Name: isolation and culture of human adipose-derived stem cells with an innovative xenogeneic-free method for human therapy
Uploaded: 2023-02-03T14:50:00
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Die Autoren haben keine Danksagungen.

hASCs wurden aus dem abdominalen Fettgewebe einer gesunden Frau isoliert, die sich am Universitätsspital Lausanne, CHUV, Lausanne, Schweiz, einer Brustrekonstruktion mit abdominalen Autolappen (tiefe untere epigastrische Perforatorlappen, [DIEP]) unterzogen hatte. Der verworfene Teil des Lappens und das Fettgewebe wurden erhalten, nachdem der Patient eine Einverständniserklärung unterschrieben hatte. Alle Protokolle wurden von der Biobank-Abteilung DAL (Nummer 314 GGC) und den Ethikkommissionen des Krankenhauses in Ü...

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	<li>Naderi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regenerative+role+of+adipose-derived+stem+cells+(ADSC)+in+plastic+and+reconstructive+surgery.">The regenerative role of adipose-derived stem cells (ADSC) in plastic and reconstructive surgery.</a> International Wound Journal. 14 (1), 112-124 (2017).</li><li>Guiotto, M., Riehle, M. O., Raffoul, W., Hart, A., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+human+platelet+lysate+(hPL)+the+ideal+candidate+to+substitute+the+foetal+bovine+serum+for+cell-therapy+translational+research.">Is human platelet lysate (hPL) the ideal candidate to substitute the foetal bovine serum for cell-therapy translational research.</a> Journal of Translational Medicine. 19 (1), 426 (2021).</li><li>Cond&#233;-Green, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shift+toward+mechanical+isolation+of+adipose-derived+stromal+vascular+fraction:+Review+of+upcoming+techniques.">Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: Review of upcoming techniques.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 4 (9), 1017 (2016).</li><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+Implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+adipose-derived+stem+cells+and+collagenase+in+fat+tissue+preparation.">Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation.</a> Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).</li><li>Spees, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalized+antigens+must+be+removed+to+prepare+hypoimmunogenic+mesenchymal+stem+cells+for+cell+and+gene+therapy.">Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy.</a> Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).</li><li>Fadel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+obtainment+and+isolation+of+two+mesenchymal+stem+cell+sources+in+sheep.">Protocols for obtainment and isolation of two mesenchymal stem cell sources in sheep.</a> Acta Cirurgica Brasileria. 26 (4), 267-273 (2011).</li><li>Markarian, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adipose-derived+stem+cells:+A+comparison+among+different+methods.">Isolation of adipose-derived stem cells: A comparison among different methods.</a> Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).</li><li>Sherman, L. S., Cond&#233;-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-free+method+for+isolation+and+expansion+of+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells.">An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).</li><li>Lalu, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+cell+therapy+with+mesenchymal+stromal+cells+(SafeCell):+A+systematic+review+and+meta-analysis+of+clinical+trials.">Safety of cell therapy with mesenchymal stromal cells (SafeCell): A systematic review and meta-analysis of clinical trials.</a> PLoS One. 7 (10), 47559 (2012).</li><li>Escobar, C. H., Chaparro, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xeno-free+extraction,+culture,+and+cryopreservation+of+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells.">Xeno-free extraction, culture, and cryopreservation of human adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 5 (3), 358-365 (2016).</li><li>Vaidya, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet-C+irradiation+for+inactivation+of+viruses+in+foetal+bovine+serum.">Ultraviolet-C irradiation for inactivation of viruses in foetal bovine serum.</a> Vaccine. 36 (29), 4215-4221 (2018).</li><li>Kyll&#246;nen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+serum+conditions+on+osteogenic+differentiation+of+human+adipose+stem+cells+in+vitro.">Effects of different serum conditions on osteogenic differentiation of human adipose stem cells in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (1), 17 (2013).</li><li>Schallmoser, K., Henschler, R., Gabriel, C., Koh, M. B. C., Burnouf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+quality+requirements+of+human+platelet+lysate:+A+position+statement+from+the+Working+Party+on+Cellular+Therapies+of+the+International+Society+of+Blood+Transfusion.">Production and quality requirements of human platelet lysate: A position statement from the Working Party on Cellular Therapies of the International Society of Blood Transfusion.</a> Trends in Biotechnology. 38 (1), 13-23 (2020).</li><li>Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+to+substitute+fetal+bovine+serum+in+hMSC+expansion+for+translational+applications:+A+systematic+review.">Human platelet lysate to substitute fetal bovine serum in hMSC expansion for translational applications: A systematic review.