Name: isolation and culture of human adipose-derived stem cells with an innovative xenogeneic-free method for human therapy
Uploaded: 2023-02-03T14:50:00
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Os autores não têm reconhecimentos.

Os hASCs foram isolados do tecido adiposo abdominal de uma mulher saudável que foi submetida à reconstrução mamária usando retalhos autólogos abdominais (retalhos perfuradores epigástricos inferiores profundos, [DIEP]) no Hospital Universitário de Lausanne, CHUV, Lausanne, Suíça. A parte descartada do retalho e do tecido adiposo foi obtida após a assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido. Todos os protocolos foram revisados e aprovados pelo Departamento de Biobanco DAL do hospital (número 314 G...

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	<li>Naderi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regenerative+role+of+adipose-derived+stem+cells+(ADSC)+in+plastic+and+reconstructive+surgery.">The regenerative role of adipose-derived stem cells (ADSC) in plastic and reconstructive surgery.</a> International Wound Journal. 14 (1), 112-124 (2017).</li><li>Guiotto, M., Riehle, M. O., Raffoul, W., Hart, A., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+human+platelet+lysate+(hPL)+the+ideal+candidate+to+substitute+the+foetal+bovine+serum+for+cell-therapy+translational+research.">Is human platelet lysate (hPL) the ideal candidate to substitute the foetal bovine serum for cell-therapy translational research.</a> Journal of Translational Medicine. 19 (1), 426 (2021).</li><li>Cond&#233;-Green, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shift+toward+mechanical+isolation+of+adipose-derived+stromal+vascular+fraction:+Review+of+upcoming+techniques.">Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: Review of upcoming techniques.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 4 (9), 1017 (2016).</li><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+Implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+adipose-derived+stem+cells+and+collagenase+in+fat+tissue+preparation.">Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation.</a> Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).</li><li>Spees, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalized+antigens+must+be+removed+to+prepare+hypoimmunogenic+mesenchymal+stem+cells+for+cell+and+gene+therapy.">Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy.</a> Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).</li><li>Fadel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+obtainment+and+isolation+of+two+mesenchymal+stem+cell+sources+in+sheep.">Protocols for obtainment and isolation of two mesenchymal stem cell sources in sheep.</a> Acta Cirurgica Brasileria. 26 (4), 267-273 (2011).</li><li>Markarian, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adipose-derived+stem+cells:+A+comparison+among+different+methods.">Isolation of adipose-derived stem cells: A comparison among different methods.</a> Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).</li><li>Sherman, L. S., Cond&#233;-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-free+method+for+isolation+and+expansion+of+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells.">An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).</li><li>Lalu, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+cell+therapy+with+mesenchymal+stromal+cells+(SafeCell):+A+systematic+review+and+meta-analysis+of+clinical+trials.">Safety of cell therapy with mesenchymal stromal cells (SafeCell): A systematic review and meta-analysis of clinical trials.</a> PLoS One. 7 (10), 47559 (2012).</li><li>Escobar, C. H., Chaparro, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xeno-free+extraction,+culture,+and+cryopreservation+of+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells.">Xeno-free extraction, culture, and cryopreservation of human adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 5 (3), 358-365 (2016).</li><li>Vaidya, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet-C+irradiation+for+inactivation+of+viruses+in+foetal+bovine+serum.">Ultraviolet-C irradiation for inactivation of viruses in foetal bovine serum.</a> Vaccine. 36 (29), 4215-4221 (2018).</li><li>Kyll&#246;nen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+serum+conditions+on+osteogenic+differentiation+of+human+adipose+stem+cells+in+vitro.">Effects of different serum conditions on osteogenic differentiation of human adipose stem cells in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (1), 17 (2013).</li><li>Schallmoser, K., Henschler, R., Gabriel, C., Koh, M. B. C., Burnouf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+quality+requirements+of+human+platelet+lysate:+A+position+statement+from+the+Working+Party+on+Cellular+Therapies+of+the+International+Society+of+Blood+Transfusion.">Production and quality requirements of human platelet lysate: A position statement from the Working Party on Cellular Therapies of the International Society of Blood Transfusion.</a> Trends in Biotechnology. 38 (1), 13-23 (2020).</li><li>Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+to+substitute+fetal+bovine+serum+in+hMSC+expansion+for+translational+applications:+A+systematic+review.">Human platelet lysate to substitute fetal bovine serum in hMSC expansion for translational applications: A systematic review.</a> Journal of Translational Medicine. 18 (1), 351 (2020).