Name: isolation and culture of human adipose-derived stem cells with an innovative xenogeneic-free method for human therapy
Uploaded: 2023-02-03T14:50:00
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Los autores no tienen reconocimientos.

Las hASC se aislaron del tejido adiposo abdominal de una mujer sana que se sometió a una reconstrucción mamaria utilizando colgajos autólogos abdominales (colgajos perforantes epigástricos inferiores profundos, [DIEP]) en el Hospital Universitario de Lausana, CHUV, Lausana, Suiza. La parte desechada del colgajo y el tejido adiposo se obtuvieron después de que el paciente firmó el consentimiento informado. Todos los protocolos fueron revisados y aprobados por el Departamento de Biobanco DAL del hospital (número 314...

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	<li>Naderi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regenerative+role+of+adipose-derived+stem+cells+(ADSC)+in+plastic+and+reconstructive+surgery.">The regenerative role of adipose-derived stem cells (ADSC) in plastic and reconstructive surgery.</a> International Wound Journal. 14 (1), 112-124 (2017).</li><li>Guiotto, M., Riehle, M. O., Raffoul, W., Hart, A., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+human+platelet+lysate+(hPL)+the+ideal+candidate+to+substitute+the+foetal+bovine+serum+for+cell-therapy+translational+research.">Is human platelet lysate (hPL) the ideal candidate to substitute the foetal bovine serum for cell-therapy translational research.</a> Journal of Translational Medicine. 19 (1), 426 (2021).</li><li>Cond&#233;-Green, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shift+toward+mechanical+isolation+of+adipose-derived+stromal+vascular+fraction:+Review+of+upcoming+techniques.">Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: Review of upcoming techniques.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 4 (9), 1017 (2016).</li><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+Implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+adipose-derived+stem+cells+and+collagenase+in+fat+tissue+preparation.">Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation.</a> Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).</li><li>Spees, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalized+antigens+must+be+removed+to+prepare+hypoimmunogenic+mesenchymal+stem+cells+for+cell+and+gene+therapy.">Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy.</a> Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).</li><li>Fadel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+obtainment+and+isolation+of+two+mesenchymal+stem+cell+sources+in+sheep.">Protocols for obtainment and isolation of two mesenchymal stem cell sources in sheep.</a> Acta Cirurgica Brasileria. 26 (4), 267-273 (2011).</li><li>Markarian, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adipose-derived+stem+cells:+A+comparison+among+different+methods.">Isolation of adipose-derived stem cells: A comparison among different methods.</a> Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).</li><li>Sherman, L. S., Cond&#233;-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-free+method+for+isolation+and+expansion+of+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells.">An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).</li><li>Lalu, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+cell+therapy+with+mesenchymal+stromal+cells+(SafeCell):+A+systematic+review+and+meta-analysis+of+clinical+trials.">Safety of cell therapy with mesenchymal stromal cells (SafeCell): A systematic review and meta-analysis of clinical trials.</a> PLoS One. 7 (10), 47559 (2012).</li><li>Escobar, C. H., Chaparro, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xeno-free+extraction,+culture,+and+cryopreservation+of+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells.">Xeno-free extraction, culture, and cryopreservation of human adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 5 (3), 358-365 (2016).</li><li>Vaidya, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet-C+irradiation+for+inactivation+of+viruses+in+foetal+bovine+serum.">Ultraviolet-C irradiation for inactivation of viruses in foetal bovine serum.</a> Vaccine. 36 (29), 4215-4221 (2018).</li><li>Kyll&#246;nen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+serum+conditions+on+osteogenic+differentiation+of+human+adipose+stem+cells+in+vitro.">Effects of different serum conditions on osteogenic differentiation of human adipose stem cells in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (1), 17 (2013).</li><li>Schallmoser, K., Henschler, R., Gabriel, C., Koh, M. B. C., Burnouf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+quality+requirements+of+human+platelet+lysate:+A+position+statement+from+the+Working+Party+on+Cellular+Therapies+of+the+International+Society+of+Blood+Transfusion.">Production and quality requirements of human platelet lysate: A position statement from the Working Party on Cellular Therapies of the International Society of Blood Transfusion.</a> Trends in Biotechnology. 38 (1), 13-23 (2020).</li><li>Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+to+substitute+fetal+bovine+serum+in+hMSC+expansion+for+translational+applications:+A+systematic+review.">Human platelet lysate to substitute fetal bovine serum in hMSC expansion for translational applications: A systematic review.</a> Journal of Translational Medicine. 18 (1), 351 (2020).