Name: isolation and culture of human adipose-derived stem cells with an innovative xenogeneic-free method for human therapy
Uploaded: 2023-02-03T14:50:00
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Gli autori non hanno riconoscimenti.

Le hASC sono state isolate dal tessuto adiposo addominale di una donna sana sottoposta a ricostruzione mammaria utilizzando lembi autologhi addominali (lembi perforatori epigastrici inferiori profondi, [DIEP]) presso l'Ospedale universitario di Losanna, CHUV, Losanna, Svizzera. La parte scartata del lembo e del tessuto adiposo è stata ottenuta dopo che il paziente ha firmato il consenso informato. Tutti i protocolli sono stati esaminati e approvati dal Dipartimento della Biobanca dell'ospedale DAL (numero 314 GGC) e dai...

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	<li>Naderi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regenerative+role+of+adipose-derived+stem+cells+(ADSC)+in+plastic+and+reconstructive+surgery.">The regenerative role of adipose-derived stem cells (ADSC) in plastic and reconstructive surgery.</a> International Wound Journal. 14 (1), 112-124 (2017).</li><li>Guiotto, M., Riehle, M. O., Raffoul, W., Hart, A., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+human+platelet+lysate+(hPL)+the+ideal+candidate+to+substitute+the+foetal+bovine+serum+for+cell-therapy+translational+research.">Is human platelet lysate (hPL) the ideal candidate to substitute the foetal bovine serum for cell-therapy translational research.</a> Journal of Translational Medicine. 19 (1), 426 (2021).</li><li>Cond&#233;-Green, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shift+toward+mechanical+isolation+of+adipose-derived+stromal+vascular+fraction:+Review+of+upcoming+techniques.">Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: Review of upcoming techniques.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 4 (9), 1017 (2016).</li><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+Implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+adipose-derived+stem+cells+and+collagenase+in+fat+tissue+preparation.">Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation.</a> Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).</li><li>Spees, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalized+antigens+must+be+removed+to+prepare+hypoimmunogenic+mesenchymal+stem+cells+for+cell+and+gene+therapy.">Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy.</a> Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).</li><li>Fadel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+obtainment+and+isolation+of+two+mesenchymal+stem+cell+sources+in+sheep.">Protocols for obtainment and isolation of two mesenchymal stem cell sources in sheep.</a> Acta Cirurgica Brasileria. 26 (4), 267-273 (2011).</li><li>Markarian, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adipose-derived+stem+cells:+A+comparison+among+different+methods.">Isolation of adipose-derived stem cells: A comparison among different methods.</a> Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).</li><li>Sherman, L. S., Cond&#233;-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-free+method+for+isolation+and+expansion+of+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells.">An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).</li><li>Lalu, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+cell+therapy+with+mesenchymal+stromal+cells+(SafeCell):+A+systematic+review+and+meta-analysis+of+clinical+trials.">Safety of cell therapy with mesenchymal stromal cells (SafeCell): A systematic review and meta-analysis of clinical trials.</a> PLoS One. 7 (10), 47559 (2012).</li><li>Escobar, C. H., Chaparro, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xeno-free+extraction,+culture,+and+cryopreservation+of+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells.">Xeno-free extraction, culture, and cryopreservation of human adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 5 (3), 358-365 (2016).</li><li>Vaidya, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet-C+irradiation+for+inactivation+of+viruses+in+foetal+bovine+serum.">Ultraviolet-C irradiation for inactivation of viruses in foetal bovine serum.</a> Vaccine. 36 (29), 4215-4221 (2018).</li><li>Kyll&#246;nen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+serum+conditions+on+osteogenic+differentiation+of+human+adipose+stem+cells+in+vitro.">Effects of different serum conditions on osteogenic differentiation of human adipose stem cells in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (1), 17 (2013).</li><li>Schallmoser, K., Henschler, R., Gabriel, C., Koh, M. B. C., Burnouf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+quality+requirements+of+human+platelet+lysate:+A+position+statement+from+the+Working+Party+on+Cellular+Therapies+of+the+International+Society+of+Blood+Transfusion.">Production and quality requirements of human platelet lysate: A position statement from the Working Party on Cellular Therapies of the International Society of Blood Transfusion.</a> Trends in Biotechnology. 38 (1), 13-23 (2020).</li><li>Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+to+substitute+fetal+bovine+serum+in+hMSC+expansion+for+translational+applications:+A+systematic+review.">Human platelet lysate to substitute fetal bovine serum in hMSC expansion for translational applications: A systematic review.