Name: isolation and culture of human adipose-derived stem cells with an innovative xenogeneic-free method for human therapy
Uploaded: 2023-02-03T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Human Adipose-Derived Stem Cells With an Innovative Xenogeneic-Free Method for Human Therapy at JoVE.com

De auteurs hebben geen erkenningen.

hASCs werden geïsoleerd uit het buikvetweefsel van een gezonde vrouw die een borstreconstructie onderging met behulp van abdominale autologe flappen (diepe inferieure epigastrische perforatorflappen, [DIEP]) in het Universitair Ziekenhuis van Lausanne, CHUV, Lausanne, Zwitserland. Het weggegooide deel van de flap en het vetweefsel werd verkregen nadat de patiënt geïnformeerde toestemming had ondertekend. Alle protocollen werden beoordeeld en goedgekeurd door de Biobank afdeling DAL (nummer 314 GGC) van het ziekenhuis ...

<ol>
	<li>Naderi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regenerative+role+of+adipose-derived+stem+cells+(ADSC)+in+plastic+and+reconstructive+surgery.">The regenerative role of adipose-derived stem cells (ADSC) in plastic and reconstructive surgery.</a> International Wound Journal. 14 (1), 112-124 (2017).</li><li>Guiotto, M., Riehle, M. O., Raffoul, W., Hart, A., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+human+platelet+lysate+(hPL)+the+ideal+candidate+to+substitute+the+foetal+bovine+serum+for+cell-therapy+translational+research.">Is human platelet lysate (hPL) the ideal candidate to substitute the foetal bovine serum for cell-therapy translational research.</a> Journal of Translational Medicine. 19 (1), 426 (2021).</li><li>Cond&#233;-Green, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shift+toward+mechanical+isolation+of+adipose-derived+stromal+vascular+fraction:+Review+of+upcoming+techniques.">Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: Review of upcoming techniques.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 4 (9), 1017 (2016).</li><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+Implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+adipose-derived+stem+cells+and+collagenase+in+fat+tissue+preparation.">Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation.</a> Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).</li><li>Spees, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalized+antigens+must+be+removed+to+prepare+hypoimmunogenic+mesenchymal+stem+cells+for+cell+and+gene+therapy.">Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy.</a> Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).</li><li>Fadel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+obtainment+and+isolation+of+two+mesenchymal+stem+cell+sources+in+sheep.">Protocols for obtainment and isolation of two mesenchymal stem cell sources in sheep.</a> Acta Cirurgica Brasileria. 26 (4), 267-273 (2011).</li><li>Markarian, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adipose-derived+stem+cells:+A+comparison+among+different+methods.">Isolation of adipose-derived stem cells: A comparison among different methods.</a> Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).</li><li>Sherman, L. S., Cond&#233;-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-free+method+for+isolation+and+expansion+of+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells.">An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).</li><li>Lalu, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+cell+therapy+with+mesenchymal+stromal+cells+(SafeCell):+A+systematic+review+and+meta-analysis+of+clinical+trials.">Safety of cell therapy with mesenchymal stromal cells (SafeCell): A systematic review and meta-analysis of clinical trials.</a> PLoS One. 7 (10), 47559 (2012).</li><li>Escobar, C. H., Chaparro, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xeno-free+extraction,+culture,+and+cryopreservation+of+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells.">Xeno-free extraction, culture, and cryopreservation of human adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 5 (3), 358-365 (2016).</li><li>Vaidya, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet-C+irradiation+for+inactivation+of+viruses+in+foetal+bovine+serum.">Ultraviolet-C irradiation for inactivation of viruses in foetal bovine serum.</a> Vaccine. 36 (29), 4215-4221 (2018).</li><li>Kyll&#246;nen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+serum+conditions+on+osteogenic+differentiation+of+human+adipose+stem+cells+in+vitro.">Effects of different serum conditions on osteogenic differentiation of human adipose stem cells in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (1), 17 (2013).</li><li>Schallmoser, K., Henschler, R., Gabriel, C., Koh, M. B. C., Burnouf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+quality+requirements+of+human+platelet+lysate:+A+position+statement+from+the+Working+Party+on+Cellular+Therapies+of+the+International+Society+of+Blood+Transfusion.">Production and quality requirements of human platelet lysate: A position statement from the Working Party on Cellular Therapies of the International Society of Blood Transfusion.</a> Trends in Biotechnology. 38 (1), 13-23 (2020).</li><li>Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+to+substitute+fetal+bovine+serum+in+hMSC+expansion+for+translational+applications:+A+systematic+review.">Human platelet lysate to substitute fetal bovine serum in hMSC expansion for translational applications: A systematic review.