Name: isolation and culture of human adipose-derived stem cells with an innovative xenogeneic-free method for human therapy
Uploaded: 2023-02-03T14:50:00
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Les auteurs n’ont aucune reconnaissance.

Les hASCs ont été isolées du tissu adipeux abdominal d’une femme en bonne santé qui a subi une reconstruction mammaire à l’aide de lambeaux autologues abdominaux (lambeaux perforateurs épigastriques inférieurs profonds, [DIEP]) à l’hôpital universitaire de Lausanne, CHUV, Lausanne, Suisse. La partie jetée du lambeau et du tissu adipeux a été obtenue après que le patient a signé le consentement éclairé. Tous les protocoles ont été examinés et approuvés par le département de biobanque DAL (numér...

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	<li>Naderi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regenerative+role+of+adipose-derived+stem+cells+(ADSC)+in+plastic+and+reconstructive+surgery.">The regenerative role of adipose-derived stem cells (ADSC) in plastic and reconstructive surgery.</a> International Wound Journal. 14 (1), 112-124 (2017).</li><li>Guiotto, M., Riehle, M. O., Raffoul, W., Hart, A., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+human+platelet+lysate+(hPL)+the+ideal+candidate+to+substitute+the+foetal+bovine+serum+for+cell-therapy+translational+research.">Is human platelet lysate (hPL) the ideal candidate to substitute the foetal bovine serum for cell-therapy translational research.</a> Journal of Translational Medicine. 19 (1), 426 (2021).</li><li>Cond&#233;-Green, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shift+toward+mechanical+isolation+of+adipose-derived+stromal+vascular+fraction:+Review+of+upcoming+techniques.">Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: Review of upcoming techniques.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 4 (9), 1017 (2016).</li><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+Implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+adipose-derived+stem+cells+and+collagenase+in+fat+tissue+preparation.">Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation.</a> Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).</li><li>Spees, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalized+antigens+must+be+removed+to+prepare+hypoimmunogenic+mesenchymal+stem+cells+for+cell+and+gene+therapy.">Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy.</a> Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).</li><li>Fadel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+obtainment+and+isolation+of+two+mesenchymal+stem+cell+sources+in+sheep.">Protocols for obtainment and isolation of two mesenchymal stem cell sources in sheep.</a> Acta Cirurgica Brasileria. 26 (4), 267-273 (2011).</li><li>Markarian, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adipose-derived+stem+cells:+A+comparison+among+different+methods.">Isolation of adipose-derived stem cells: A comparison among different methods.</a> Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).</li><li>Sherman, L. S., Cond&#233;-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-free+method+for+isolation+and+expansion+of+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells.">An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).</li><li>Lalu, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+cell+therapy+with+mesenchymal+stromal+cells+(SafeCell):+A+systematic+review+and+meta-analysis+of+clinical+trials.">Safety of cell therapy with mesenchymal stromal cells (SafeCell): A systematic review and meta-analysis of clinical trials.</a> PLoS One. 7 (10), 47559 (2012).</li><li>Escobar, C. H., Chaparro, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xeno-free+extraction,+culture,+and+cryopreservation+of+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells.">Xeno-free extraction, culture, and cryopreservation of human adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 5 (3), 358-365 (2016).</li><li>Vaidya, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet-C+irradiation+for+inactivation+of+viruses+in+foetal+bovine+serum.">Ultraviolet-C irradiation for inactivation of viruses in foetal bovine serum.</a> Vaccine. 36 (29), 4215-4221 (2018).</li><li>Kyll&#246;nen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+serum+conditions+on+osteogenic+differentiation+of+human+adipose+stem+cells+in+vitro.">Effects of different serum conditions on osteogenic differentiation of human adipose stem cells in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (1), 17 (2013).</li><li>Schallmoser, K., Henschler, R., Gabriel, C., Koh, M. B. C., Burnouf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+quality+requirements+of+human+platelet+lysate:+A+position+statement+from+the+Working+Party+on+Cellular+Therapies+of+the+International+Society+of+Blood+Transfusion.">Production and quality requirements of human platelet lysate: A position statement from the Working Party on Cellular Therapies of the International Society of Blood Transfusion.</a> Trends in Biotechnology. 38 (1), 13-23 (2020).</li><li>Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+to+substitute+fetal+bovine+serum+in+hMSC+expansion+for+translational+applications:+A+systematic+review.">Human platelet lysate to substitute fetal bovine serum in hMSC expansion for translational applications: A systematic review.</a> Journal of Translational Medicine. 18 (1), 351 (2020).