и все это при использовании тканей млекопитающих в хорошо контролируемых условиях 1,2,3. Использование систем культивирования in vitro хорошо зарекомендовало себя в области исследований мышц 4,5. В целом, in vitro дифференцированные незрелые миотубы из миогенных клеток-предшественников используются 2,6,7,8. Несмотря на то, что был достигнут прогресс в протоколе дифференцировки для получения более зрелых мышечных волокон9, их незрелость по-прежнему ограничивает перевод результатов в условия in vivo 1,10. Одной из центральных проблем в области мышечной биологии является неспособность дифференцированных миотуб in vitro полностью олицетворять сложные внутриклеточные структуры, клеточные сигнальные процессы и внеклеточные взаимодействия, наблюдаемые в нативной мышечной ткани, и, что важно, повторять сократительные силы, создаваемые мышечными волокнами 1,2,10,11,12 . Кроме того, нескоординированное сокращение миотуб в процессе дифференцировки часто приводит к спонтанному отрыву от чашки культуры, что затрудняет сократительную оценку дифференцированных миотуб in vitro и ограничивает ее качественной или полуколичественной оценкой 8,11,12,13. Эти ограничения часто требуют регулярных экспериментов in vivo с животными, особенно если сократительная способность мышц является первичным экспериментальным результатом1.
Альтернативой культивированию дифференцированных миотуб in vitro является культура ex vivo изолированных зрелых мышечных волокон 1,14. Во время культивирования ex vivo зрелая мышечная ткань удаляется из организма с последующей изоляцией одной клетки для культивирования в лабораторных условиях 1,14. Изолированные зрелые мышечные волокна сохраняют свои сложные клеточные структуры, наблюдаемые в нативной ткани14,15, и этот метод открывает возможность для прямых вмешательств, таких как генетические манипуляции и скрининг лекарств, в четко определенной и контролируемой среде культуры. Одно из первых сообщений о выделении волокон скелетных мышц и культуре ex vivo датируется 1930-ми годами; Однако выход жизнеспособных волокон из этого протокола был низким16. При постоянной оптимизации процедуры выделения и условий культивирования теперь возможно значительное улучшение количества жизнеспособных и функциональных мышечных волокон 14,15,17,18,19. Одним из таких улучшений условий культивирования является покрытие культуральных чашек белками внеклеточного матрикса для содействия адгезии изолированных мышечных волокон к чашке для культивирования15,18,20. Обычно используется ламининовое покрытие, так как ламинин является одним из наиболее распространенных элементов во внеклеточном матриксе мышц20,21. Оптимизация процедуры выделения в сочетании с покрытием культуральных чашек позволила области исследований мышц сохранить изолированные жизнеспособные мышечные волокна с неповрежденной клеточной архитектурой и сократительной функциональностью в культуре в течение коротких периодов времени 1,15,18,22.
Наиболее традиционный подход, используемый в мышечном поле для измерения силы и сократительных способностей, заключается в установке отдельных мышечных волокон между двигателем драйвера длины и преобразователемсилы 23,24. Как правило, мышечные волокна, используемые для этих установок с моторным приводом, рассекаются либо из замороженной, либо из свежей ткани с последующей пермеабилизацией или «снятием кожи», что обеспечивает внешнюю активацию кальция, где различные концентрации кальция используются для индуцирования сокращениямышечных волокон 24. Хотя этот метод является золотым стандартом для измерения сократительности мышечных волокон, за один раз можно измерить только одно мышечное волокно, что делает этот метод трудоемкой и трудоемкой процедурой25. Кроме того, процедура изоляции и снятия шкуры мышечных волокон нарушает различные структуры, участвующие в связывании возбуждения-сокращения (т. е. высвобождении кальция и последующем обратном захвате в саркоплазматический ретикулум), тем самым не позволяя изучать кинетику релаксации и любые заболевания, которые могут повлиять на этот процесс26,27. Альтернативой препарату очищенных волокон является использование механического рассечения для выделения интактных мышечных волокон, где сократительные силы могут быть измерены в ответ на электрическую активацию28; Однако этот подход является технически сложным и очень трудоемким, что приводит к низкой пропускной способности измерений. Наконец, как в кожевенных, так и в интактных препаратах мышечные клетки полностью удаляются из внеклеточной среды во время сократительных измерений 24, что делает невозможным исследование влияния состава/жесткости внеклеточного матрикса на сокращениемышечных волокон24. В результате необходима разработка альтернативных методов, позволяющих измерять сократимость мышечных волокон изолированных интактных мышечных волокон с высокой пропускной способностью, воссоздавая связь между мышечными волокнами и внеклеточным матриксом.