</a> Journal of Translational Medicine. 18 (1), 351 (2020).</li><li>Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+acts+synergistically+with+laminin+to+improve+the+neurotrophic+effect+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+primary+neurons.">Human platelet lysate acts synergistically with laminin to improve the neurotrophic effect of human adipose-derived stem cells on primary neurons.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 658176 (2021).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Cowper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+as+a+functional+substitute+for+fetal+bovine+serum+in+the+culture+of+human+adipose+derived+stromal/stem+cells.">Human platelet lysate as a functional substitute for fetal bovine serum in the culture of human adipose derived stromal/stem cells.</a> Cells. 8 (7), 724 (2019).</li><li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+the+treatment+and+prevention+of+graft-versus-host+disease:+Experiments+and+practice.">Mesenchymal stem cells for the treatment and prevention of graft-versus-host disease: Experiments and practice.</a> Annals of Hematology. 92 (10), 1295-1308 (2013).</li><li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+metal+micro+and+nano-particles+on+hASCs:+An+in+vitro+model.">Effects of metal micro and nano-particles on hASCs: An in vitro model.</a> Nanomaterials. 7 (8), 212 (2017).</li><li>Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stromal+vascular+fraction+cells:+Update+on+clinical+utility+and+efficacy.">Adipose-derived stromal vascular fraction cells: Update on clinical utility and efficacy.</a> Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).</li><li>Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+medium+composition+and+translational+adult+bone+marrow-derived+stem+cell+research.">Cell culture medium composition and translational adult bone marrow-derived stem cell research.</a> Stem Cells. 24 (5), 1409-1410 (2006).</li><li>Perez-Ilzarbe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+ex+vivo+expansion+culture+conditions+of+mesenchymal+stem+cells+for+human+cell+therapy.">Comparison of ex vivo expansion culture conditions of mesenchymal stem cells for human cell therapy.</a> Transfusion. 49 (9), 1901-1910 (2009).</li><li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+cell-detaching+methods+on+the+viability+and+cell+surface+antigen+expression+of+synovial+mesenchymal+stem+cells.">Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li><li>Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-enzymatic+method+for+isolating+human+adipose+tissue-derived+stromal+stem+cells.">A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells.</a> Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).</li><li>Becherucci, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+in+mesenchymal+stromal+cell+expansion+according+to+a+GMP+grade+protocol:+A+cell+factory+experience.">Human platelet lysate in mesenchymal stromal cell expansion according to a GMP grade protocol: A cell factory experience.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 124 (2018).</li><li>Blande, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+mesenchymal+stem+cell+expansion+in+animal+serum-free+medium+supplemented+with+autologous+human+platelet+lysate.">Adipose tissue mesenchymal stem cell expansion in animal serum-free medium supplemented with autologous human platelet lysate.</a> Transfusion. 49 (12), 2680-2685 (2009).</li><li>Castegnaro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+platelet+lysate+on+the+functional+and+molecular+characteristics+of+mesenchymal+stem+cells+isolated+from+adipose+tissue.">Effect of platelet lysate on the functional and molecular characteristics of mesenchymal stem cells isolated from adipose tissue.</a> Current Stem Cell Research &amp; Therapy. 6 (2), 105-114 (2011).</li><li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+review+and+meta-analysis+on+the+use+of+human+platelet+lysate+for+mesenchymal+stem+cell+cultures:+Comparison+with+fetal+bovine+serum+and+considerations+on+the+production+protocol.">Systematic review and meta-analysis on the use of human platelet lysate for mesenchymal stem cell cultures: Comparison with fetal bovine serum and considerations on the production protocol.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 13 (1), 142 (2022).</li><li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+as+a+potential+clinical-translatable+supplement+to+support+the+neurotrophic+properties+of+human+adipose-derived+stem+cells.">Human platelet lysate as a potential clinical-translatable supplement to support the neurotrophic properties of human adipose-derived stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (1), 432 (2020).</li><li>Kr&#228;henb&#252;hl, S. M., Grognuz, A., Michetti, M., Raffoul, W., Applegate, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+human+adipose-derived+stem+cell+expansion+and+stability+for+clinical+use.">Enhancement of human adipose-derived stem cell expansion and stability for clinical use.</a> International Journal of Stem Cell Research &amp; Therapy. 2 (1), 007 (2015).</li></ol>