</li><li>Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+acts+synergistically+with+laminin+to+improve+the+neurotrophic+effect+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+primary+neurons.">Human platelet lysate acts synergistically with laminin to improve the neurotrophic effect of human adipose-derived stem cells on primary neurons.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 658176 (2021).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Cowper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+as+a+functional+substitute+for+fetal+bovine+serum+in+the+culture+of+human+adipose+derived+stromal/stem+cells.">Human platelet lysate as a functional substitute for fetal bovine serum in the culture of human adipose derived stromal/stem cells.</a> Cells. 8 (7), 724 (2019).</li><li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+the+treatment+and+prevention+of+graft-versus-host+disease:+Experiments+and+practice.">Mesenchymal stem cells for the treatment and prevention of graft-versus-host disease: Experiments and practice.</a> Annals of Hematology. 92 (10), 1295-1308 (2013).</li><li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+metal+micro+and+nano-particles+on+hASCs:+An+in+vitro+model.">Effects of metal micro and nano-particles on hASCs: An in vitro model.</a> Nanomaterials. 7 (8), 212 (2017).</li><li>Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stromal+vascular+fraction+cells:+Update+on+clinical+utility+and+efficacy.">Adipose-derived stromal vascular fraction cells: Update on clinical utility and efficacy.</a> Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).</li><li>Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+medium+composition+and+translational+adult+bone+marrow-derived+stem+cell+research.">Cell culture medium composition and translational adult bone marrow-derived stem cell research.</a> Stem Cells. 24 (5), 1409-1410 (2006).</li><li>Perez-Ilzarbe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+ex+vivo+expansion+culture+conditions+of+mesenchymal+stem+cells+for+human+cell+therapy.">Comparison of ex vivo expansion culture conditions of mesenchymal stem cells for human cell therapy.</a> Transfusion. 49 (9), 1901-1910 (2009).</li><li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+cell-detaching+methods+on+the+viability+and+cell+surface+antigen+expression+of+synovial+mesenchymal+stem+cells.">Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li><li>Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-enzymatic+method+for+isolating+human+adipose+tissue-derived+stromal+stem+cells.">A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells.</a> Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).</li><li>Becherucci, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+in+mesenchymal+stromal+cell+expansion+according+to+a+GMP+grade+protocol:+A+cell+factory+experience.">Human platelet lysate in mesenchymal stromal cell expansion according to a GMP grade protocol: A cell factory experience.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 124 (2018).</li><li>Blande, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+mesenchymal+stem+cell+expansion+in+animal+serum-free+medium+supplemented+with+autologous+human+platelet+lysate.">Adipose tissue mesenchymal stem cell expansion in animal serum-free medium supplemented with autologous human platelet lysate.</a> Transfusion. 49 (12), 2680-2685 (2009).</li><li>Castegnaro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+platelet+lysate+on+the+functional+and+molecular+characteristics+of+mesenchymal+stem+cells+isolated+from+adipose+tissue.">Effect of platelet lysate on the functional and molecular characteristics of mesenchymal stem cells isolated from adipose tissue.</a> Current Stem Cell Research &amp; Therapy. 6 (2), 105-114 (2011).</li><li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+review+and+meta-analysis+on+the+use+of+human+platelet+lysate+for+mesenchymal+stem+cell+cultures:+Comparison+with+fetal+bovine+serum+and+considerations+on+the+production+protocol.">Systematic review and meta-analysis on the use of human platelet lysate for mesenchymal stem cell cultures: Comparison with fetal bovine serum and considerations on the production protocol.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 13 (1), 142 (2022).</li><li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+as+a+potential+clinical-translatable+supplement+to+support+the+neurotrophic+properties+of+human+adipose-derived+stem+cells.">Human platelet lysate as a potential clinical-translatable supplement to support the neurotrophic properties of human adipose-derived stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (1), 432 (2020).</li><li>Kr&#228;henb&#252;hl, S. M., Grognuz, A., Michetti, M., Raffoul, W., Applegate, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+human+adipose-derived+stem+cell+expansion+and+stability+for+clinical+use.">Enhancement of human adipose-derived stem cell expansion and stability for clinical use.</a> International Journal of Stem Cell Research &amp; Therapy. 2 (1), 007 (2015).</li></ol>

As células-tronco derivadas de tecido adiposo têm atraído o interesse da pesquisa translacional na última década devido à sua abundância, métodos de isolamento rápidos e acessíveis, alta taxa de proliferação in vitro/in vivo e propriedades de caule/diferenciação18,19,20. Como resultado, as hASCs são consideradas um excelente candidato para estratégias baseadas em células em medicina regenerativ...