Недавно был разработан новый оптический подход к высокопроизводительным измерениям сократительной способности мышечных волокон29. Эта система, основанная на оптике, измеряет периодичность саркомеров для оценки длины саркомера во время сокращения с использованием высокоскоростной визуализации. В этой системе клетки остаются на месте в чашке для культивирования, в то время как оптика перемещается, тем самым сводя к минимуму время, необходимое между измерениями нескольких клеток29. Основным преимуществом использования этого высокопроизводительного подхода, основанного на оптике, является то, что он позволяет создавать условия культивирования, аналогичные условиям нативной ткани. Подход, используемый для имитации нативных условий in vivo, заключается во встраивании клеток в гидрогели30. Как правило, гидрогель представляет собой вязкоупругий материал, способный сохранять свой объем и форму, а гидрогели обладают свойствами как твердых, так и жидких материалов31. Твердая часть состоит из полимерных цепей, сшитых друг с другом, создавая структуру, похожую на сетку30,31. Свойства материала гидрогелей могут быть настроены таким образом, чтобы имитировать матричное осаждение мышц30,31. Таким образом, сочетание высокопроизводительной системы на основе оптики с клетками, встроенными в гидрогели, открывает новые возможности для оценки влияния состава внеклеточного матрикса и механических свойств на функциональность мышечных волокон.
Общая цель данной работы состоит в том, чтобы: 1) описать методологию ферментативной изоляции и культивирования мышечных волокон ex vivo в условиях, имитирующих нативную тканевую среду, и 2) оценить сократимость мышечных волокон с использованием высокопроизводительного подхода. Мы описываем подробную методологию, позволяющую легко выделить большое количество одиночных мышечных волокон из мышцы-сгибателя пальцев (FDB) с помощью ферментативного пищеварения. Кроме того, мы описываем технику встраивания изолированных мышечных волокон в гидрогель на основе фибрина с целью имитации нативной среды мышц и улучшения жизнеспособности и сократимости мышечных волокон. Затем мы описываем высокопроизводительный метод измерения сокращений живых мышечных волокон in vitro с использованием этой недавно разработанной системы. Дополнительным преимуществом этой процедуры встраивания является иммобилизация волокон во время сокращения, что может улучшить отношение сигнал/шум этих измерений. Этот метод встраивания геля применим как для процедур инкапсуляции однополимерного, так и для композитного геля, облегчая оценку влияния состава внеклеточного матрикса на сократимость мышечных волокон.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aprotinin, from Bovine Lung</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AAJ63039MC</td>
			<td>100 mM stock solution in PBS can be stored at -20 &#176;C.&#160; Sterilize stock solution using a 0.22 &#181;m filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 2</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>77336</td>
			<td>10% (w/v) stock solution can be stored at -20 &#176;C. Weighing collagenase should be done in a safety cabinet as inhalation is dangerous.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen from Bovine Plasma</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>50-176-5054</td>
			<td>20 mg/mL stock solution in PBS can be stored at -80 &#176;C. Sterilize stock solution using a 0.22 &#181;m filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1413201</td>
			<td>4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco MEM High glucose + pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11095080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>H1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel GFR Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB-40230</td>
			<td>4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum Replacement 2 (50x)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin, Bovine Plasma</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AAJ63383EXP</td>
			<td>125 U/mL stock in PBS can be stored at -20 &#176;C. Sterilize stock solution using a 0.22 &#181;m filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tranexamic Acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AC228042500</td>
			<td>80 mM stock solution in PBS can be stored at -20 &#176;C.&#160; Sterilize stock solution using a 0.22 &#181;m filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well electrical stimulator</td>
			<td>IonOptix</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiCell Cytocypher</td>
			<td>IonOptix</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyoCam-S3</td>
			<td>IonOptix</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyoPacer</td>
			<td>IonOptix</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 silicone elastomer, Base &#38; Curing Agent&#160;</td>
			<td>Dow corning&#160;</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissor - 25 mm Cutting Edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15002-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoSolver</td>
			<td>IonOptix</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonWizard</td>
			<td>IonOptix</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput contractile measurements of hydrogel-embedded intact mouse muscle fibers using an optics-based system

