Name: isolation and culture of human adipose-derived stem cells with an innovative xenogeneic-free method for human therapy
Uploaded: 2023-02-03T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Human Adipose-Derived Stem Cells With an Innovative Xenogeneic-Free Method for Human Therapy at JoVE.com

Forfatterne har ingen erkjennelser.

hASCs ble isolert fra abdominalt fettvev hos en frisk kvinne som gjennomgikk brystrekonstruksjon ved hjelp av abdominale autologe (deep inferior epigastric perforator flaps, [DIEP]) ved universitetssykehuset i Lausanne, CHUV, Lausanne, Sveits. Den kasserte delen av og fettvevet ble innhentet etter at pasienten signerte informert samtykke. Alle protokoller ble gjennomgått og godkjent av sykehusets Biobank Department DAL (nummer 314 GGC) og etiske komiteer i henhold til Helsinkideklarasjonen.
M...

<ol>
	<li>Naderi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regenerative+role+of+adipose-derived+stem+cells+(ADSC)+in+plastic+and+reconstructive+surgery.">The regenerative role of adipose-derived stem cells (ADSC) in plastic and reconstructive surgery.</a> International Wound Journal. 14 (1), 112-124 (2017).</li><li>Guiotto, M., Riehle, M. O., Raffoul, W., Hart, A., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+human+platelet+lysate+(hPL)+the+ideal+candidate+to+substitute+the+foetal+bovine+serum+for+cell-therapy+translational+research.">Is human platelet lysate (hPL) the ideal candidate to substitute the foetal bovine serum for cell-therapy translational research.</a> Journal of Translational Medicine. 19 (1), 426 (2021).</li><li>Cond&#233;-Green, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shift+toward+mechanical+isolation+of+adipose-derived+stromal+vascular+fraction:+Review+of+upcoming+techniques.">Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: Review of upcoming techniques.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 4 (9), 1017 (2016).</li><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+Implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+adipose-derived+stem+cells+and+collagenase+in+fat+tissue+preparation.">Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation.</a> Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).</li><li>Spees, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalized+antigens+must+be+removed+to+prepare+hypoimmunogenic+mesenchymal+stem+cells+for+cell+and+gene+therapy.">Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy.</a> Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).</li><li>Fadel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+obtainment+and+isolation+of+two+mesenchymal+stem+cell+sources+in+sheep.">Protocols for obtainment and isolation of two mesenchymal stem cell sources in sheep.</a> Acta Cirurgica Brasileria. 26 (4), 267-273 (2011).</li><li>Markarian, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adipose-derived+stem+cells:+A+comparison+among+different+methods.">Isolation of adipose-derived stem cells: A comparison among different methods.</a> Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).</li><li>Sherman, L. S., Cond&#233;-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-free+method+for+isolation+and+expansion+of+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells.">An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).</li><li>Lalu, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+cell+therapy+with+mesenchymal+stromal+cells+(SafeCell):+A+systematic+review+and+meta-analysis+of+clinical+trials.">Safety of cell therapy with mesenchymal stromal cells (SafeCell): A systematic review and meta-analysis of clinical trials.</a> PLoS One. 7 (10), 47559 (2012).</li><li>Escobar, C. H., Chaparro, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xeno-free+extraction,+culture,+and+cryopreservation+of+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells.">Xeno-free extraction, culture, and cryopreservation of human adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 5 (3), 358-365 (2016).</li><li>Vaidya, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet-C+irradiation+for+inactivation+of+viruses+in+foetal+bovine+serum.">Ultraviolet-C irradiation for inactivation of viruses in foetal bovine serum.</a> Vaccine. 36 (29), 4215-4221 (2018).</li><li>Kyll&#246;nen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+serum+conditions+on+osteogenic+differentiation+of+human+adipose+stem+cells+in+vitro.">Effects of different serum conditions on osteogenic differentiation of human adipose stem cells in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (1), 17 (2013).</li><li>Schallmoser, K., Henschler, R., Gabriel, C., Koh, M. B. C., Burnouf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+quality+requirements+of+human+platelet+lysate:+A+position+statement+from+the+Working+Party+on+Cellular+Therapies+of+the+International+Society+of+Blood+Transfusion.">Production and quality requirements of human platelet lysate: A position statement from the Working Party on Cellular Therapies of the International Society of Blood Transfusion.</a> Trends in Biotechnology. 38 (1), 13-23 (2020).</li><li>Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+to+substitute+fetal+bovine+serum+in+hMSC+expansion+for+translational+applications:+A+systematic+review.">Human platelet lysate to substitute fetal bovine serum in hMSC expansion for translational applications: A systematic review.