</li><li>Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+acts+synergistically+with+laminin+to+improve+the+neurotrophic+effect+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+primary+neurons.">Human platelet lysate acts synergistically with laminin to improve the neurotrophic effect of human adipose-derived stem cells on primary neurons.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 658176 (2021).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Cowper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+as+a+functional+substitute+for+fetal+bovine+serum+in+the+culture+of+human+adipose+derived+stromal/stem+cells.">Human platelet lysate as a functional substitute for fetal bovine serum in the culture of human adipose derived stromal/stem cells.</a> Cells. 8 (7), 724 (2019).</li><li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+the+treatment+and+prevention+of+graft-versus-host+disease:+Experiments+and+practice.">Mesenchymal stem cells for the treatment and prevention of graft-versus-host disease: Experiments and practice.</a> Annals of Hematology. 92 (10), 1295-1308 (2013).</li><li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+metal+micro+and+nano-particles+on+hASCs:+An+in+vitro+model.">Effects of metal micro and nano-particles on hASCs: An in vitro model.</a> Nanomaterials. 7 (8), 212 (2017).</li><li>Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stromal+vascular+fraction+cells:+Update+on+clinical+utility+and+efficacy.">Adipose-derived stromal vascular fraction cells: Update on clinical utility and efficacy.</a> Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).</li><li>Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+medium+composition+and+translational+adult+bone+marrow-derived+stem+cell+research.">Cell culture medium composition and translational adult bone marrow-derived stem cell research.</a> Stem Cells. 24 (5), 1409-1410 (2006).</li><li>Perez-Ilzarbe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+ex+vivo+expansion+culture+conditions+of+mesenchymal+stem+cells+for+human+cell+therapy.">Comparison of ex vivo expansion culture conditions of mesenchymal stem cells for human cell therapy.</a> Transfusion. 49 (9), 1901-1910 (2009).</li><li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+cell-detaching+methods+on+the+viability+and+cell+surface+antigen+expression+of+synovial+mesenchymal+stem+cells.">Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li><li>Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-enzymatic+method+for+isolating+human+adipose+tissue-derived+stromal+stem+cells.">A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells.</a> Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).</li><li>Becherucci, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+in+mesenchymal+stromal+cell+expansion+according+to+a+GMP+grade+protocol:+A+cell+factory+experience.">Human platelet lysate in mesenchymal stromal cell expansion according to a GMP grade protocol: A cell factory experience.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 124 (2018).</li><li>Blande, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+mesenchymal+stem+cell+expansion+in+animal+serum-free+medium+supplemented+with+autologous+human+platelet+lysate.">Adipose tissue mesenchymal stem cell expansion in animal serum-free medium supplemented with autologous human platelet lysate.</a> Transfusion. 49 (12), 2680-2685 (2009).</li><li>Castegnaro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+platelet+lysate+on+the+functional+and+molecular+characteristics+of+mesenchymal+stem+cells+isolated+from+adipose+tissue.">Effect of platelet lysate on the functional and molecular characteristics of mesenchymal stem cells isolated from adipose tissue.</a> Current Stem Cell Research &amp; Therapy. 6 (2), 105-114 (2011).</li><li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+review+and+meta-analysis+on+the+use+of+human+platelet+lysate+for+mesenchymal+stem+cell+cultures:+Comparison+with+fetal+bovine+serum+and+considerations+on+the+production+protocol.">Systematic review and meta-analysis on the use of human platelet lysate for mesenchymal stem cell cultures: Comparison with fetal bovine serum and considerations on the production protocol.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 13 (1), 142 (2022).</li><li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+as+a+potential+clinical-translatable+supplement+to+support+the+neurotrophic+properties+of+human+adipose-derived+stem+cells.">Human platelet lysate as a potential clinical-translatable supplement to support the neurotrophic properties of human adipose-derived stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (1), 432 (2020).</li><li>Kr&#228;henb&#252;hl, S. M., Grognuz, A., Michetti, M., Raffoul, W., Applegate, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+human+adipose-derived+stem+cell+expansion+and+stability+for+clinical+use.">Enhancement of human adipose-derived stem cell expansion and stability for clinical use.</a> International Journal of Stem Cell Research &amp; Therapy. 2 (1), 007 (2015).</li></ol>

Les cellules souches dérivées du tissu adipeux ont suscité l’intérêt de la recherche translationnelle au cours de la dernière décennie en raison de leur abondance, de leurs méthodes d’isolement rapides et abordables, de leur taux élevé de prolifération in vitro/in vivo et de leurs propriétés de souches/différenciation18,19,20. En conséquence, les hASCs sont considérés comme un excellent can...