Nas últimas décadas, a crescente demanda por tratamentos terapêuticos inovadores deu origem a esforços significativos e investimentos em recursos no campo da medicina translacional1. Os produtos à base de células estão associados a riscos determinados pela fonte celular, pelo processo de fabricação (isolamento, expansão ou modificação genética) e pelos suplementos não celulares (enzimas, fatores de crescimento, suplementos de cultura e antibióticos), e esses fatores de risco dependem da indicação terapêutica específica. A qualidade, a segurança e a eficácia do produto final podem ser profundamente influenciadas pelos elementos acima indicados2. A terapia com células-tronco requer adesão aos princípios de biossegurança; os riscos potenciais de transmissão patogénica com produtos derivados de animais em cultura de células podem ser problemáticos, e o ensaio exaustivo de qualquer produto introduzido no fabrico é essencial3.
O método tradicional de isolamento de células-tronco derivadas de tecido adiposo humano (hASCs) envolve uma digestão enzimática realizada com colagenase seguida de etapas de lavagem por centrifugação4. Embora o isolamento enzimático seja geralmente considerado mais eficiente do que outras técnicas mecânicas em termos de rendimento celular e viabilidade, os componentes derivados de animais usados, como a colagenase, são considerados mais do que minimamente manipulados pela Food and Drug Administration dos EUA. Isso significa que há um risco significativamente aumentado de reações imunes ou transmissão da doença, limitando a tradução da terapia com hASC para ambientes clínicos 5,6.
A digestão à base de tripsina é outro protocolo enzimático para isolar ASCs. Diferentes técnicas foram descritas com pequenas modificações em termos de concentração de tripsina, velocidade de centrifugação e tempo de incubação. Infelizmente, esse método não é bem descrito, e existe uma falta de comparação na literatura, particularmente com os protocolos de isolamento mecânico7. No entanto, em termos de traduzibilidade da abordagem, a tripsina tem as mesmas desvantagens da colagenase.
Métodos alternativos de isolamento para obtenção de ASCs, baseados em forças mecânicas e sem adição enzimática, envolvem centrifugação em alta velocidade (800 x g ou 1.280 x g, 15 min) dos fragmentos de tecido adiposo. Em seguida, o pellet é incubado com um tampão de lise de hemácias (5 min), seguido de outra etapa de centrifugação a 600 x g antes da ressuspensão em meio de cultura. Apesar de um maior número de células ter sido isolado nos primeiros dias em comparação com os métodos de explante, um estudo prévio mostrou menor ou ausente proliferação após a segunda semana de cultura8.
Além disso, a manipulação adicional com meio adicionado xenogênico, como o soro fetal bovino (FBS), que é utilizado como suplemento de fator de crescimento para cultura celular, está associada a um risco aumentado de reatividade imunológica e exposição a infecções virais, bacterianas ou priônicas do paciente hospedeiro 9,10. Reações imunes e desenvolvimento de erupções cutâneas urticariformes já foram descritas em indivíduos que receberam várias doses de células-tronco mesenquimais produzidas com FBS11. Além disso, a FBS está sujeita à variabilidade lote a lote, o que pode ter impacto na qualidade do produto final12.
De acordo com as diretrizes de boas práticas de fabricação (BPF), a dissociação do tecido enzimático deve ser evitada e a FBS deve ser substituída por suplementos livres de xenogenes. Essas etapas, aliadas a protocolos mais confiáveis e reprodutíveis, são essenciais para subsidiar a aplicação da terapia celular 3,13.
Nesse contexto, o lisado plaquetário humano (hPL) tem sido sugerido como um substituto para a FBS, uma vez que é um suplemento livre de células, contendo proteínas e enriquecido com fator de crescimento, e foi introduzido anteriormente entre produtos à base de células de grau clínico como aditivo de meio de crescimento para cultura e expansão celular in vitro 14,15. Como o hPL é um produto derivado de humanos, é frequentemente utilizado como substituto da FBS durante a cultura in vitro de hASCs destinadas a aplicações clínicas, reduzindo assim os problemas relacionados às reações imunológicas e infecções relacionadas à traduzibilidade da FBS15,16.
Apesar dos custos de produção mais elevados, já foi demonstrado que, em comparação com a FBS, o hPL suporta a viabilidade celular para muitos tipos de células, aumenta a proliferação, retarda a senescência, garante a estabilidade genômica e conserva o imunofenótipo celular mesmo em passagens celulares tardias; todos esses elementos sustentam a mudança para esse suplemento cultural11.
O objetivo deste trabalho foi desenvolver um protocolo padronizado para isolar e cultivar hASCs com um método completo livre de animais, sem modificar a fisiologia celular e as propriedades da caule em comparação com as hASCs clássicas cultivadas em FBS (Figura 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>euroclone</td>
			<td>et5015b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD105</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD560839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD34</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD555821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD555482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD73</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD561254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer)</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument)</td>
			<td>BD accuri</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burker chamber</td>
			<td>Blaubrand</td>
			<td>717810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell freezing container</td>
			<td>corning</td>
			<td>CLS432002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell Freezing container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS432002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>clearline</td>
			<td>390701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposabile blade scalpel</td>
			<td>paragon</td>
			<td>bs 2982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Platelet Lysate FD (GMP grade)</td>
			<td>Stemulate</td>
			<td>PL-NH-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite F50 spectrophotometer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 10 cm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scalpels</td>
			<td>Reda</td>
			<td>07104-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissors</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>4071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tweezers</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>1152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging bucket centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3-16K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flasks</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>6910170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLe (animal free trypsin substitute)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12604-013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of human adipose-derived stem cells with an innovative xenogeneic-free method for human therapy