</a> Journal of Translational Medicine. 18 (1), 351 (2020).</li><li>Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+acts+synergistically+with+laminin+to+improve+the+neurotrophic+effect+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+primary+neurons.">Human platelet lysate acts synergistically with laminin to improve the neurotrophic effect of human adipose-derived stem cells on primary neurons.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 658176 (2021).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Cowper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+as+a+functional+substitute+for+fetal+bovine+serum+in+the+culture+of+human+adipose+derived+stromal/stem+cells.">Human platelet lysate as a functional substitute for fetal bovine serum in the culture of human adipose derived stromal/stem cells.</a> Cells. 8 (7), 724 (2019).</li><li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+the+treatment+and+prevention+of+graft-versus-host+disease:+Experiments+and+practice.">Mesenchymal stem cells for the treatment and prevention of graft-versus-host disease: Experiments and practice.</a> Annals of Hematology. 92 (10), 1295-1308 (2013).</li><li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+metal+micro+and+nano-particles+on+hASCs:+An+in+vitro+model.">Effects of metal micro and nano-particles on hASCs: An in vitro model.</a> Nanomaterials. 7 (8), 212 (2017).</li><li>Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stromal+vascular+fraction+cells:+Update+on+clinical+utility+and+efficacy.">Adipose-derived stromal vascular fraction cells: Update on clinical utility and efficacy.</a> Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).</li><li>Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+medium+composition+and+translational+adult+bone+marrow-derived+stem+cell+research.">Cell culture medium composition and translational adult bone marrow-derived stem cell research.</a> Stem Cells. 24 (5), 1409-1410 (2006).</li><li>Perez-Ilzarbe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+ex+vivo+expansion+culture+conditions+of+mesenchymal+stem+cells+for+human+cell+therapy.">Comparison of ex vivo expansion culture conditions of mesenchymal stem cells for human cell therapy.</a> Transfusion. 49 (9), 1901-1910 (2009).</li><li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+cell-detaching+methods+on+the+viability+and+cell+surface+antigen+expression+of+synovial+mesenchymal+stem+cells.">Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li><li>Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-enzymatic+method+for+isolating+human+adipose+tissue-derived+stromal+stem+cells.">A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells.</a> Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).</li><li>Becherucci, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+in+mesenchymal+stromal+cell+expansion+according+to+a+GMP+grade+protocol:+A+cell+factory+experience.">Human platelet lysate in mesenchymal stromal cell expansion according to a GMP grade protocol: A cell factory experience.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 124 (2018).</li><li>Blande, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+mesenchymal+stem+cell+expansion+in+animal+serum-free+medium+supplemented+with+autologous+human+platelet+lysate.">Adipose tissue mesenchymal stem cell expansion in animal serum-free medium supplemented with autologous human platelet lysate.</a> Transfusion. 49 (12), 2680-2685 (2009).</li><li>Castegnaro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+platelet+lysate+on+the+functional+and+molecular+characteristics+of+mesenchymal+stem+cells+isolated+from+adipose+tissue.">Effect of platelet lysate on the functional and molecular characteristics of mesenchymal stem cells isolated from adipose tissue.</a> Current Stem Cell Research &amp; Therapy. 6 (2), 105-114 (2011).</li><li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+review+and+meta-analysis+on+the+use+of+human+platelet+lysate+for+mesenchymal+stem+cell+cultures:+Comparison+with+fetal+bovine+serum+and+considerations+on+the+production+protocol.">Systematic review and meta-analysis on the use of human platelet lysate for mesenchymal stem cell cultures: Comparison with fetal bovine serum and considerations on the production protocol.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 13 (1), 142 (2022).</li><li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+as+a+potential+clinical-translatable+supplement+to+support+the+neurotrophic+properties+of+human+adipose-derived+stem+cells.">Human platelet lysate as a potential clinical-translatable supplement to support the neurotrophic properties of human adipose-derived stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (1), 432 (2020).</li><li>Kr&#228;henb&#252;hl, S. M., Grognuz, A., Michetti, M., Raffoul, W., Applegate, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+human+adipose-derived+stem+cell+expansion+and+stability+for+clinical+use.">Enhancement of human adipose-derived stem cell expansion and stability for clinical use.</a> International Journal of Stem Cell Research &amp; Therapy. 2 (1), 007 (2015).</li></ol>