Au cours des dernières décennies, la demande croissante de traitements thérapeutiques innovants a donné lieu à des efforts et à des investissements de ressources importants dans le domaine de la médecine translationnelle1. Les produits à base de cellules sont associés à des risques déterminés par la source cellulaire, le processus de fabrication (isolement, expansion ou modification génétique) et les suppléments non cellulaires (enzymes, facteurs de croissance, suppléments de culture et antibiotiques), et ces facteurs de risque dépendent de l’indication thérapeutique spécifique. La qualité, la sécurité et l’efficacité du produit final pourraient être profondément influencées parles éléments 2 indiqués ci-dessus. La thérapie par cellules souches exige le respect des principes de biosécurité; Les risques potentiels de transmission pathogène avec des produits d’origine animale en culture cellulaire pourraient être problématiques, et l’analyse approfondie de tout produit introduit dans la fabrication est essentielle3.
La méthode traditionnelle d’isolement des cellules souches adipeuses humaines (hASC) implique une digestion enzymatique effectuée avec de la collagénase suivie d’étapes de lavage par centrifugation4. Alors que l’isolement enzymatique est généralement considéré comme plus efficace que d’autres techniques mécaniques en termes de rendements cellulaires et de viabilité, les composants d’origine animale utilisés, tels que la collagénase, sont considérés comme plus que peu manipulés par la Food and Drug Administration des États-Unis. Cela signifie qu’il existe un risque significativement accru de réactions immunitaires ou de transmission de maladies, limitant ainsi la traduction du traitement par hASC dans les milieux cliniques 5,6.
La digestion à base de trypsine est un autre protocole enzymatique pour isoler les ASC. Différentes techniques ont été décrites avec de légères modifications en termes de concentration de trypsine, de vitesse de centrifugation et de temps d’incubation. Malheureusement, cette méthode n’est pas bien décrite, et un manque de comparaison existe dans la littérature, notamment avec les protocoles d’isolation mécanique7. Cependant, en termes de traduisibilité de l’approche, la trypsine présente les mêmes inconvénients que la collagénase.
Les méthodes alternatives d’isolement pour obtenir des ASC, basées sur les forces mécaniques et sans ajout d’enzyme, impliquent une centrifugation à grande vitesse (800 x g ou 1 280 x g, 15 min) des fragments de tissu adipeux. Ensuite, la pastille est incubée avec un tampon de lyse érythrocytaire (5 min), suivie d’une autre étape de centrifugation à 600 x g avant remise en suspension dans le milieu de culture. Malgré un plus grand nombre de cellules isolées dans les premiers jours par rapport aux méthodes d’explantation, une étude précédente a montré une prolifération plus faible ou absente au-delà de la deuxième semaine de culture8.
En outre, une manipulation supplémentaire avec un milieu xénogénique ajouté, tel que le sérum bovin fœtal (FBS), qui est utilisé comme supplément de facteur de croissance pour la culture cellulaire, est associée à un risque accru de réactivité immunitaire et d’exposition aux infections virales, bactériennes ou à prions du patient hôte 9,10. Des réactions immunitaires et le développement d’éruptions urticariformes ont déjà été décrits chez des personnes recevant plusieurs doses de cellules souches mésenchymateuses produites avec FBS11. En outre, FBS est soumis à une variabilité d’un lot à l’autre, ce qui peut avoir un impact sur la qualité du produit final12.
Conformément aux lignes directrices des bonnes pratiques de fabrication (BPF), la dissociation des tissus enzymatiques doit être évitée et le FBS doit être remplacé par des suppléments sans xénophobie. Ces étapes, ainsi que des protocoles plus fiables et reproductibles, sont essentielles pour soutenir l’application de la thérapie cellulaire 3,13.
Dans ce contexte, le lysat plaquettaire humain (hPL) a été suggéré comme substitut du FBS puisqu’il s’agit d’un supplément acellulaire, contenant des protéines et enrichi en facteur de croissance, et qu’il a déjà été introduit parmi les produits cellulaires de qualité clinique en tant qu’additif de milieu de croissance pour la culture cellulaire in vitro et l’expansion14,15. Comme hPL est un produit d’origine humaine, il est fréquemment utilisé comme substitut du FBS lors de la culture in vitro de hASC destinés à des applications cliniques, réduisant ainsi les problèmes concernant les réactions immunologiques et les infections liées à la translatabilité FBS15,16.
Malgré les coûts de production plus élevés, il a déjà été démontré que, par rapport au FBS, hPL soutient la viabilité cellulaire pour de nombreux types de cellules, augmente la prolifération, retarde la sénescence, assure la stabilité génomique et conserve l’immunophénotype cellulaire même dans les passages cellulaires tardifs; Tous ces éléments soutiennent le passage à ce supplément de culture11.
L’objectif de ce travail était de développer un protocole standardisé pour isoler et cultiver les hASCs avec une méthode complète sans animaux, sans modifier la physiologie cellulaire et les propriétés de souche par rapport aux hASC classiques cultivés par FBS (Figure 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>euroclone</td>
			<td>et5015b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD105</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD560839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD34</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD555821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD555482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD73</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD561254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer)</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument)</td>
			<td>BD accuri</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burker chamber</td>
			<td>Blaubrand</td>
			<td>717810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell freezing container</td>
			<td>corning</td>
			<td>CLS432002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell Freezing container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS432002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>clearline</td>
			<td>390701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposabile blade scalpel</td>
			<td>paragon</td>
			<td>bs 2982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Platelet Lysate FD (GMP grade)</td>
			<td>Stemulate</td>
			<td>PL-NH-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite F50 spectrophotometer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 10 cm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scalpels</td>
			<td>Reda</td>
			<td>07104-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissors</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>4071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tweezers</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>1152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging bucket centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3-16K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flasks</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>6910170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLe (animal free trypsin substitute)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12604-013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of human adipose-derived stem cells with an innovative xenogeneic-free method for human therapy