Культура клеток in vitro является мощным инструментом для оценки клеточных процессов и тестирования терапевтических стратегий. Для скелетных мышц наиболее распространенные подходы включают либо дифференцировку миогенных клеток-предшественников в незрелые миотубы, либо кратковременную культуру ex vivo изолированных отдельных мышечных волокон. Ключевым преимуществом культуры ex vivo по сравнению с in vitro является сохранение сложной клеточной архитектуры и сократительных характеристик. Здесь мы подробно описываем экспериментальный протокол выделения интактных мышечных волокон flexor digitorum brevis у мышей и их последующей культуры ex vivo . В этом протоколе мышечные волокна встроены в гидрогель на основе фибрина и матричного матричного слоя базальной мембраны для иммобилизации волокон и поддержания их сократительной функции. Затем мы описываем методы оценки сократительной функции мышечных волокон с использованием высокопроизводительной системы сократимости на основе оптики. Встроенные мышечные волокна электрически стимулируются, чтобы вызвать сокращения, после чего их функциональные свойства, такие как укорочение саркомера и скорость сокращения, оцениваются с использованием количественного определения на основе оптики. Объединение культуры мышечных волокон с этой системой позволяет проводить высокопроизводительные испытания влияния фармакологических агентов на сократительную функцию и исследования генетических мышечных нарушений ex vivo . Наконец, этот протокол также может быть адаптирован для изучения динамических клеточных процессов в мышечных волокнах с использованием микроскопии живых клеток.