Considerando o crescente impacto da terapia com células-tronco, preocupações de biossegurança têm sido levantadas em relação à potencial contaminação ou transmissão de infecção devido à introdução de produtos derivados de animais durante a manipulação in vitro . Os componentes xenogênicos, como colagenase ou soro fetal bovino, comumente usados durante as etapas de isolamento e expansão celular podem estar associados aos riscos potenciais de reatividade imunológica ou infecção viral, bacteriana e príon nos pacientes receptores. Seguindo as diretrizes de boas práticas de fabricação, a dissociação química do tecido deve ser evitada, enquanto o soro fetal bovino (FBS) pode ser substituído por suplementos livres de xenogenes. Além disso, para garantir a segurança dos produtos celulares, é importante a definição de métodos mais fiáveis e reprodutíveis. Desenvolvemos um método inovador, completamente livre de xenogenes, para o isolamento e expansão in vitro de células-tronco derivadas de tecido adiposo humano sem alterar suas propriedades em comparação com os protocolos padrão cultivados com colagenase FBS. Aqui, células-tronco derivadas de tecido adiposo humano (hASCs) foram isoladas do tecido adiposo abdominal. A amostra foi picada mecanicamente com tesoura/bisturi, microdissecada e dispersa mecanicamente em placa de Petri de 10 cm e preparada com incisões de bisturi para facilitar a fixação dos fragmentos de tecido e a migração de hASCs. Seguindo as etapas de lavagem, os hASCs foram selecionados devido à sua aderência plástica sem digestão enzimática. Os hASCs isolados foram cultivados com meio suplementado com lisado plaquetário humano livre de heparina a 5% e destacados com um substituto de tripsina livre de animais. Seguindo as instruções das boas práticas de fabrico (BPF) sobre a produção de produtos celulares destinados à terapia humana, não foram utilizados antibióticos em nenhum meio de cultura.

Aplicando o método de isolamento detalhado acima, os hASCs foram obtidos com sucesso a partir de amostras de tecido adiposo abdominal sem o uso de colagenase. Além disso, os hASCs foram expandidos em condições livres de xenogenea, na presença de hPL e sem quaisquer outros componentes de origem animal. Os resultados a seguir corroboram o protocolo e são obtidos a partir de hASCs cultivadas em paralelo com hPL e com FBS como condição controle.
Após o aparecimento inicial do cluster, os ...

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Isolation and Culture of Human Adipose-Derived Stem Cells With an Innovative Xenogeneic-Free Method for Human Therapy

Os produtos xenogênicos (químicos ou derivados de animais) introduzidos nas etapas de preparação/manipulação da terapia celular estão associados a um risco aumentado de reatividade imunológica e transmissão patogênica em pacientes hospedeiros. Aqui, um método completo livre de xenogênicos para o isolamento e expansão in vitro de células-tronco derivadas de tecido adiposo humano é descrito.

Isolamento e cultura de células-tronco derivadas de tecido adiposo humano com um método inovador livre de xenogênicos para terapia humana

Considering the increasing impact of stem cell therapy, biosafety concerns have been raised regarding potential contamination or infection transmission ...