Compte tenu de l’impact croissant de la thérapie par cellules souches, des préoccupations en matière de biosécurité ont été soulevées concernant la contamination potentielle ou la transmission d’infections due à l’introduction de produits d’origine animale lors de manipulations in vitro . Les composants xénogéniques, tels que la collagénase ou le sérum bovin fœtal, couramment utilisés pendant les étapes d’isolement et d’expansion cellulaires pourraient être associés aux risques potentiels de réactivité immunitaire ou d’infection virale, bactérienne et à prion chez les patients receveurs. Conformément aux directives de bonnes pratiques de fabrication, la dissociation chimique des tissus doit être évitée, tandis que le sérum bovin fœtal (FBS) peut être remplacé par des suppléments sans xénophobie. De plus, pour assurer la sécurité des produits cellulaires, la définition de méthodes plus fiables et reproductibles est importante. Nous avons développé une méthode innovante, totalement exempte de xénophobie, pour l’isolement et l’expansion in vitro de cellules souches humaines dérivées du tissu adipeux sans altérer leurs propriétés par rapport aux protocoles standard de culture FBS de collagénase. Ici, des cellules souches dérivées du tissu adipeux humain (hASC) ont été isolées du tissu adipeux abdominal. L’échantillon a été haché mécaniquement avec des ciseaux / un scalpel, micro-disséqué et dispersé mécaniquement dans une boîte de Petri de 10 cm, et préparé avec des incisions au scalpel pour faciliter la fixation des fragments de tissu et la migration des hASC. Après les étapes de lavage, les hASC ont été sélectionnés en raison de leur adhérence plastique sans digestion enzymatique. Les hASCs isolés ont été cultivés avec un milieu supplémenté en lysat plaquettaire humain sans héparine à 5% et détachés avec un substitut de trypsine sans animaux. Conformément aux directives des bonnes pratiques de fabrication (BPF) sur la production de produits cellulaires destinés à la thérapie humaine, aucun antibiotique n’a été utilisé dans les milieux de culture.

En appliquant la méthode d’isolement détaillée ci-dessus, les hASC ont été obtenues avec succès à partir d’échantillons de tissu adipeux abdominal sans l’utilisation de collagénase. De plus, les CSAh ont été étendues dans des conditions totalement exemptes de xénogènes en présence de hPL et sans aucun autre composant d’origine animale. Les résultats suivants soutiennent le protocole et sont obtenus à partir de hASC cultivés en parallèle avec hPL et avec FBS comme condition de contrôle.
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Isolation and Culture of Human Adipose-Derived Stem Cells With an Innovative Xenogeneic-Free Method for Human Therapy

Les produits xénogéniques (chimiques ou d’origine animale) introduits dans les étapes de préparation/manipulation de la thérapie cellulaire sont associés à un risque accru de réactivité immunitaire et de transmission pathogène chez les patients hôtes. Ici, une méthode complète sans xénogénétique pour l’isolement et l’expansion in vitro de cellules souches humaines dérivées du tissu adipeux est décrite.

Isolement et culture de cellules souches humaines dérivées du tissu adipeux à l’aide d’une méthode innovante sans xénogène pour la thérapie humaine

Considering the increasing impact of stem cell therapy, biosafety concerns have been raised regarding potential contamination or infection transmission ...