Van vetweefsel afgeleide stamcellen hebben de afgelopen tien jaar de belangstelling van translationeel onderzoek getrokken vanwege hun overvloed, snelle en betaalbare isolatiemethoden, hoge in vitro / in vivo proliferatiesnelheid en stam / differentiatie-eigenschappen18,19,20. Als gevolg hiervan worden hASCs beschouwd als een uitstekende kandidaat voor celgebaseerde strategieën in regeneratieve geneeskunde<sup...

In de afgelopen decennia heeft de toenemende vraag naar innovatieve therapeutische behandelingen geleid tot aanzienlijke inspanningen en investeringen in middelen op het gebied van translationele geneeskunde1. Celgebaseerde producten worden geassocieerd met risico's die worden bepaald door de celbron, het productieproces (isolatie, expansie of genetische modificatie) en de niet-cellulaire supplementen (enzymen, groeifactoren, kweeksupplementen en antibiotica), en deze risicofactoren zijn afhankelijk van de specifieke therapeutische indicatie. De kwaliteit, veiligheid en werkzaamheid van het eindproduct kunnen sterk worden beïnvloed door de hierboven aangegeven elementen2. Stamceltherapie vereist naleving van bioveiligheidsprincipes; De potentiële risico's van pathogene overdracht met dierlijke producten in celkweek kunnen problematisch zijn, en het grondig testen van elk product dat bij de productie wordt geïntroduceerd, is essentieel3.
De traditionele methode om menselijke vet-afgeleide stamcellen (hASCs) te isoleren, omvat een enzymatische vertering uitgevoerd met collagenase gevolgd door wasstappen door centrifugatie4. Hoewel enzymatische isolatie over het algemeen als efficiënter wordt beschouwd dan andere mechanische technieken in termen van celopbrengst en levensvatbaarheid, worden de gebruikte dierlijke componenten, zoals collagenase, beschouwd als meer dan minimaal gemanipuleerd door de Amerikaanse Food and Drug Administration. Dit betekent dat er een significant verhoogd risico is op immuunreacties of ziekteoverdracht, waardoor de vertaling van hASC-therapie naar klinische settingswordt beperkt 5,6.
Op trypsine gebaseerde spijsvertering is een ander enzymatisch protocol om ASC's te isoleren. Verschillende technieken zijn beschreven met kleine wijzigingen in termen van de trypsineconcentratie, centrifugatiesnelheid en incubatietijd. Helaas is deze methode niet goed beschreven en bestaat er een gebrek aan vergelijking in de literatuur, met name met de mechanische isolatieprotocollen7. In termen van de vertaalbaarheid van de aanpak heeft trypsine echter dezelfde nadelen van collagenase.
Alternatieve isolatiemethoden om ASC's te verkrijgen, gebaseerd op mechanische krachten en zonder enzymtoevoeging, omvatten snelle centrifugatie (800 x g of 1.280 x g, 15 min) van de vetweefselfragmenten. Vervolgens wordt de pellet geïncubeerd met een rode bloedcellysisbuffer (5 min), gevolgd door een andere centrifugatiestap bij 600 x g voordat deze in kweekmedium wordt geresuspenseerd. Ondanks dat een groter aantal cellen in de eerste dagen werd geïsoleerd in vergelijking met de explantatiemethoden, toonde een eerdere studie een lagere of afwezige proliferatie na de tweede week van cultuur8.
Daarnaast is verdere manipulatie met xenogeen toegevoegd medium, zoals foetaal runderserum (FBS), dat wordt gebruikt als groeifactorsupplement voor celkweek, geassocieerd met een verhoogd risico op immuunreactiviteit en blootstelling aan virale, bacteriële of prioninfecties van de gastheerpatiënt 9,10. Immuunreacties en de ontwikkeling van urticariforme huiduitslag zijn al beschreven bij personen die verschillende doses mesenchymale stamcellen kregen die werden geproduceerd met FBS11. Bovendien is FBS onderhevig aan batch-to-batch variabiliteit, wat van invloed kan zijn op de uiteindelijke productkwaliteit12.