</a> Journal of Translational Medicine. 18 (1), 351 (2020).</li><li>Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+acts+synergistically+with+laminin+to+improve+the+neurotrophic+effect+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+primary+neurons.">Human platelet lysate acts synergistically with laminin to improve the neurotrophic effect of human adipose-derived stem cells on primary neurons.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 658176 (2021).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Cowper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+as+a+functional+substitute+for+fetal+bovine+serum+in+the+culture+of+human+adipose+derived+stromal/stem+cells.">Human platelet lysate as a functional substitute for fetal bovine serum in the culture of human adipose derived stromal/stem cells.</a> Cells. 8 (7), 724 (2019).</li><li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+the+treatment+and+prevention+of+graft-versus-host+disease:+Experiments+and+practice.">Mesenchymal stem cells for the treatment and prevention of graft-versus-host disease: Experiments and practice.</a> Annals of Hematology. 92 (10), 1295-1308 (2013).</li><li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+metal+micro+and+nano-particles+on+hASCs:+An+in+vitro+model.">Effects of metal micro and nano-particles on hASCs: An in vitro model.</a> Nanomaterials. 7 (8), 212 (2017).</li><li>Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stromal+vascular+fraction+cells:+Update+on+clinical+utility+and+efficacy.">Adipose-derived stromal vascular fraction cells: Update on clinical utility and efficacy.</a> Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).</li><li>Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+medium+composition+and+translational+adult+bone+marrow-derived+stem+cell+research.">Cell culture medium composition and translational adult bone marrow-derived stem cell research.</a> Stem Cells. 24 (5), 1409-1410 (2006).</li><li>Perez-Ilzarbe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+ex+vivo+expansion+culture+conditions+of+mesenchymal+stem+cells+for+human+cell+therapy.">Comparison of ex vivo expansion culture conditions of mesenchymal stem cells for human cell therapy.</a> Transfusion. 49 (9), 1901-1910 (2009).</li><li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+cell-detaching+methods+on+the+viability+and+cell+surface+antigen+expression+of+synovial+mesenchymal+stem+cells.">Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li><li>Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-enzymatic+method+for+isolating+human+adipose+tissue-derived+stromal+stem+cells.">A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells.</a> Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).</li><li>Becherucci, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+in+mesenchymal+stromal+cell+expansion+according+to+a+GMP+grade+protocol:+A+cell+factory+experience.">Human platelet lysate in mesenchymal stromal cell expansion according to a GMP grade protocol: A cell factory experience.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 124 (2018).</li><li>Blande, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+mesenchymal+stem+cell+expansion+in+animal+serum-free+medium+supplemented+with+autologous+human+platelet+lysate.">Adipose tissue mesenchymal stem cell expansion in animal serum-free medium supplemented with autologous human platelet lysate.</a> Transfusion. 49 (12), 2680-2685 (2009).</li><li>Castegnaro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+platelet+lysate+on+the+functional+and+molecular+characteristics+of+mesenchymal+stem+cells+isolated+from+adipose+tissue.">Effect of platelet lysate on the functional and molecular characteristics of mesenchymal stem cells isolated from adipose tissue.</a> Current Stem Cell Research &amp; Therapy. 6 (2), 105-114 (2011).</li><li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+review+and+meta-analysis+on+the+use+of+human+platelet+lysate+for+mesenchymal+stem+cell+cultures:+Comparison+with+fetal+bovine+serum+and+considerations+on+the+production+protocol.">Systematic review and meta-analysis on the use of human platelet lysate for mesenchymal stem cell cultures: Comparison with fetal bovine serum and considerations on the production protocol.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 13 (1), 142 (2022).</li><li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+as+a+potential+clinical-translatable+supplement+to+support+the+neurotrophic+properties+of+human+adipose-derived+stem+cells.">Human platelet lysate as a potential clinical-translatable supplement to support the neurotrophic properties of human adipose-derived stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (1), 432 (2020).</li><li>Kr&#228;henb&#252;hl, S. M., Grognuz, A., Michetti, M., Raffoul, W., Applegate, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+human+adipose-derived+stem+cell+expansion+and+stability+for+clinical+use.">Enhancement of human adipose-derived stem cell expansion and stability for clinical use.</a> International Journal of Stem Cell Research &amp; Therapy. 2 (1), 007 (2015).</li></ol>