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Contractile Measurements of Hydrogel-Embedded Intact Mouse Muscle Fibers Using an Optics-Based System at JoVE.com

High-Throughput Contractile Measurements of Hydrogel-Embedded Intact Mouse Muscle Fibers Using an Optics-Based System

Функция скелетных мышц может быть оценена путем количественной оценки сократительной способности изолированных мышечных волокон, традиционно используя трудоемкие подходы с низкой пропускной способностью. Здесь мы описываем основанный на оптике высокопроизводительный метод количественной оценки сократительной способности мышечных волокон, встроенных в гидрогель. Этот подход находит применение для скрининга лекарств и терапевтических разработок.

Высокопроизводительные сократительные измерения интактных мышечных волокон мыши, встроенных в гидрогель, с использованием оптической системы

In vitro cell culture is a powerful tool to assess cellular processes and test therapeutic strategies. For skeletal muscle, the most common approaches ...

Этот протокол может быть использован для оценки влияния генетических мутаций на функцию мышечных волокон. Кроме того, его можно использовать для скрининговых исследований лекарств, направленных на улучшение здоровья мышц. Этот метод может быть использован для выделения и измерения сократительной способности в большом количестве мышечных волокон за относительно короткий промежуток времени без необходимости повышения квалификации.Состав гидрогелей может быть изменен, чтобы засвидетельствовать влияние сигналов окружающей среды как на здоровые, так и на больные мышцы. Самой сложной частью процедуры является начальное рассечение мышцы. Если не соблюдать достаточную осторожность, повреждение мышцы может привести к снижению жизнеспособности мышечных волокон.Продемонстрацией процедуры будут Леандер Вонк, техник-исследователь, и Осман Эсен, кандидат наук в моей лаборатории. Начните с отрезания нижней задней ноги усыпленной мыши чуть выше лодыжки. Сделайте разрез на коже на тыльной стороне стопы по направлению к пальцам ног.Осторожно очистите кожу по направлению к пальцам ног, стараясь не повредить мышцы. Поместите рассеченную ногу в посуду для защиты от тюленей, содержащую 10 миллилитров предварительно разогретой диссекционной среды при температуре 37 градусов Цельсия. Проткните стопу через кожу, все еще прикрепленную к пальцам ног.Прижмите голень за лодыжку и аккуратно иссеките соединительную ткань поверх мышцы. Разрежьте сухожилие в пятке и поднимите мышцу. Разрезайте вдоль и под мышцей соединительную ткань до тех пор, пока не обнажятся сухожилия пальцев ног.Разрежьте сухожилия, когда обнажается половина длины трех сухожилий. Освободите мышцу стопы и надавите на сухожилия мышц FDB. Удалите оставшуюся соединительную ткань из мышцы.Перенесите чистую мышечную ткань в трубку, содержащую предварительно подогретую диссекционную среду. Используйте серологическую пипетку для переноса мышцы бревиса в трубку, содержащую мышечную среду для переваривания. Поместите ткань в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия при 5% углекислого газа на 80 минут.Перенесите мышцу в 15-миллилитровую трубку, содержащую три миллилитра диссекционной среды. Используя подготовленные наконечники для растирания, проведите пипеткой мышцу, идущую от самой большой к самой маленькой, и продолжайте растирание до тех пор, пока мышечные волокна не оторвутся от сухожилия. Сухожилия можно удалить с помощью наконечника P200.Перенесите диссоциированные мышечные волокна в 15-миллилитровую трубку, содержащую 10 миллилитров диссекционной среды. Дайте волокнам осесть в инкубаторе в течение 20 минут, пока не образуется гранула. Аккуратно нанесите пипеткой всю среду с верхней части волокнистой гранулы.На льду ресуспендируют клетки в 875 микролитрах клеточной смеси на мышцу. Добавьте 125 микролитров смеси матричных клеток в пробирки, содержащие 125 микролитров аликвоты клеточной суспензии. Смешайте легким пипетированием, избегая образования пузырьков.Готовую смесь сразу же переложите в лунку. Проверьте жизнеспособность мышечных волокон под микроскопом. Поместите гели в инкубатор на 30-45 минут, чтобы они способствовали затвердеванию.После этого осторожно добавьте по 500 микролитров питательной среды в каждую лунку. Включите систему измерения сократительной способности на основе оптики, люминесцентную лампу, электрокардиостимулятор и компьютер. Установите электростимулятор на 1,0 герц при напряжении 10 вольт с длительностью импульса пять миллисекунд для стимуляции изолированных мышечных волокон.Вставьте пластину в измерительную систему. Подсоедините иноходец к вкладышу и вставьте его в культуральную пластину. Откройте программу IonWizard.Нажмите кнопку ОК. Откройте новый файл, щелкнув значок «Файл», затем нажмите «Создать». Выберите «Собрать эксперимент», чтобы проверить, правильно ли программа настроена на скелетный саркомер эксперимента. Чтобы изменить эксперимент, нажмите на нужный эксперимент и нажмите кнопку Добавить.Примените настройки SARC 20X, средние линии, одиночный БПФ, частоту дискретизации 250 Гц и время сбора данных 10 секунд. Измените температуру измерительной системы на 25 градусов по Цельсию. Нажмите на средство поиска открытых ячеек, чтобы создать новое всплывающее окно экрана.Выберите тип пластины и активные скважины. Сфокусируйте волокна, отрегулировав ползунок фокусировки. Включите стимуляцию, чтобы вызвать электрическую стимуляцию, и наблюдайте за подергиванием волокон.Удерживая саркомеры в фокусе, убедитесь, что область измерения зафиксирована на конце волокна таким образом, чтобы саркомеры проходили вертикально. Когда саркомеры сфокусированы, на панели инструментов виден один пик, который при сокращении смещается вправо. Измерьте волокна на измерительной системе.Нажмите кнопку Пуск, чтобы начать эксперимент. Нажмите клавишу Q, чтобы начать измерение 10 переходных процессов сокращения. Если более четырех переходных процессов выглядят бесшумными, примите измерение, нажав клавишу Z.Если переходные процессы содержат слишком много шума, отклоните измерения. Нажмите кнопку «Стоп», чтобы закрыть окно поиска ячеек после завершения эксперимента. Сохраните файл и создайте новый.Откройте рабочий стол программы CytoSolver, затем нажмите «Импорт» и выберите файлы для анализа. После завершения анализа определите синий, красный и серый пики. Нажмите «Экспорт».Установите флажки под названием «Средние и временные данные» и экспортируйте их в Excel. Более высокий процент пригодных для использования измерений сократительных мышц был получен в 3D-гидрогеле фибрина, поскольку он предотвращал боковые движения и другие влияющие факторы. Встраивание волокон не оказало существенного влияния на максимальную скорость сокращения или укорочение саркомера.Наблюдалось снижение сокращения в чистом базисном матриксе, вероятно, из-за жесткости геля или повышенного взаимодействия с клеточным матриксом. Точно так же встраивание фундаментальной матрицы также уменьшало укорочение саркомера по сравнению с гидрогелем фибрина. Важно помнить, что изолированные мышечные волокна довольно хрупкие, и следует проявлять особую осторожность, чтобы не повредить их во время пипетки.После процедуры выделения также могут быть выполнены такие методы, как иммуноокрашивание, выделение белка и РНК. Развитие этого метода открыло новые возможности для изучения функции зрелых мышечных волокон с высокой пропускной способностью.

Research

JoVE Journal

Biology

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Процедуры для Крысы<em&gt; На месте</em&gt; Скелетных мышц сократительные свойства

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

РНК предсказание вторичной Структура Использование высоких-пропускная способность SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

Высокая пропускная метод измерения скорости клубочковой фильтрации в сознании Мыши

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Оценка кальция Sparks в малонарушенных скелетных мышечных волокон

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Высокопроизводительный скрининг для химических модуляторов посттранскрипционно регулируемых генов

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Идентификация киназы-подложки пар Использование высокопроизводительного скрининга


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Выделение митохондрий из минимальных количествах мыши скелетных мышц для измерения Высокая пропускная микропланшетов дыхания

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

Multi-фермента скрининга с использованием высокой пропускной Генетическая ферментного Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...