</li><li>Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+acts+synergistically+with+laminin+to+improve+the+neurotrophic+effect+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+primary+neurons.">Human platelet lysate acts synergistically with laminin to improve the neurotrophic effect of human adipose-derived stem cells on primary neurons.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 658176 (2021).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Cowper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+as+a+functional+substitute+for+fetal+bovine+serum+in+the+culture+of+human+adipose+derived+stromal/stem+cells.">Human platelet lysate as a functional substitute for fetal bovine serum in the culture of human adipose derived stromal/stem cells.</a> Cells. 8 (7), 724 (2019).</li><li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+the+treatment+and+prevention+of+graft-versus-host+disease:+Experiments+and+practice.">Mesenchymal stem cells for the treatment and prevention of graft-versus-host disease: Experiments and practice.</a> Annals of Hematology. 92 (10), 1295-1308 (2013).</li><li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+metal+micro+and+nano-particles+on+hASCs:+An+in+vitro+model.">Effects of metal micro and nano-particles on hASCs: An in vitro model.</a> Nanomaterials. 7 (8), 212 (2017).</li><li>Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stromal+vascular+fraction+cells:+Update+on+clinical+utility+and+efficacy.">Adipose-derived stromal vascular fraction cells: Update on clinical utility and efficacy.</a> Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).</li><li>Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+medium+composition+and+translational+adult+bone+marrow-derived+stem+cell+research.">Cell culture medium composition and translational adult bone marrow-derived stem cell research.</a> Stem Cells. 24 (5), 1409-1410 (2006).</li><li>Perez-Ilzarbe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+ex+vivo+expansion+culture+conditions+of+mesenchymal+stem+cells+for+human+cell+therapy.">Comparison of ex vivo expansion culture conditions of mesenchymal stem cells for human cell therapy.</a> Transfusion. 49 (9), 1901-1910 (2009).</li><li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+cell-detaching+methods+on+the+viability+and+cell+surface+antigen+expression+of+synovial+mesenchymal+stem+cells.">Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li><li>Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-enzymatic+method+for+isolating+human+adipose+tissue-derived+stromal+stem+cells.">A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells.</a> Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).</li><li>Becherucci, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+in+mesenchymal+stromal+cell+expansion+according+to+a+GMP+grade+protocol:+A+cell+factory+experience.">Human platelet lysate in mesenchymal stromal cell expansion according to a GMP grade protocol: A cell factory experience.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 124 (2018).</li><li>Blande, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+mesenchymal+stem+cell+expansion+in+animal+serum-free+medium+supplemented+with+autologous+human+platelet+lysate.">Adipose tissue mesenchymal stem cell expansion in animal serum-free medium supplemented with autologous human platelet lysate.</a> Transfusion. 49 (12), 2680-2685 (2009).</li><li>Castegnaro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+platelet+lysate+on+the+functional+and+molecular+characteristics+of+mesenchymal+stem+cells+isolated+from+adipose+tissue.">Effect of platelet lysate on the functional and molecular characteristics of mesenchymal stem cells isolated from adipose tissue.</a> Current Stem Cell Research &amp; Therapy. 6 (2), 105-114 (2011).</li><li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+review+and+meta-analysis+on+the+use+of+human+platelet+lysate+for+mesenchymal+stem+cell+cultures:+Comparison+with+fetal+bovine+serum+and+considerations+on+the+production+protocol.">Systematic review and meta-analysis on the use of human platelet lysate for mesenchymal stem cell cultures: Comparison with fetal bovine serum and considerations on the production protocol.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 13 (1), 142 (2022).</li><li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+as+a+potential+clinical-translatable+supplement+to+support+the+neurotrophic+properties+of+human+adipose-derived+stem+cells.">Human platelet lysate as a potential clinical-translatable supplement to support the neurotrophic properties of human adipose-derived stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (1), 432 (2020).</li><li>Kr&#228;henb&#252;hl, S. M., Grognuz, A., Michetti, M., Raffoul, W., Applegate, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+human+adipose-derived+stem+cell+expansion+and+stability+for+clinical+use.">Enhancement of human adipose-derived stem cell expansion and stability for clinical use.</a> International Journal of Stem Cell Research &amp; Therapy. 2 (1), 007 (2015).</li></ol>

Las células madre derivadas de tejido adiposo han atraído el interés de la investigación traslacional en la última década debido a su abundancia, métodos de aislamiento rápidos y asequibles, alta tasa de proliferación in vitro/in vivo y propiedades de tallo/diferenciación18,19,20. Como resultado, las hASCs son consideradas un excelente candidato para estrategias basadas en células en medicina regener...