Aus Fett gewonnene Stammzellen haben in den letzten zehn Jahren aufgrund ihrer Häufigkeit, ihrer schnellen und erschwinglichen Isolationsmethoden, ihrer hohen In-vitro/In-vivo-Proliferationsrate und ihrer Stamm-/Differenzierungseigenschaften das Interesse der translationalen Forschung geweckt18,19,20. Daher gelten hASCs als hervorragender Kandidat für zellbasierte Strategien in der regenerativen Medizin<sup c...

In den letzten Jahrzehnten hat die steigende Nachfrage nach innovativen therapeutischen Behandlungen zu erheblichen Anstrengungen und Ressourceninvestitionen im Bereich der translationalen Medizingeführt 1. Zellbasierte Produkte sind mit Risiken verbunden, die durch die Zellquelle, den Herstellungsprozess (Isolierung, Expansion oder genetische Veränderung) und die nicht-zellulären Nahrungsergänzungsmittel (Enzyme, Wachstumsfaktoren, Kulturzusätze und Antibiotika) bestimmt werden, und diese Risikofaktoren hängen von der spezifischen therapeutischen Indikation ab. Die Qualität, Sicherheit und Wirksamkeit des Endprodukts könnte stark von den oben genannten Elementenbeeinflusst werden 2. Die Stammzelltherapie erfordert die Einhaltung der Grundsätze der biologischen Sicherheit. Die potenziellen Risiken einer pathogenen Übertragung mit tierischen Produkten in Zellkulturen könnten problematisch sein, und die gründliche Prüfung jedes Produkts, das bei der Herstellung eingeführt wird, ist unerlässlich3.
Die traditionelle Methode zur Isolierung von aus menschlichem Fett gewonnenen Stammzellen (hASCs) beinhaltet einen enzymatischen Aufschluss mit Kollagenase, gefolgt von Waschschritten durch Zentrifugation4. Während die enzymatische Isolierung im Allgemeinen in Bezug auf Zellausbeute und Lebensfähigkeit als effizienter angesehen wird als andere mechanische Techniken, werden die verwendeten tierischen Komponenten wie Kollagenase von der US-amerikanischen Food and Drug Administration als mehr als minimal manipuliert angesehen. Dies bedeutet, dass ein signifikant erhöhtes Risiko für Immunreaktionen oder Krankheitsübertragungen besteht, wodurch die Übertragung der hASC-Therapie auf das klinische Umfeld eingeschränktwird 5,6.
Die Trypsin-basierte Verdauung ist ein weiteres enzymatisches Protokoll zur Isolierung von ASCs. Es wurden verschiedene Techniken mit geringfügigen Modifikationen in Bezug auf die Trypsinkonzentration, die Zentrifugationsgeschwindigkeit und die Inkubationszeit beschrieben. Leider ist diese Methode nicht gut beschrieben, und in der Literatur besteht ein Mangel an Vergleichen, insbesondere mit den mechanischen Isolationsprotokollen7. In Bezug auf die Übersetzbarkeit des Ansatzes hat Trypsin jedoch die gleichen Nachteile wie Kollagenase.
Alternative Isolationsmethoden zur Gewinnung von ASCs, die auf mechanischen Kräften und ohne Enzymzugabe basieren, beinhalten eine Hochgeschwindigkeitszentrifugation (800 x g oder 1.280 x g, 15 min) der Fettgewebefragmente. Dann wird das Pellet mit einem Lysepuffer für rote Blutkörperchen (5 min) inkubiert, gefolgt von einem weiteren Zentrifugationsschritt bei 600 x g vor der Resuspension in Kulturmedium. Obwohl in den ersten Tagen im Vergleich zu den Explantatmethoden eine größere Anzahl von Zellen isoliert wurde, zeigte eine frühere Studie eine geringere oder fehlende Proliferation über die zweite Kulturwoche hinaus8.
Darüber hinaus ist eine weitere Manipulation mit xenogenem zugesetztem Medium, wie z. B. fetalem Rinderserum (FBS), das als Wachstumsfaktorergänzung für die Zellkultur verwendet wird, mit einem erhöhten Risiko für Immunreaktivität und Exposition gegenüber viralen, bakteriellen oder Prioneninfektionen des Wirtspatienten verbunden 9,10. Immunreaktionen und die Entwicklung urtikariformer Hautausschläge wurden bereits bei Personen beschrieben, die mehrere Dosen mesenchymaler Stammzellen erhielten, die mit FBS11 hergestellt wurden. Darüber hinaus unterliegt FBS einer Variabilität von Charge zu Charge, die sich auf die Qualität des Endprodukts auswirken kann12.