In overeenstemming met de richtlijnen voor goede productiepraktijken (GMP) moet enzymatische weefseldissociatie worden vermeden en moet FBS worden vervangen door xenogene-vrije supplementen. Deze stappen, samen met betrouwbaardere en reproduceerbare protocollen, zijn essentieel om de toepassing van celtherapiete ondersteunen 3,13.
In deze context is humaan bloedplaatjeslysaat (hPL) voorgesteld als een substituut voor FBS, omdat het een celvrij, eiwitbevattend, met groeifactor verrijkt supplement is, en het werd eerder geïntroduceerd onder op klinische kwaliteit op cellen gebaseerde producten als een additief van groeimedium voor in vitro celkweek en expansie14,15. Aangezien hPL een van de mens afgeleid product is, wordt het vaak gebruikt als vervanging voor FBS tijdens de in vitro kweek van hASCs bedoeld voor klinische toepassingen, waardoor problemen met immunologische reacties en infecties gerelateerd aan FBS-vertaalbaarheid worden verminderd15,16.
Ondanks de hogere productiekosten is al aangetoond dat hPL in vergelijking met FBS de levensvatbaarheid van cellen voor veel celtypen ondersteunt, de proliferatie verhoogt, de senescentie vertraagt, genomische stabiliteit garandeert en het cellulaire immunofenotype behoudt, zelfs in late celpassages; Al deze elementen ondersteunen de omschakeling naar dit cultuursupplement11.
Het doel van dit werk was om een gestandaardiseerd protocol te ontwikkelen om hASCs te isoleren en te kweken met een volledige diervrije methode, zonder de celfysiologie en stamheidseigenschappen te wijzigen in vergelijking met klassieke FBS-gekweekte hASCs (figuur 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>euroclone</td>
			<td>et5015b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD105</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD560839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD34</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD555821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD555482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD73</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD561254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer)</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument)</td>
			<td>BD accuri</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burker chamber</td>
			<td>Blaubrand</td>
			<td>717810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell freezing container</td>
			<td>corning</td>
			<td>CLS432002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell Freezing container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS432002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>clearline</td>
			<td>390701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposabile blade scalpel</td>
			<td>paragon</td>
			<td>bs 2982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Platelet Lysate FD (GMP grade)</td>
			<td>Stemulate</td>
			<td>PL-NH-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite F50 spectrophotometer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 10 cm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scalpels</td>
			<td>Reda</td>
			<td>07104-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissors</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>4071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tweezers</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>1152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging bucket centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3-16K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flasks</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>6910170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLe (animal free trypsin substitute)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12604-013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of human adipose-derived stem cells with an innovative xenogeneic-free method for human therapy