Notre méthode sans exogène pour l’isolement et l’expansion in vitro de cellules souches humaines dérivées du tissu adipeux est la réponse aux préoccupations de biosécurité liées à la thérapie cellulaire lorsqu’elle est envisagée pour une application translationnelle. Nos méthodes d’isolation et d’extension sont simples à reproduire, rapides et peu exigeantes en termes techniques, ce qui les rend utiles à tous. Nous étudions la stratégie thérapeutique basée sur les cellules souches adipeuses humaines pour la réparation des nerfs périphériques.Cependant, notre technique peut être largement appliquée lorsque de nouvelles cellules souches adipeuses sont nécessaires dans différentes configurations de recherche clinique. Nous avons gardé les choses simples pour conserver une production plus facile. La stérilité doit être soigneusement observée de la salle d’opération jusqu’à la culture cellulaire.Pour la manipulation d’échantillons et les fragments, la microdissection présente un risque de contamination. Après avoir obtenu l’échantillon de tissu adipeux de la chirurgie plastique abdominale, à l’aide de ciseaux stériles, coupez-le en morceaux d’environ un centimètre carré. Avec un scalpel, micro disséquer chaque morceau en fragments plus petits et disperser cinq fragments dans une boîte de Petri de 10 centimètres.Pour la fixation des fragments, utilisez un scalpel pour créer des incisions sur la surface en plastique et faites glisser chaque fragment. Ajoutez délicatement 10 millilitres de milieu de culture complet pour couvrir tous les fragments sans les détacher et incuber la boîte de Petri à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Surveiller quotidiennement l’expansion quotidienne des cellules souches dérivées du tissu adipeux humain, ou HASC, au microscope optique jusqu’à ce que les cellules deviennent confluentes.Remplacez le milieu par un milieu complet frais toutes les 72 heures pour éliminer les débris cellulaires et laissez-les pousser jusqu’au premier passage. Une fois que la culture HASC atteint 70 à 80% de confluence, retirez et jetez tous les morceaux de tissu à l’aide d’une pince à épiler stérile. Jetez également le milieu épuisé en évitant le détachement du HASC de la boîte de Pétri.Lavez soigneusement les cellules avec 10 millilitres de PBS. Après avoir retiré le PBS, ajoutez un millilitre de trypsine sans animaux et incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Vérifiez s’il y a décollement de cellules au microscope optique et incuber pendant deux minutes de plus, si nécessaire.Pour soutenir le détachement de cellule, tapotez doucement la surface en plastique. Arrêtez l’action de la trypsine en ajoutant deux millilitres de milieu complet et recueillez toutes les cellules dans un tube de 15 millilitres. Éliminer la trypsine restante par centrifugation.Après avoir jeté le surnageant, suspendre les cellules dans un milieu complet de cinq millilitres et transférer la suspension cellulaire dans une nouvelle fiole T25. Pour la cryoconservation, compter une partie aliquote des cellules détachées à l’aide du compteur de cellules au microscope optique. Centrifuger les cellules à 300 G pendant cinq minutes.Après avoir éliminé le surnageant, suspendre les cellules dans le mélange de congélation à une densité d’une fois 10 à la sixième cellule par millilitre et transférer un millilitre de la suspension cellulaire dans un flacon cryogénique. Placez les flacons cryogéniques à moins 80 degrés Celsius dans un récipient de congélation qui diminue la température d’un degré Celsius par minute, puis déplacez les flacons cryogéniques dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme. Dans l’apparence initiale de la grappe, les HASC présentaient une forme classique en forme de fuseau et étaient plus petites, ainsi que plus allongées par rapport aux cellules témoins en présence de FBS.L’immunophénotype cellulaire semblait être similaire entre les HASC cultivés avec les deux suppléments. Plus de 80 à 90 % des HASC étaient positifs pour CD73 et CD105 et moins de 5 % exprimés pour CD34 et CD45. Enfin, le test de prolifération a révélé une augmentation significative de la croissance cellulaire lorsque du lysat plaquettaire humain a été ajouté au milieu par rapport au témoin FBS.L’étape la plus importante est la micro-dissection des fragments adipeux et leur fixation avec incision au scalpel sur une boîte de Pétri. Une population de cellules souches humaines dérivées du tissu adipeux prête à l’emploi est obtenue en respectant les critères de biosécurité BPF, en conservant les propriétés cellulaires thérapeutiques et en améliorant la prolifération cellulaire.

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Medicine

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