</a> Journal of Translational Medicine. 18 (1), 351 (2020).</li><li>Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+acts+synergistically+with+laminin+to+improve+the+neurotrophic+effect+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+primary+neurons.">Human platelet lysate acts synergistically with laminin to improve the neurotrophic effect of human adipose-derived stem cells on primary neurons.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 658176 (2021).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Cowper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+as+a+functional+substitute+for+fetal+bovine+serum+in+the+culture+of+human+adipose+derived+stromal/stem+cells.">Human platelet lysate as a functional substitute for fetal bovine serum in the culture of human adipose derived stromal/stem cells.</a> Cells. 8 (7), 724 (2019).</li><li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+the+treatment+and+prevention+of+graft-versus-host+disease:+Experiments+and+practice.">Mesenchymal stem cells for the treatment and prevention of graft-versus-host disease: Experiments and practice.</a> Annals of Hematology. 92 (10), 1295-1308 (2013).</li><li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+metal+micro+and+nano-particles+on+hASCs:+An+in+vitro+model.">Effects of metal micro and nano-particles on hASCs: An in vitro model.</a> Nanomaterials. 7 (8), 212 (2017).</li><li>Han, S., Sun, H. 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N., Papamichail, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+medium+composition+and+translational+adult+bone+marrow-derived+stem+cell+research.">Cell culture medium composition and translational adult bone marrow-derived stem cell research.</a> Stem Cells. 24 (5), 1409-1410 (2006).</li><li>Perez-Ilzarbe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+ex+vivo+expansion+culture+conditions+of+mesenchymal+stem+cells+for+human+cell+therapy.">Comparison of ex vivo expansion culture conditions of mesenchymal stem cells for human cell therapy.</a> Transfusion. 49 (9), 1901-1910 (2009).</li><li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+cell-detaching+methods+on+the+viability+and+cell+surface+antigen+expression+of+synovial+mesenchymal+stem+cells.">Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li><li>Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-enzymatic+method+for+isolating+human+adipose+tissue-derived+stromal+stem+cells.">A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells.</a> Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).</li><li>Becherucci, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+in+mesenchymal+stromal+cell+expansion+according+to+a+GMP+grade+protocol:+A+cell+factory+experience.">Human platelet lysate in mesenchymal stromal cell expansion according to a GMP grade protocol: A cell factory experience.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 124 (2018).</li><li>Blande, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+mesenchymal+stem+cell+expansion+in+animal+serum-free+medium+supplemented+with+autologous+human+platelet+lysate.">Adipose tissue mesenchymal stem cell expansion in animal serum-free medium supplemented with autologous human platelet lysate.</a> Transfusion. 49 (12), 2680-2685 (2009).</li><li>Castegnaro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+platelet+lysate+on+the+functional+and+molecular+characteristics+of+mesenchymal+stem+cells+isolated+from+adipose+tissue.">Effect of platelet lysate on the functional and molecular characteristics of mesenchymal stem cells isolated from adipose tissue.</a> Current Stem Cell Research &amp; Therapy. 6 (2), 105-114 (2011).</li><li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+review+and+meta-analysis+on+the+use+of+human+platelet+lysate+for+mesenchymal+stem+cell+cultures:+Comparison+with+fetal+bovine+serum+and+considerations+on+the+production+protocol.">Systematic review and meta-analysis on the use of human platelet lysate for mesenchymal stem cell cultures: Comparison with fetal bovine serum and considerations on the production protocol.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 13 (1), 142 (2022).</li><li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+as+a+potential+clinical-translatable+supplement+to+support+the+neurotrophic+properties+of+human+adipose-derived+stem+cells.">Human platelet lysate as a potential clinical-translatable supplement to support the neurotrophic properties of human adipose-derived stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (1), 432 (2020).</li><li>Kr&#228;henb&#252;hl, S. M., Grognuz, A., Michetti, M., Raffoul, W., Applegate, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+human+adipose-derived+stem+cell+expansion+and+stability+for+clinical+use.">Enhancement of human adipose-derived stem cell expansion and stability for clinical use.</a> International Journal of Stem Cell Research &amp; Therapy. 2 (1), 007 (2015).</li></ol>

Le cellule staminali derivate dall'adiposio hanno attirato l'interesse della ricerca traslazionale nell'ultimo decennio grazie alla loro abbondanza, ai metodi di isolamento rapidi e convenienti, all'alto tasso di proliferazione in vitro / in vivo e alle proprietà di staminalità / differenziazione18,19,20. Di conseguenza, le hASC sono considerate un ottimo candidato per le strategie basate sulle cellule nella ...