Adipose-avledede stamceller har tiltrukket seg interessen for translasjonsforskning i det siste tiåret på grunn av deres overflod, raske og rimelige isolasjonsmetoder, høy in vitro / in vivo proliferasjonshastighet og stemness / differensieringsegenskaper18,19,20. Som et resultat anses hASC som en utmerket kandidat for cellebaserte strategier innen regenerativ medisin21. Etter isoleri...

I de siste tiårene har den økende etterspørselen etter innovative terapeutiske behandlinger gitt opphav til betydelig innsats og ressursinvestering i translasjonsmedisinfeltet1. Cellebaserte produkter er forbundet med risiko bestemt av cellekilden, produksjonsprosessen (isolasjon, utvidelse eller genetisk modifisering) og de ikke-cellulære kosttilskuddene (enzymer, vekstfaktorer, kulturtilskudd og antibiotika), og disse risikofaktorene avhenger av den spesifikke terapeutiske indikasjonen. Kvaliteten, sikkerheten og effekten av sluttproduktet kan bli dypt påvirket av de ovenfor angitte elementene2. Stamcelleterapi krever overholdelse av biosikkerhetsprinsipper; Den potensielle risikoen for patogen overføring med animalske avledede produkter i cellekultur kan være problematisk, og grundig testing av ethvert produkt introdusert i produksjonen er viktig3.
Den tradisjonelle metoden for å isolere humane fettavledede stamceller (hASCs) innebærer en enzymatisk fordøyelse utført med kollagenase etterfulgt av vasketrinn gjennom sentrifugering4. Mens enzymatisk isolasjon generelt anses som mer effektiv enn andre mekaniske teknikker når det gjelder celleutbytte og levedyktighet, anses de animalske avledede komponentene som brukes, som kollagenase, mer enn minimalt manipulert av US Food and Drug Administration. Dette betyr at det er en betydelig økt risiko for immunreaksjoner eller sykdomsoverføring, og dermed begrense oversettelsen av hASC-terapi til kliniske innstillinger 5,6.
Trypsinbasert fordøyelse er en annen enzymatisk protokoll for å isolere ASC-er. Ulike teknikker har blitt beskrevet med små modifikasjoner når det gjelder trypsinkonsentrasjon, sentrifugeringshastighet og inkubasjonstid. Dessverre er denne metoden ikke godt beskrevet, og det finnes en mangel på sammenligning i litteraturen, spesielt med de mekaniske isolasjonsprotokollene7. Men når det gjelder oversettbarheten av tilnærmingen, har trypsin de samme ulempene med kollagenase.
Alternative isolasjonsmetoder for å oppnå ASC-er, basert på mekaniske krefter og uten enzymaddisjon, involverer høyhastighets sentrifugering (800 x g eller 1,280 x g, 15 min) av fettvevsfragmentene. Deretter inkuberes pelleten med en lysisbuffer for røde blodlegemer (5 min), etterfulgt av et nytt sentrifugeringstrinn ved 600 x g før resuspensjon i dyrkningsmedium. Til tross for at et større antall celler ble isolert de første dagene sammenlignet med eksplanteringsmetodene, viste en tidligere studie lavere eller fraværende spredning utover den andre uken av kultur8.
Dessuten er ytterligere manipulering med xenogent tilsatt medium, som føtalt bovint serum (FBS), som brukes som et vekstfaktortilskudd for cellekultur, forbundet med økt risiko for immunreaktivitet og eksponering for virus-, bakterie- eller prioninfeksjoner hos vertspasienten 9,10. Immunreaksjoner og utvikling av urtikariform utslett er allerede beskrevet hos personer som får flere doser mesenkymale stamceller produsert med FBS11. Videre er FBS utsatt for batch-til-batch-variabilitet, noe som kan ha innvirkning på sluttproduktkvaliteten12.
I samsvar med retningslinjer for god produksjonspraksis (GMP) bør enzymatisk vevsdissosiasjon unngås, og FBS bør erstattes med xenogenfrie tilskudd. Disse trinnene, sammen med mer pålitelige og reproduserbare protokoller, er avgjørende for å støtte anvendelsen av celleterapi 3,13.