Gezien de toenemende impact van stamceltherapie zijn er zorgen geuit over de bioveiligheid met betrekking tot mogelijke besmetting of infectieoverdracht als gevolg van de introductie van dierlijke producten tijdens in vitro manipulatie. De xenogene componenten, zoals collagenase of foetaal runderserum, die vaak worden gebruikt tijdens de celisolatie en expansiestappen, kunnen worden geassocieerd met de potentiële risico's van immuunreactiviteit of virale, bacteriële en prioninfectie bij de ontvangende patiënten. Volgens de richtlijnen voor goede productiepraktijken moet dissociatie van chemisch weefsel worden vermeden, terwijl foetaal runderserum (FBS) kan worden vervangen door xenogene-vrije supplementen. Om de veiligheid van celproducten te waarborgen, is bovendien de definitie van betrouwbaardere en reproduceerbare methoden belangrijk. We hebben een innovatieve, volledig xenogeneïsche vrije methode ontwikkeld voor de isolatie en in vitro expansie van menselijke vet-afgeleide stamcellen zonder hun eigenschappen te veranderen in vergelijking met collagenase FBS-gekweekte standaardprotocollen. Hier werden menselijke vet-afgeleide stamcellen (hASCs) geïsoleerd uit abdominaal vetweefsel. Het monster werd mechanisch gehakt met een schaar / een scalpel, micro-ontleed en mechanisch gedispergeerd in een petrischaal van 10 cm, en bereid met scalpelincisies om de aanhechting van de weefselfragmenten en de migratie van hASCs te vergemakkelijken. Na de wasstappen werden hASC's geselecteerd vanwege hun plastische hechting zonder enzymatische vertering. De geïsoleerde hASCs werden gekweekt met medium aangevuld met 5% heparinevrij humaan bloedplaatjeslysaat en losgemaakt met een diervrij trypsinesubstituut. Volgens de aanwijzingen voor goede productiepraktijken (GMP) voor de productie van celproducten die bedoeld zijn voor menselijke therapie, werden in geen enkel kweekmedium antibiotica gebruikt.

Door de hierboven beschreven isolatiemethode toe te passen, werden hASCs met succes verkregen uit abdominale vetweefselmonsters zonder het gebruik van collagenase. Bovendien werden de hASCs uitgebreid in volledig xenogene-vrije omstandigheden in aanwezigheid van hPL en zonder andere componenten van dierlijke oorsprong. De volgende resultaten ondersteunen het protocol en worden verkregen uit hASCs die parallel met hPL en met FBS als controlevoorwaarde zijn gekweekt.
Na het eerste clusteroptrede...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Human Adipose-Derived Stem Cells With an Innovative Xenogeneic-Free Method for Human Therapy at JoVE.com

Isolation and Culture of Human Adipose-Derived Stem Cells With an Innovative Xenogeneic-Free Method for Human Therapy

Xenogene (chemische of dierlijke afgeleide) producten die worden geïntroduceerd in de voorbereidings-/manipulatiestappen voor celtherapie zijn geassocieerd met een verhoogd risico op immuunreactiviteit en pathogene overdracht bij gastheerpatiënten. Hier wordt een volledig xenogeneïsche vrije methode beschreven voor de isolatie en in vitro expansie van menselijke vet-afgeleide stamcellen.

Isolatie en kweek van menselijke vetstamcellen met een innovatieve xenogene-vrije methode voor menselijke therapie

Considering the increasing impact of stem cell therapy, biosafety concerns have been raised regarding potential contamination or infection transmission ...