En las últimas décadas, la creciente demanda de tratamientos terapéuticos innovadores ha dado lugar a importantes esfuerzos e inversión de recursos en el campo de la medicina traslacional1. Los productos basados en células están asociados con riesgos determinados por la fuente celular, el proceso de fabricación (aislamiento, expansión o modificación genética) y los suplementos no celulares (enzimas, factores de crecimiento, suplementos de cultivo y antibióticos), y estos factores de riesgo dependen de la indicación terapéutica específica. La calidad, seguridad y eficacia del producto final podrían verse profundamente influenciadas por los elementos indicados anteriormente2. La terapia con células madre requiere la adhesión a los principios de bioseguridad; Los riesgos potenciales de transmisión patógena con productos derivados de animales en cultivo celular podrían ser problemáticos, y la prueba exhaustiva de cualquier producto introducido en la fabricación es esencial3.
El método tradicional para aislar células madre derivadas de tejido adiposo humano (hASCs) implica una digestión enzimática realizada con colagenasa seguida de pasos de lavado a través de centrifugación4. Si bien el aislamiento enzimático generalmente se considera más eficiente que otras técnicas mecánicas en términos de rendimiento celular y viabilidad, los componentes derivados de animales utilizados, como la colagenasa, se consideran más que mínimamente manipulados por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos. Esto significa que existe un riesgo significativamente mayor de reacciones inmunes o transmisión de enfermedades, lo que limita la traducción de la terapia con hASC a entornos clínicos 5,6.
La digestión basada en tripsina es otro protocolo enzimático para aislar las ASC. Se han descrito diferentes técnicas con ligeras modificaciones en cuanto a la concentración de tripsina, velocidad de centrifugación y tiempo de incubación. Desafortunadamente, este método no está bien descrito, y existe una falta de comparación en la literatura, particularmente con los protocolos de aislamiento mecánico7. Sin embargo, en términos de la traducibilidad del enfoque, la tripsina tiene los mismos inconvenientes de la colagenasa.
Los métodos alternativos de aislamiento para obtener ASC, basados en fuerzas mecánicas y sin adición de enzimas, implican la centrifugación a alta velocidad (800 x g o 1.280 x g, 15 min) de los fragmentos de tejido adiposo. A continuación, el pellet se incuba con un tampón de lisis de glóbulos rojos (5 min), seguido de otro paso de centrifugación a 600 x g antes de la resuspensión en medio de cultivo. A pesar de un mayor número de células aisladas en los primeros días en comparación con los métodos de explante, un estudio previo mostró menor o ausencia de proliferación más allá de la segunda semana de cultivo8.
Además de eso, la manipulación adicional con medio xenogénico agregado, como el suero bovino fetal (FBS), que se utiliza como un suplemento de factor de crecimiento para cultivo celular, se asocia con un mayor riesgo de reactividad inmune y exposición a infecciones virales, bacterianas o priónicas del paciente huésped 9,10. Las reacciones inmunes y el desarrollo de erupción urticariforme ya se han descrito en individuos que reciben varias dosis de células madre mesenquimales producidas con FBS11. Además, FBS está sujeto a variabilidad de lote a lote, lo que puede tener un impacto en la calidad del producto final12.
De acuerdo con las directrices de buenas prácticas de fabricación (GMP), se debe evitar la disociación enzimática del tejido, y FBS debe sustituirse con suplementos libres de xenogénicos. Estos pasos, junto con protocolos más confiables y reproducibles, son esenciales para apoyar la aplicación de la terapia celular 3,13.
En este contexto, el lisado plaquetario humano (hPL) ha sido sugerido como un sustituto del FBS, ya que es un suplemento libre de células, que contiene proteínas, enriquecido con factor de crecimiento, y se introdujo anteriormente entre los productos basados en células de grado clínico como aditivo del medio de crecimiento para el cultivo y expansión celular in vitro 14,15. Como el hPL es un producto derivado del ser humano, se utiliza con frecuencia como sustituto del FBS durante el cultivo in vitro de hASCs destinadas a aplicaciones clínicas, reduciendo así los problemas relacionados con las reacciones inmunológicas y las infecciones relacionadas con la traducibilidad del FBS15,16.
A pesar de los mayores costos de producción, ya se ha demostrado que, en comparación con FBS, hPL apoya la viabilidad celular para muchos tipos de células, aumenta la proliferación, retrasa la senescencia, asegura la estabilidad genómica y conserva el inmunofenotipo celular incluso en pasajes celulares tardíos; Todos estos elementos apoyan el cambio hacia este suplemento cultural11.
El objetivo de este trabajo fue desarrollar un protocolo estandarizado para aislar y cultivar hASCs con un método completo libre de animales, sin modificar la fisiología celular y las propiedades del tallo en comparación con las hASCs clásicas cultivadas con FBS (Figura 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>euroclone</td>
			<td>et5015b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD105</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD560839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD34</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD555821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD555482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD73</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD561254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer)</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument)</td>
			<td>BD accuri</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burker chamber</td>
			<td>Blaubrand</td>
			<td>717810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell freezing container</td>
			<td>corning</td>
			<td>CLS432002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell Freezing container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS432002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>clearline</td>
			<td>390701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposabile blade scalpel</td>
			<td>paragon</td>
			<td>bs 2982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Platelet Lysate FD (GMP grade)</td>
			<td>Stemulate</td>
			<td>PL-NH-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite F50 spectrophotometer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 10 cm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scalpels</td>
			<td>Reda</td>
			<td>07104-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissors</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>4071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tweezers</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>1152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging bucket centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3-16K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flasks</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>6910170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLe (animal free trypsin substitute)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12604-013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of human adipose-derived stem cells with an innovative xenogeneic-free method for human therapy