I denne sammenheng har humant blodplatelysat (hPL) blitt foreslått som en erstatning for FBS siden det er et cellefritt, proteinholdig, vekstfaktorberiket supplement, og det ble tidligere introdusert blant klinisk cellebaserte produkter som et tilsetningsstoff av vekstmedium for in vitro cellekultur og ekspansjon14,15. Siden hPL er et humant avledet produkt, brukes det ofte som en erstatning for FBS under in vitro-kulturen av hASC-er beregnet for kliniske applikasjoner, og reduserer dermed problemer med immunologiske reaksjoner og infeksjoner relatert til FBS-oversettbarhet15,16.
Til tross for de høyere produksjonskostnadene har det allerede blitt påvist at sammenlignet med FBS støtter hPL cellelevedyktighet for mange celletyper, øker spredning, forsinker aldring, sikrer genomisk stabilitet og bevarer den cellulære immunfenotypen selv i sene cellepassasjer; Alle disse elementene støtter overgangen til dette kulturtillegget11.
Målet med dette arbeidet var å utvikle en standardisert protokoll for å isolere og dyrke hASC med en komplett dyrefri metode, uten å endre cellefysiologi og stamhetsegenskaper sammenlignet med klassiske FBS-dyrkede hASCs (figur 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>euroclone</td>
			<td>et5015b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD105</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD560839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD34</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD555821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD555482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD73</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD561254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer)</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument)</td>
			<td>BD accuri</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burker chamber</td>
			<td>Blaubrand</td>
			<td>717810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell freezing container</td>
			<td>corning</td>
			<td>CLS432002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell Freezing container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS432002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>clearline</td>
			<td>390701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposabile blade scalpel</td>
			<td>paragon</td>
			<td>bs 2982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Platelet Lysate FD (GMP grade)</td>
			<td>Stemulate</td>
			<td>PL-NH-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite F50 spectrophotometer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 10 cm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scalpels</td>
			<td>Reda</td>
			<td>07104-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissors</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>4071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tweezers</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>1152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging bucket centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3-16K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flasks</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>6910170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLe (animal free trypsin substitute)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12604-013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of human adipose-derived stem cells with an innovative xenogeneic-free method for human therapy