Nosso método livre de exogenia para isolamento e expansão in vitro de células-tronco derivadas de tecido adiposo humano é a resposta para as preocupações de biossegurança em torno da terapia celular quando é considerada para aplicação translacional. Nossos métodos de isolamento e expansão são simples de replicar, rápidos e com poucos requisitos técnicos, tornando-os úteis para todos. Investigamos a estratégia terapêutica baseada em células-tronco adiposas humanas para o reparo de nervos periféricos.No entanto, nossa técnica pode ser amplamente aplicada quando novas células-tronco adiposas são necessárias em diferentes configurações de pesquisa clínica. Mantivemos a simplicidade para conservar uma produtibilidade mais fácil. A esterilidade deve ser cuidadosamente observada desde a sala de cirurgia até a cultura celular.Para a manipulação de amostras e fragmentos, a microdissecção está em risco de contaminação. Após a obtenção da amostra de tecido adiposo da cirurgia plástica abdominal, utilizando tesoura estéril, corte-a em pedaços de aproximadamente um centímetro quadrado. Com um bisturi, micro disseque cada peça em fragmentos menores e disperse cinco fragmentos em uma placa de Petri de 10 centímetros.Para fixação de fragmentos, use um bisturi para criar incisões na superfície de plástico e arraste cada fragmento. Suavemente, adicione 10 mililitros de meio de cultura completo para cobrir todos os fragmentos sem separá-los e incubar a placa de Petri a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Monitore a expansão da célula-tronco derivada do tecido adiposo humano, ou HASC, diariamente sob um microscópio óptico até que as células se tornem confluentes.Substitua o meio por um meio fresco e completo a cada 72 horas para remover os detritos celulares e deixá-los crescer até a primeira passagem. Quando a cultura HASC atingir 70 a 80% de confluência, remova e descarte todos os pedaços de tecido usando pinças estéreis. Além disso, descarte o meio exausto evitando o desprendimento do HASC da placa de Petri.Lave cuidadosamente as células com 10 mililitros de PBS. Depois de remover o PBS, adicione um mililitro de tripsina livre de animais e incube a 37 graus Celsius por cinco minutos. Verifique se há descolamento celular sob um microscópio óptico e incube por mais dois minutos, se necessário.Para apoiar o descolamento da célula, toque suavemente na superfície do plástico. Pare a ação da tripsina adicionando dois mililitros de meio completo e colete todas as células em um tubo de 15 mililitros. Remova a tripsina restante por centrifugação.Após a eliminação do sobrenadante, suspender as células em meio completo de cinco mililitros e transferir a suspensão celular para um novo balão T25. Para a preservação criogênica, conte uma alíquota de células desanexadas usando o contador de células sob um microscópio óptico. Centrifugar as células a 300 G durante cinco minutos.Depois de descartar o sobrenadante, suspender as células na mistura de congelamento a uma densidade de uma vez 10 até a sexta célula por mililitro e transferir um mililitro da suspensão celular para um frasco para injetáveis de crio. Coloque os frascos de crio a menos 80 graus Celsius em um recipiente de congelamento que diminua a temperatura em um grau Celsius por minuto e, em seguida, mova os frascos de crio para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo. Na aparência inicial do cluster, os HASCs apresentaram uma forma clássica de fuso e foram menores, bem como mais alongados em comparação com as células de controle na presença de FBS.O imunofenótipo celular pareceu ser semelhante entre os HASCs cultivados com os dois suplementos. Mais de 80 a 90% dos HASCs foram positivos para CD73 e CD105 e menos de 5% expressos para CD34 e CD45. Finalmente, o ensaio de proliferação revelou um aumento significativo no crescimento celular quando o lisado plaquetário humano foi adicionado ao meio em comparação com o controle FBS.O passo mais importante é a microdissecção de fragmentos adiposos e sua fixação com incisão de bisturi em placa de Petri. Uma população de células-tronco derivadas de tecido adiposo humano pronta para uso é obtida em relação aos critérios de biossegurança GMP, mantendo as propriedades celulares terapêuticas e aumentando a proliferação celular.

Research

JoVE Journal

Medicine

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

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Transplante de Células-tronco em um In vitro Modelo de isquemia / reperfusão Simulated

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Medicina

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Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Cultura de Células e Isolamento paciente Derivado de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Células-tronco de câncer putativos Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Isolamento, cultura, e imagem de Fetal Humano pancreáticas grupos de células

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Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolamento, criopreservação e cultivo de células epiteliais humanas Amnion para aplicações clínicas

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

Tridimensional Cultura alginato-talão de células humanas adenoma pituitário

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