Teniendo en cuenta el creciente impacto de la terapia con células madre, se han planteado preocupaciones de bioseguridad con respecto a la posible contaminación o transmisión de infecciones debido a la introducción de productos derivados de animales durante la manipulación in vitro . Los componentes xenogénicos, como la colagenasa o el suero bovino fetal, comúnmente utilizados durante los pasos de aislamiento y expansión celular podrían estar asociados con los riesgos potenciales de reactividad inmune o infección viral, bacteriana y priónica en los pacientes receptores. Siguiendo las pautas de buenas prácticas de fabricación, se debe evitar la disociación química del tejido, mientras que el suero bovino fetal (FBS) puede sustituirse con suplementos libres de xenogénicos. Además, para garantizar la seguridad de los productos celulares, es importante definir métodos más fiables y reproducibles. Hemos desarrollado un método innovador, completamente libre de xenogénicos, para el aislamiento y la expansión in vitro de células madre derivadas de tejido adiposo humano sin alterar sus propiedades en comparación con los protocolos estándar de cultivo FBS de colagenasa. Aquí, las células madre derivadas de tejido adiposo humano (hASCs) se aislaron del tejido adiposo abdominal. La muestra se picó mecánicamente con tijeras/bisturí, se microdisecó y se dispersó mecánicamente en una placa de Petri de 10 cm, y se preparó con incisiones de bisturí para facilitar la unión de los fragmentos de tejido y la migración de hASCs. Siguiendo los pasos de lavado, se seleccionaron hASCs debido a su adherencia plástica sin digestión enzimática. Las hASCs aisladas se cultivaron con medio suplementado con lisado plaquetario humano libre de heparina al 5% y se separaron con un sustituto de tripsina libre de animales. Siguiendo las instrucciones de buenas prácticas de fabricación (GMP) sobre la producción de productos celulares destinados a la terapia humana, no se utilizaron antibióticos en ningún medio de cultivo.

Aplicando el método de aislamiento detallado anteriormente, las hASCs se obtuvieron con éxito de muestras de tejido adiposo abdominal sin el uso de colagenasa. Además, las hASCs se expandieron en condiciones completamente libres de xenogénicas en presencia de hPL y sin ningún otro componente de origen animal. Los siguientes resultados apoyan el protocolo y se obtienen de hASCs cultivadas en paralelo con hPL y con FBS como condición de control.
Después de la aparición inicial del grupo,...

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Isolation and Culture of Human Adipose-Derived Stem Cells With an Innovative Xenogeneic-Free Method for Human Therapy

Los productos xenogénicos (químicos o derivados de animales) introducidos en los pasos de preparación/manipulación de la terapia celular se asocian con un mayor riesgo de reactividad inmune y transmisión patogénica en pacientes huéspedes. Aquí, se describe un método completo libre de xenogénicos para el aislamiento y la expansión in vitro de células madre derivadas de tejido adiposo humano.