Tatt i betraktning den økende effekten av stamcellebehandling, har biosikkerhetsproblemer blitt reist angående potensiell forurensning eller infeksjonsoverføring på grunn av innføring av animalske avledede produkter under in vitro-manipulasjon . De xenogene komponentene, som kollagenase eller føtalt bovint serum, som vanligvis brukes under celleisolasjons- og ekspansjonstrinnene, kan være forbundet med de potensielle risikoene for immunreaktivitet eller virus-, bakterie- og prioninfeksjon hos de mottakende pasientene. Etter retningslinjer for god produksjonspraksis bør kjemisk vevsdissosiasjon unngås, mens fosterets bovint serum (FBS) kan erstattes med xenogenfrie kosttilskudd. Videre, for å sikre sikkerheten til celleprodukter, er definisjonen av mer pålitelige og reproduserbare metoder viktig. Vi har utviklet en innovativ, helt xenogenfri metode for isolering og in vitro-utvidelse av humane fettavledede stamceller uten å endre egenskapene sammenlignet med kollagenase FBS-dyrkede standardprotokoller. Her ble humane fettavledede stamceller (hASC) isolert fra abdominalt fettvev. Prøven ble mekanisk hakket med saks/skalpell, mikrodissekert og mekanisk dispergert i en 10 cm petriskål, og fremstilt med skalpellsnitt for å lette festingen av vevsfragmentene og migrasjonen av hASCs. Etter vasketrinnene ble hASC valgt på grunn av deres plastiske adherens uten enzymatisk fordøyelse. De isolerte hASCene ble dyrket med medium supplert med 5 % heparinfritt humant blodplatelysat og løsnet med en dyrefri trypsinsubstitutt. Etter god produksjonspraksis (GMP) anvisninger på produksjon av celleprodukter beregnet for human terapi, ble ingen antibiotika brukt i noen kulturmedier.

Ved bruk av isolasjonsmetoden beskrevet ovenfor, ble hASCs vellykket oppnådd fra abdominale fettvevsprøver uten bruk av kollagenase. Videre ble hASCene utvidet i komplette xenogene frie forhold i nærvær av hPL og uten andre komponenter av animalsk opprinnelse. Følgende resultater støtter protokollen og er hentet fra hASC-er dyrket parallelt med hPL og med FBS som kontrollbetingelse.
Etter det første klyngeutseendet viste hASC-ene den klassiske spindellignende formen og var mindre og len...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Human Adipose-Derived Stem Cells With an Innovative Xenogeneic-Free Method for Human Therapy at JoVE.com

Isolation and Culture of Human Adipose-Derived Stem Cells With an Innovative Xenogeneic-Free Method for Human Therapy

Xenogene (kjemiske eller dyreavledede) produkter introdusert i celleterapiforberedelses-/manipulasjonstrinnene er forbundet med økt risiko for immunreaktivitet og patogen overføring hos vertspasienter. Her beskrives en komplett xenogenfri metode for isolering og in vitro-ekspansjon av humane fettderiverte stamceller.

Isolering og dyrkning av humane fettavledede stamceller med en innovativ xenogenfri metode for humanterapi

Considering the increasing impact of stem cell therapy, biosafety concerns have been raised regarding potential contamination or infection transmission ...