Negli ultimi decenni, la crescente domanda di trattamenti terapeutici innovativi ha dato luogo a notevoli sforzi e investimenti di risorse nel campo della medicina traslazionale1. I prodotti a base cellulare sono associati a rischi determinati dalla fonte cellulare, dal processo di produzione (isolamento, espansione o modificazione genetica) e dagli integratori non cellulari (enzimi, fattori di crescita, integratori di coltura e antibiotici) e questi fattori di rischio dipendono dalla specifica indicazione terapeutica. La qualità, la sicurezza e l'efficacia del prodotto finale potrebbero essere profondamente influenzate dagli elementi sopra indicati2. La terapia con cellule staminali richiede il rispetto dei principi di biosicurezza; I potenziali rischi di trasmissione patogena con prodotti di origine animale in coltura cellulare potrebbero essere problematici e la sperimentazione approfondita di qualsiasi prodotto introdotto nella fabbricazione è essenziale3.
Il metodo tradizionale per isolare le cellule staminali derivate dal tessuto adiposo umano (hASC) prevede una digestione enzimatica eseguita con collagenasi seguita da fasi di lavaggio attraverso la centrifugazione4. Mentre l'isolamento enzimatico è generalmente considerato più efficiente di altre tecniche meccaniche in termini di rese cellulari e vitalità, i componenti di origine animale utilizzati, come la collagenasi, sono considerati più che minimamente manipolati dalla Food and Drug Administration degli Stati Uniti. Ciò significa che vi è un rischio significativamente aumentato di reazioni immunitarie o di trasmissione di malattie, limitando così la traduzione della terapia con hASC in contesti clinici 5,6.
La digestione a base di tripsina è un altro protocollo enzimatico per isolare le ASC. Sono state descritte diverse tecniche con lievi modifiche in termini di concentrazione di tripsina, velocità di centrifugazione e tempo di incubazione. Sfortunatamente, questo metodo non è ben descritto e manca il confronto in letteratura, in particolare con i protocolli di isolamento meccanico7. Tuttavia, in termini di traducibilità dell'approccio, la tripsina presenta gli stessi inconvenienti della collagenasi.
Metodi di isolamento alternativi per ottenere ASC, basati su forze meccaniche e senza aggiunta enzimatica, comportano la centrifugazione ad alta velocità (800 x g o 1.280 x g, 15 min) dei frammenti di tessuto adiposo. Quindi, il pellet viene incubato con un tampone di lisi dei globuli rossi (5 min), seguito da un'altra fase di centrifugazione a 600 x g prima della risospensione in terreno di coltura. Nonostante un numero maggiore di cellule isolate nei primi giorni rispetto ai metodi di espianto, uno studio precedente ha mostrato una proliferazione inferiore o assente oltre la seconda settimana di coltura8.
Oltre a ciò, un'ulteriore manipolazione con mezzo aggiunto xenogenico, come il siero bovino fetale (FBS), che viene utilizzato come integratore del fattore di crescita per la coltura cellulare, è associata ad un aumentato rischio di reattività immunitaria ed esposizione a infezioni virali, batteriche o prioniche del paziente ospite 9,10. Reazioni immunitarie e sviluppo di rash orticariforme sono già stati descritti in soggetti trattati con diverse dosi di cellule staminali mesenchimali prodotte con FBS11. Inoltre, FBS è soggetta a variabilità da lotto a lotto, che può avere un impatto sulla qualità del prodotto finale12.
In conformità con le linee guida sulle buone pratiche di fabbricazione (GMP), la dissociazione enzimatica dei tessuti deve essere evitata e l'FBS deve essere sostituito con integratori privi di xenogenici. Questi passaggi, insieme a protocolli più affidabili e riproducibili, sono essenziali per supportare l'applicazione della terapia cellulare 3,13.
In questo contesto, il lisato piastrinico umano (hPL) è stato suggerito come sostituto di FBS poiché è un integratore privo di cellule, contenente proteine, arricchito con fattore di crescita, ed è stato precedentemente introdotto tra i prodotti cellulari di grado clinico come additivo del mezzo di crescita per la coltura cellulare in vitro el'espansione 14,15. Poiché l'hPL è un prodotto di derivazione umana, viene spesso utilizzato come sostituto dell'FBS durante la coltura in vitro di hASC destinate ad applicazioni cliniche, riducendo così i problemi relativi alle reazioni immunologiche e alle infezioni correlate alla traducibilità della FBS15,16.
Nonostante i maggiori costi di produzione, è già stato dimostrato che rispetto all'FBS, l'hPL supporta la vitalità cellulare per molti tipi cellulari, aumenta la proliferazione, ritarda la senescenza, assicura la stabilità genomica e conserva l'immunofenotipo cellulare anche nei passaggi cellulari tardivi; Tutti questi elementi supportano il passaggio a questo supplemento culturale11.
Lo scopo di questo lavoro era quello di sviluppare un protocollo standardizzato per isolare e coltivare hASC con un metodo completo privo di animali, senza modificare la fisiologia cellulare e le proprietà di staminalità rispetto alle classiche hASC coltivate con FBS (Figura 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>euroclone</td>
			<td>et5015b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD105</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD560839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD34</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD555821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD555482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD73</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD561254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer)</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument)</td>
			<td>BD accuri</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burker chamber</td>
			<td>Blaubrand</td>
			<td>717810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell freezing container</td>
			<td>corning</td>
			<td>CLS432002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell Freezing container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS432002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>clearline</td>
			<td>390701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposabile blade scalpel</td>
			<td>paragon</td>
			<td>bs 2982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Platelet Lysate FD (GMP grade)</td>
			<td>Stemulate</td>
			<td>PL-NH-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite F50 spectrophotometer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 10 cm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scalpels</td>
			<td>Reda</td>
			<td>07104-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissors</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>4071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tweezers</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>1152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging bucket centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3-16K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flasks</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>6910170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLe (animal free trypsin substitute)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12604-013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of human adipose-derived stem cells with an innovative xenogeneic-free method for human therapy