In Übereinstimmung mit den Richtlinien der Guten Herstellungspraxis (GMP) sollte eine enzymatische Gewebedissoziation vermieden und FBS durch xenogenfreie Nahrungsergänzungsmittel ersetzt werden. Diese Schritte sind zusammen mit zuverlässigeren und reproduzierbareren Protokollen unerlässlich, um die Anwendung der Zelltherapie zu unterstützen 3,13.
In diesem Zusammenhang wurde humanes Thrombozytenlysat (hPL) als Ersatz für FBS vorgeschlagen, da es sich um ein zellfreies, proteinhaltiges, mit Wachstumsfaktoren angereichertes Nahrungsergänzungsmittel handelt, und es wurde früher unter den zellbasierten Produkten in klinischer Qualität als Zusatz von Wachstumsmedium für die In-vitro-Zellkultur und -expansion eingeführt14,15. Da es sich bei hPL um ein vom Menschen stammendes Produkt handelt, wird es häufig als Ersatz für FBS während der In-vitro-Kultur von hASCs verwendet, die für klinische Anwendungen bestimmt sind, wodurch Probleme in Bezug auf immunologische Reaktionen und Infektionen im Zusammenhang mit der FBS-Übersetzbarkeit reduziertwerden 15,16.
Trotz der höheren Produktionskosten konnte bereits gezeigt werden, dass hPL im Vergleich zu FBS die Zelllebensfähigkeit für viele Zelltypen unterstützt, die Proliferation erhöht, die Seneszenz verzögert, die genomische Stabilität gewährleistet und den zellulären Immunphänotyp auch in späten Zellpassagen konserviert. All diese Elemente unterstützen den Wechsel zu dieser Kulturergänzung11.
Ziel dieser Arbeit war es, ein standardisiertes Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von hASCs mit einer vollständig tierversuchsfreien Methode zu entwickeln, ohne die Zellphysiologie und die Stammeigenschaften im Vergleich zu klassischen FBS-kultivierten hASCs zu verändern (Abbildung 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>euroclone</td>
			<td>et5015b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD105</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD560839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD34</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD555821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD555482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD73</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD561254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer)</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument)</td>
			<td>BD accuri</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burker chamber</td>
			<td>Blaubrand</td>
			<td>717810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell freezing container</td>
			<td>corning</td>
			<td>CLS432002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell Freezing container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS432002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>clearline</td>
			<td>390701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposabile blade scalpel</td>
			<td>paragon</td>
			<td>bs 2982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Platelet Lysate FD (GMP grade)</td>
			<td>Stemulate</td>
			<td>PL-NH-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite F50 spectrophotometer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 10 cm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scalpels</td>
			<td>Reda</td>
			<td>07104-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissors</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>4071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tweezers</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>1152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging bucket centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3-16K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flasks</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>6910170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLe (animal free trypsin substitute)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12604-013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of human adipose-derived stem cells with an innovative xenogeneic-free method for human therapy