Onze exogeen-vrije methode voor isolatie en in vitro expansie van menselijke vet-afgeleide stamcellen is het antwoord op de bioveiligheidsproblemen rond celtherapie wanneer het wordt overwogen voor translationele toepassing. Onze isolatie- en uitbreidingsmethoden zijn eenvoudig te repliceren, snel en laag in technische vereisten, waardoor ze voor iedereen nuttig zijn. We onderzoeken de op menselijke vetstamcellen gebaseerde therapiestrategie voor perifeer zenuwherstel.Onze techniek kan echter op grote schaal worden toegepast wanneer nieuwe vetstamcellen nodig zijn in verschillende klinische onderzoeksopstellingen. We hebben het eenvoudig gehouden om de produceerbaarheid te behouden. De steriliteit moet zorgvuldig worden geobserveerd vanaf de operatiekamer tot de celkweek.Voor monstermanipulatie en fragmenten lopen microdissecties een risico op besmetting. Na het verkrijgen van het vetweefselmonster van abdominale plastische chirurgie, met behulp van een steriele schaar, snijdt u het in stukken van ongeveer een vierkante centimeter. Met een scalpel ontleed micro elk stuk in kleinere fragmenten en verspreid vijf fragmenten in een petrischaal van 10 centimeter.Gebruik voor fragmentbevestiging een scalpel om incisies op het plastic oppervlak te maken en sleep elk fragment. Voeg voorzichtig 10 milliliter compleet kweekmedium toe om alle fragmenten te bedekken zonder ze los te maken en incuber de petrischaal bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Controleer de menselijke vet-afgeleide stamcel, of HASC, expansie dagelijks onder een optische microscoop totdat cellen confluent worden.Vervang het medium elke 72 uur door een vers compleet medium om celresten te verwijderen en laat ze groeien tot de eerste passage. Zodra de HASC-cultuur 70 tot 80% confluentie bereikt, verwijdert u alle stukjes weefsel en gooit u deze weg met een steriel pincet. Gooi ook het uitgeputte medium weg en vermijd het loslaten van de HASC van de petrischaal.Was de cellen voorzichtig met 10 milliliter PBS. Voeg na het verwijderen van PBS een milliliter diervrij trypsine toe en incubeer gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Controleer op celloslating onder een optische microscoop en incubeer indien nodig nog twee minuten.Om de celloslating te ondersteunen, tikt u voorzichtig op het plastic oppervlak. Stop de trypsine-actie door twee milliliter compleet medium toe te voegen en verzamel alle cellen in een buis van 15 milliliter. Verwijder de resterende trypsine door centrifugeren.Nadat u het supernatant hebt weggegooid, suspenseert u de cellen in een volledig medium van vijf milliliter en brengt u de celsuspensie over naar een nieuwe T25-kolf. Tel voor cryoconservering een aliquot van losgemaakte losgemaakte cellen met behulp van de celteller onder een optische microscoop. Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten op 300 G.Na het weggooien van het supernatant, suspensieer de cellen in het vriesmengsel met een dichtheid van één maal 10 tot de zesde cellen per milliliter en breng één milliliter van de celsuspensie over in één cryoflacon. Plaats de cryoflacons op min 80 graden Celsius in een vriescontainer die de temperatuur met één graad Celsius per minuut verlaagt en verplaats de cryoflacons vervolgens naar vloeibare stikstof voor langdurige opslag. In het eerste clusterbeeld vertoonden de HASC's een klassieke spilachtige vorm en waren ze kleiner en langwerpiger in vergelijking met de controlecellen in aanwezigheid van FBS.Het celimmunofenotype bleek vergelijkbaar te zijn tussen de HASCs gekweekt met de twee supplementen. Meer dan 80 tot 90% van de HASCs was positief voor CD73 en CD105 en minder dan 5% uitgedrukt voor CD34 en CD45. Ten slotte onthulde de proliferatietest een significante toename van de celgroei wanneer menselijk bloedplaatjeslysaat aan het medium werd toegevoegd in vergelijking met de FBS-controle.De belangrijkste stap is de microdissectie van vetfragmenten en hun aanhechting met scalpelincisie op petrischaal. Een gebruiksklare menselijke vetstamcelpopulatie wordt verkregen met betrekking tot de GMP-bioveiligheidscriteria, waarbij de therapeutische celeigenschappen behouden blijven en de celproliferatie wordt verbeterd.

Research

JoVE Journal

Medicine

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stamceltransplantatie in een In vitro Gesimuleerde ischemie / reperfusie model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Isolatie van cardiomyocyten Kernen van Post-mortem weefsel

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

Subretinale Injectie van gentherapievectoren en stamcellen in de Mouse Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolatie, karakterisering en vergelijkende differentiatie van humane Dental Pulp stamcellen uit permanente tanden met behulp van twee verschillende methoden

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patiënt Derived Cell Cultuur en isolatie van CD133<sup&gt; +</sup&gt; Vermeende Cancer Stem Cells van Melanoom

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Isolatie, cultuur en beeldvorming van humane foetale Alvleesklierkanker celclusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

Isolatie van kanker stamcellen uit menselijke stalen van prostaatkanker

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Verrijking voor chemoresistent eierstokkanker stamcellen uit menselijke cellijnen

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolatie, cryopreservatie en cultuur van de mens Amnion epitheelcellen voor klinische toepassingen

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

Driedimensionale alginaat-bead cultuur van de mens hypofyseadenoom Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...