Considerando il crescente impatto della terapia con cellule staminali, sono state sollevate preoccupazioni in materia di biosicurezza per quanto riguarda la potenziale contaminazione o trasmissione di infezioni dovute all'introduzione di prodotti di origine animale durante la manipolazione in vitro . I componenti xenogenici, come la collagenasi o il siero fetale bovino, comunemente usati durante le fasi di isolamento cellulare e di espansione potrebbero essere associati ai potenziali rischi di reattività immunitaria o infezione virale, batterica e prionica nei pazienti riceventi. Seguendo le linee guida sulle buone pratiche di fabbricazione, la dissociazione chimica dei tessuti dovrebbe essere evitata, mentre il siero bovino fetale (FBS) può essere sostituito con integratori privi di xenogenici. Inoltre, per garantire la sicurezza dei prodotti cellulari, è importante definire metodi più affidabili e riproducibili. Abbiamo sviluppato un metodo innovativo, completamente xenogenico-free per l'isolamento e l'espansione in vitro di cellule staminali derivate da adiposo umano senza alterarne le proprietà rispetto ai protocolli standard di coltura FBS di collagenasi. Qui, le cellule staminali derivate dal tessuto adiposo umano (hASC) sono state isolate dal tessuto adiposo addominale. Il campione è stato tritato meccanicamente con forbici / bisturi, micro-sezionato e disperso meccanicamente in una capsula di Petri di 10 cm e preparato con incisioni di bisturi per facilitare l'attaccamento dei frammenti di tessuto e la migrazione delle hASC. Dopo le fasi di lavaggio, le hASC sono state selezionate grazie alla loro aderenza plastica senza digestione enzimatica. Le hASC isolate sono state coltivate con terreno integrato con lisato piastrinico umano privo di eparina al 5% e staccate con un sostituto della tripsina privo di animali. Seguendo le indicazioni delle buone pratiche di fabbricazione (GMP) sulla produzione di prodotti cellulari destinati alla terapia umana, non sono stati utilizzati antibiotici in alcun terreno di coltura.

Applicando il metodo di isolamento descritto sopra, le hASC sono state ottenute con successo da campioni di tessuto adiposo addominale senza l'uso di collagenasi. Inoltre, le hASC sono state espanse in condizioni completamente prive di xenogenici in presenza di hPL e senza altri componenti di origine animale. I seguenti risultati supportano il protocollo e sono ottenuti da hASC coltivate in parallelo con hPL e con FBS come condizione di controllo.
Dopo l'apparizione iniziale del cluster, le hA...

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Isolation and Culture of Human Adipose-Derived Stem Cells With an Innovative Xenogeneic-Free Method for Human Therapy

I prodotti xenogenici (chimici o di derivazione animale) introdotti nelle fasi di preparazione/manipolazione della terapia cellulare sono associati ad un aumentato rischio di reattività immunitaria e trasmissione patogena nei pazienti ospiti. Qui viene descritto un metodo completamente privo di xenogenici per l'isolamento e l'espansione in vitro di cellule staminali derivate da adiposo umano.