Aislamiento y cultivo de células madre derivadas de tejido adiposo humano con un innovador método libre de xenogénicos para terapia humana

Considering the increasing impact of stem cell therapy, biosafety concerns have been raised regarding potential contamination or infection transmission ...

Nuestro método libre de exógenos para el aislamiento y la expansión in vitro de células madre derivadas de tejido adiposo humano es la respuesta a las preocupaciones de bioseguridad en torno a la terapia celular cuando se considera para su aplicación traslacional. Nuestros métodos de aislamiento y expansión son fáciles de replicar, rápidos y bajos en requisitos técnicos, lo que los hace útiles para todos. Investigamos la estrategia de terapia basada en células madre adiposas humanas para la reparación de nervios periféricos.Sin embargo, nuestra técnica se puede aplicar ampliamente cuando se necesitan nuevas células madre adiposas en diferentes configuraciones de investigación clínica. Lo mantuvimos simple para conservar una producibilidad más fácil. La esterilidad debe observarse cuidadosamente desde el quirófano hasta el cultivo celular.Para la manipulación de muestras y fragmentos, la microdisección corre el riesgo de contaminación. Después de obtener la muestra de tejido adiposo de la cirugía plástica abdominal, utilizando tijeras estériles, córtela en trozos de aproximadamente un centímetro cuadrado. Con un bisturí, micro diseccionar cada pieza en fragmentos más pequeños y dispersar cinco fragmentos en una placa de Petri de 10 centímetros.Para la fijación de fragmentos, use un bisturí para crear incisiones en la superficie plástica y arrastre cada fragmento. Suavemente, agregue 10 mililitros de medio de cultivo completo para cubrir todos los fragmentos sin separarlos e incube la placa de Petri a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Monitoree la expansión diaria de la célula madre derivada de tejido adiposo humano, o HASC, bajo un microscopio óptico hasta que las células se vuelvan confluentes.Reemplace el medio con un medio completo fresco cada 72 horas para eliminar los restos celulares y déjelos crecer hasta el primer paso. Una vez que el cultivo HASC alcance el 70 al 80% de confluencia, retire y deseche todas las piezas de tejido con pinzas estériles. Además, deseche el medio agotado evitando el desprendimiento del HASC de la placa de Petri.Lave cuidadosamente las células con 10 mililitros de PBS. Después de eliminar PBS, agregue un mililitro de tripsina libre de animales e incube a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Verifique si hay desprendimiento de células bajo un microscopio óptico e incube durante dos minutos más, si es necesario.Para soportar el desprendimiento celular, golpee suavemente la superficie de plástico. Detenga la acción de la tripsina agregando dos mililitros de medio completo y recoja todas las células en un tubo de 15 mililitros. Eliminar la tripsina restante por centrifugación.Después de desechar el sobrenadante, suspender las células en cinco mililitros de medio completo y transferir la suspensión celular a un nuevo matraz T25. Para la criopreservación, cuente una alícuota de células separadas separadas utilizando el contador de células bajo un microscopio óptico. Centrifugar las células a 300 G durante cinco minutos.Después de desechar el sobrenadante, suspenda las células en la mezcla de congelación a una densidad de una vez de 10 a la sexta células por mililitro y transfiera un mililitro de la suspensión celular a un vial criogénico. Coloque los viales criogénicos a menos 80 grados centígrados en un recipiente de congelación que disminuya la temperatura en un grado centígrado por minuto y luego mueva los viales criogénicos a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo. En la apariencia inicial del racimo, las HSC mostraron una forma clásica de husillo y eran más pequeñas, así como más alargadas en comparación con las células de control en presencia de FBS.El inmunofenotipo celular pareció ser similar entre las HASC cultivadas con los dos suplementos. Más del 80 al 90% de las HASC fueron positivas para CD73 y CD105 y menos del 5% se expresaron para CD34 y CD45. Finalmente, el ensayo de proliferación reveló un aumento significativo en el crecimiento celular cuando se agregó lisado de plaquetas humanas al medio en comparación con el control FBS.El paso más importante es la microdisección de fragmentos adiposos y su fijación con incisión de bisturí en placa de Petri. Se obtiene una población de células madre derivadas de tejido adiposo humano listo para usar con respecto a los criterios de bioseguridad GMP, manteniendo las propiedades celulares terapéuticas y mejorando la proliferación celular.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Investigación

Medicina

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