Vår eksogene metode for isolering og in vitro-utvidelse av humane fettavledede stamceller er svaret på biosikkerhetsproblemene rundt celleterapi når det vurderes for translasjonsbruk. Våre isolasjons- og ekspansjonsmetoder er enkle å replikere, raske og har lave tekniske krav, noe som gjør dem nyttige for alle. Vi undersøker human fettstamcellebasert terapistrategi for perifer nervereparasjon.Imidlertid kan vår teknikk brukes mye når nye fettstamceller er nødvendig i forskjellige kliniske forskningsoppsett. Vi holdt det enkelt for å spare lettere produserbarhet. Sterilitet bør observeres nøye fra operasjonsstue til cellekultur.For prøvemanipulering og fragmenter er mikrodisseksjon utsatt for forurensning. Etter å ha oppnådd fettvevsprøven fra abdominal plastikkirurgi, ved hjelp av steril saks, kutt den i stykker på omtrent en kvadratcentimeter. Med en skalpell, mikrodissekere hver bit i mindre fragmenter og spre fem fragmenter i en 10 centimeter petriskål.For fragmentfeste, bruk en skalpell for å lage snitt på plastoverflaten og dra hvert fragment. Tilsett forsiktig 10 ml komplett kulturmedium for å dekke alle fragmentene uten å løsne dem og inkuber petriskålen ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Overvåk den humane fettavledede stamcellen, eller HASC, ekspansjon daglig under et optisk mikroskop til cellene blir sammenflytende.Bytt ut mediet med et friskt komplett medium hver 72. time for å fjerne celleavfall og la dem vokse til første passasje. Når HASC-kulturen når 70 til 80% konfluens, fjern og kast alle biter av vev ved hjelp av steril pinsett. Kast også det utmattede mediet for å unngå HASCs løsrivelse fra petriskålen.Vask forsiktig cellene med 10 ml PBS. Etter å ha fjernet PBS, tilsett en milliliter dyrefri trypsin og inkuber ved 37 grader Celsius i fem minutter. Sjekk for celleavløsning under et optisk mikroskop og inkuber i to minutter, om nødvendig.For å støtte celleløsningen, trykk forsiktig på plastoverflaten. Stopp trypsinvirkningen ved å legge til to milliliter komplett medium og samle alle cellene i et 15 milliliter rør. Fjern gjenværende trypsin ved sentrifugering.Etter å ha kastet supernatanten, suspender cellene i fem milliliter komplett medium og overfør cellesuspensjonen til en ny T25-kolbe. For kryokonservering, tell en alikot av løsrevne celler ved hjelp av celletelleren under et optisk mikroskop. Sentrifuge cellene ved 300 G i fem minutter.Etter å ha kastet supernatanten, suspender cellene i fryseblandingen med en tetthet på en gang 10 til den sjette cellen per milliliter og overfør en milliliter av cellesuspensjonen til ett kryohetteglass. Sett kryohetteglassene ved minus 80 grader Celsius i en frysebeholder som senker temperaturen med en grad Celsius per minutt, og flytt deretter kryohetteglassene til flytende nitrogen for langtidsoppbevaring. I det første klyngeutseendet viste HASCene en klassisk spindellignende form og var mindre, så vel som mer langstrakte sammenlignet med kontrollcellene i nærvær av FBS.Celleimmunfenotypen syntes å være lik mellom HASCene dyrket med de to kosttilskuddene. Mer enn 80 til 90 % av HASCene var positive for CD73 og CD105 og mindre enn 5 % uttrykt for CD34 og CD45. Endelig viste spredningsanalysen en signifikant økning i cellevekst når humant blodplatelysat ble tilsatt til mediet sammenlignet med FBS-kontrollen.Det viktigste trinnet er mikrodisseksjonen av fettfragmenter og deres vedlegg med skalpellsnitt på petriskål. En klar til bruk human adipose-avledet stamcellepopulasjon oppnås i forhold til GMP biosikkerhetskriterier, holde terapeutiske celleegenskaper og øke celleproliferasjon.

Research

JoVE Journal

Medicine

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stamcelletransplantasjon i en In vitro Simulert ischemia / reperfusjon Model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Isolering av Cardiomyocyte kjerner fra Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

Subretinal Injeksjon av Gene Therapy Vektorer og stamceller i mus Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolasjon, karakterisering og Comparative Differensiering av Human tannpulpa stamceller hentet fra permanente tenner ved hjelp av to ulike metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Pasient avledet celle Kultur og Isolering av CD133<sup&gt; +</sup&gt; Antatte kreft stamceller fra melanom

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Isolasjon, Kultur, og Imaging of Human Fetal Bukspyttkjertelen Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

Isolering av kreft stamceller fra menneskelige prostata kreft Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Berikelse for kjemoresistent eggstokkreft stamceller fra humane cellelinjer

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolasjon, Kryopreservering og kultur menneskerettighets amnion Epitelceller for kliniske anvendelser

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

Tredimensjonal Alginat-perle Culture of Human hypofyseadenom Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...