Isolamento e coltura di cellule staminali umane derivate da adiposio con un innovativo metodo xenogenico-free per la terapia umana

Considering the increasing impact of stem cell therapy, biosafety concerns have been raised regarding potential contamination or infection transmission ...

Il nostro metodo privo di esogeni per l'isolamento e l'espansione in vitro di cellule staminali derivate da adiposo umano è la risposta ai problemi di biosicurezza relativi alla terapia cellulare quando viene considerata per l'applicazione traslazionale. I nostri metodi di isolamento ed espansione sono semplici da replicare, rapidi e con requisiti tecnici ridotti, rendendoli utili a tutti. Studiamo la strategia terapeutica basata sulle cellule staminali adipose umane per la riparazione dei nervi periferici.Tuttavia, la nostra tecnica può essere ampiamente applicata quando sono necessarie nuove cellule staminali adipose in diverse configurazioni di ricerca clinica. Abbiamo mantenuto la semplicità per conservare una più facile producibilità. La sterilità deve essere attentamente osservata dalla sala operatoria fino alla coltura cellulare.Per la manipolazione dei campioni e dei frammenti, la microdissezione è a rischio di contaminazione. Dopo aver ottenuto il campione di tessuto adiposo dalla chirurgia plastica addominale, usando forbici sterili, tagliarlo in pezzi di circa un centimetro quadrato. Con un bisturi, micro sezionare ogni pezzo in frammenti più piccoli e disperdere cinque frammenti in una capsula di Petri di 10 centimetri.Per l'attacco del frammento, utilizzare un bisturi per creare incisioni sulla superficie di plastica e trascinare ogni frammento. Delicatamente, aggiungere 10 millilitri di terreno di coltura completo per coprire tutti i frammenti senza staccarli e incubare la capsula di Petri a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Monitorare quotidianamente l'espansione delle cellule staminali derivate dal tessuto adiposo umano, o HASC, al microscopio ottico fino a quando le cellule non diventano confluenti.Sostituire il mezzo con un nuovo mezzo completo ogni 72 ore per rimuovere i detriti cellulari e lasciarli crescere fino al primo passaggio. Una volta che la coltura HASC raggiunge il 70-80% di confluenza, rimuovere e scartare tutti i pezzi di tessuto usando pinzette sterili. Inoltre, scartare il mezzo esaurito evitando il distacco dell'HASC dalla capsula di Petri.Lavare accuratamente le cellule con 10 millilitri di PBS. Dopo aver rimosso PBS, aggiungere un millilitro di tripsina senza animali e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Verificare il distacco delle cellule al microscopio ottico e incubare per altri due minuti, se necessario.Per sostenere il distacco della cella, picchiettare delicatamente sulla superficie di plastica. Interrompere l'azione della tripsina aggiungendo due millilitri di mezzo completo e raccogliere tutte le cellule in un tubo da 15 millilitri. Rimuovere la tripsina rimanente mediante centrifugazione.Dopo aver scartato il surnatante, sospendere le celle in un mezzo completo da cinque millilitri e trasferire la sospensione cellulare in un nuovo matraccio T25. Per la crioconservazione, contare un'aliquota di cellule staccate utilizzando il contatore di cellule sotto un microscopio ottico. Centrifugare le cellule a 300 G per cinque minuti.Dopo aver scartato il surnatante, sospendere le cellule nella miscela di congelamento ad una densità di una volta 10 alla sesta cellula per millilitro e trasferire un millilitro della sospensione cellulare in una fiala di crio. Mettere le fiale criogeniche a meno 80 gradi Celsius in un contenitore di congelamento che riduce la temperatura di un grado Celsius al minuto e quindi spostare le fiale criogeniche in azoto liquido per la conservazione a lungo termine. Nell'aspetto iniziale del cluster, gli HASC mostravano una classica forma a fuso ed erano più piccoli, oltre che più allungati rispetto alle celle di controllo in presenza di FBS.L'immunofenotipo cellulare sembrava essere simile tra gli HASC coltivati con i due integratori. Più dell'80-90% degli HASC erano positivi per CD73 e CD105 e meno del 5% espressi per CD34 e CD45. Infine, il test di proliferazione ha rivelato un aumento significativo della crescita cellulare quando il lisato piastrinico umano è stato aggiunto al terreno rispetto al controllo FBS.Il passo più importante è la micro dissezione dei frammenti adiposi e il loro attacco con incisione a bisturi sulla piastra di Petri. Si ottiene una popolazione di cellule staminali derivate da adiposo umano pronta all'uso nel rispetto dei criteri di biosicurezza GMP, mantenendo le proprietà terapeutiche delle cellule e migliorando la proliferazione cellulare.

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