In Anbetracht der zunehmenden Auswirkungen der Stammzelltherapie wurden Bedenken hinsichtlich der biologischen Sicherheit hinsichtlich einer möglichen Kontamination oder Infektionsübertragung aufgrund der Einführung tierischer Produkte während der In-vitro-Manipulation geäußert. Die xenogenen Komponenten, wie Kollagenase oder fötales Rinderserum, die üblicherweise während der Zellisolierungs- und Expansionsschritte verwendet werden, könnten mit den potenziellen Risiken einer Immunreaktivität oder einer Virus-, Bakterien- und Prioneninfektion bei den empfangenden Patienten in Verbindung gebracht werden. Gemäß den Richtlinien der guten Herstellungspraxis sollte eine chemische Gewebedissoziation vermieden werden, während fetales Rinderserum (FBS) durch xenogenfreie Nahrungsergänzungsmittel ersetzt werden kann. Um die Sicherheit von Zellprodukten zu gewährleisten, ist es außerdem wichtig, zuverlässigere und reproduzierbarere Methoden zu definieren. Wir haben eine innovative, vollständig xenogenfreie Methode zur Isolierung und In-vitro-Expansion von humanen Fettstammzellen entwickelt, ohne deren Eigenschaften im Vergleich zu Kollagenase-FBS-kultivierten Standardprotokollen zu verändern. Hier wurden aus menschlichem Fettgewebe gewonnene Stammzellen (hASCs) aus abdominalem Fettgewebe isoliert. Die Probe wurde mechanisch mit einer Schere/einem Skalpell zerkleinert, mikropräpariert und mechanisch in einer 10 cm Petrischale dispergiert und mit Skalpellschnitten vorbereitet, um das Anheften der Gewebefragmente und die Migration von hASCs zu erleichtern. Im Anschluss an die Waschschritte wurden hASCs aufgrund ihrer plastischen Adhärenz ohne enzymatischen Aufschluss ausgewählt. Die isolierten hASCs wurden mit Medium kultiviert, das mit 5% heparinfreiem humanem Thrombozytenlysat angereichert und mit einem tierfreien Trypsinersatz abgetrennt wurde. Gemäß den Richtlinien der Guten Herstellungspraxis (GMP) zur Herstellung von Zellprodukten, die für die Humantherapie bestimmt sind, wurden keine Antibiotika in Nährmedien verwendet.

Unter Anwendung der oben beschriebenen Isolationsmethode wurden hASCs erfolgreich aus abdominalen Fettgewebeproben ohne den Einsatz von Kollagenase gewonnen. Darüber hinaus wurden die hASCs unter vollständig xenogenfreien Bedingungen in Gegenwart von hPL und ohne weitere Bestandteile tierischen Ursprungs expandiert. Die folgenden Ergebnisse unterstützen das Protokoll und werden aus hASCs gewonnen, die parallel zu hPL und mit FBS als Kontrollbedingung kultiviert wurden.
Nach dem ersten Clust...

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Isolation and Culture of Human Adipose-Derived Stem Cells With an Innovative Xenogeneic-Free Method for Human Therapy

Xenogene (chemische oder tierische) Produkte, die in den Vorbereitungs-/Manipulationsschritten der Zelltherapie eingeführt werden, sind mit einem erhöhten Risiko für Immunreaktivität und pathogene Übertragung bei Wirtspatienten verbunden. Hier wird eine vollständige xenogenfreie Methode zur Isolierung und in vitro Expansion von humanen adipösen Stammzellen beschrieben.

Isolierung und Kultivierung von humanen Fettstammzellen mit einer innovativen xenogenfreien Methode für die Humantherapie

Considering the increasing impact of stem cell therapy, biosafety concerns have been raised regarding potential contamination or infection transmission ...

Unsere exogenfreie Methode zur Isolierung und In-vitro-Expansion von aus menschlichem Fett gewonnenen Stammzellen ist die Antwort auf die Bedenken hinsichtlich der biologischen Sicherheit im Zusammenhang mit der Zelltherapie, wenn sie für eine translationale Anwendung in Betracht gezogen wird. Unsere Isolations- und Erweiterungsmethoden sind einfach zu replizieren, schnell und haben geringe technische Anforderungen, so dass sie für jeden nützlich sind. Wir untersuchen eine auf humanen Fettstammzellen basierende Therapiestrategie für die Reparatur peripherer Nerven.Unsere Technik kann jedoch weit verbreitet sein, wenn neue Fettstammzellen in verschiedenen klinischen Forschungseinrichtungen benötigt werden. Wir haben es einfach gehalten, um eine einfachere Produzierbarkeit zu erhalten. Die Sterilität sollte vom Operationssaal bis zur Zellkultur sorgfältig beobachtet werden.Bei der Probenmanipulation und bei der Fragmentierung besteht bei der Mikrodissektion die Gefahr einer Kontamination. Nachdem Sie die Fettgewebsprobe aus der plastischen Bauchchirurgie erhalten haben, schneiden Sie sie mit einer sterilen Schere in Stücke von etwa einem Quadratzentimeter. Zerlegen Sie jedes Stück mit einem Skalpell in kleinere Fragmente und verteilen Sie fünf Fragmente in einer 10 cm langen Petrischale.Verwenden Sie zum Anheften von Fragmenten ein Skalpell, um Einschnitte auf der Kunststoffoberfläche zu erzeugen, und ziehen Sie jedes Fragment. Fügen Sie vorsichtig 10 Milliliter vollständiges Nährmedium hinzu, um alle Fragmente zu bedecken, ohne sie abzulösen, und inkubieren Sie die Petrischale bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Überwachen Sie die Expansion der aus menschlichem Fett gewonnenen Stammzellen (HASC) täglich unter einem optischen Mikroskop, bis die Zellen konfluent werden.Ersetzen Sie das Medium alle 72 Stunden durch ein frisches, vollständiges Medium, um Zellreste zu entfernen, und lassen Sie sie bis zum ersten Durchgang wachsen. Sobald die HASC-Kultur 70 bis 80 % Konfluenz erreicht hat, entfernen Sie alle Gewebestücke und entsorgen Sie sie mit einer sterilen Pinzette. Entsorgen Sie auch das erschöpfte Medium, um zu vermeiden, dass sich der HASC von der Petrischale löst.Waschen Sie die Zellen sorgfältig mit 10 Millilitern PBS. Fügen Sie nach dem Entfernen von PBS einen Milliliter tierfreies Trypsin hinzu und inkubieren Sie es fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Überprüfen Sie die Zellablösung unter einem optischen Mikroskop und inkubieren Sie bei Bedarf zwei weitere Minuten.Um die Zellablösung zu unterstützen, klopfen Sie vorsichtig auf die Kunststoffoberfläche. Stoppen Sie die Trypsin-Wirkung, indem Sie zwei Milliliter des vollständigen Mediums hinzufügen und alle Zellen in einem 15-Milliliter-Röhrchen sammeln. Entfernen Sie das restliche Trypsin durch Zentrifugation.Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, suspendieren Sie die Zellen in fünf Milliliter vollständigem Medium und überführen Sie die Zellsuspension in einen neuen T25-Kolben. Für die Kryokonservierung zählen Sie ein Aliquot der abgelösten Zellen mit dem Zellzähler unter einem optischen Mikroskop. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 300 G.Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, suspendieren Sie die Zellen in der Gefriermischung mit einer Dichte von eins mal 10 bis zu den sechsten Zellen pro Milliliter und überführen Sie einen Milliliter der Zellsuspension in ein Kryofläschchen. Legen Sie die Kryofläschchen bei minus 80 Grad Celsius in einen Gefrierbehälter, der die Temperatur um ein Grad Celsius pro Minute senkt, und stellen Sie die Kryofläschchen dann zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff. In der anfänglichen Cluster-Erscheinung zeigten die HASCs eine klassische spindelartige Form und waren kleiner sowie länglicher im Vergleich zu den Kontrollzellen in Gegenwart von FBS.Der Immunphänotyp der Zellen schien zwischen den HASCs, die mit den beiden Ergänzungen kultiviert wurden, ähnlich zu sein. Mehr als 80 bis 90 % der HASCs waren positiv für CD73 und CD105 und weniger als 5 % für CD34 und CD45. Schließlich zeigte der Proliferationstest einen signifikanten Anstieg des Zellwachstums, wenn dem Medium humanes Thrombozytenlysat zugesetzt wurde, verglichen mit der FBS-Kontrolle.Der wichtigste Schritt ist die Mikrodissektion von Fettfragmenten und deren Befestigung mit einem Skalpellschnitt an der Petrischale. Unter Berücksichtigung der GMP-Biosicherheitskriterien wird eine gebrauchsfertige Stammzellpopulation aus menschlichem Fett erhalten, die die therapeutischen Zelleigenschaften beibehält und die Zellproliferation fördert.

Research

JoVE Journal

Medicine

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