Name: isolation and culture of human adipose-derived stem cells with an innovative xenogeneic-free method for human therapy
Uploaded: 2023-02-03T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Human Adipose-Derived Stem Cells With an Innovative Xenogeneic-Free Method for Human Therapy at JoVE.com

Författarna har inga erkännanden.

hASC isolerades från bukfettvävnaden hos en frisk kvinna som genomgick bröstrekonstruktion med hjälp av autologa flikar i buken (djupa underlägsna epigastriska perforatorflikar, [DIEP]) vid universitetssjukhuset i Lausanne, CHUV, Lausanne, Schweiz. Den kasserade delen av klaffen och fettvävnaden erhölls efter att patienten undertecknat informerat samtycke. Alla protokoll granskades och godkändes av sjukhusets biobanksavdelning DAL (nummer 314 GGC) och etiska kommittéer i enlighet med Helsingforsdeklarationen.</p...

<ol>
	<li>Naderi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regenerative+role+of+adipose-derived+stem+cells+(ADSC)+in+plastic+and+reconstructive+surgery.">The regenerative role of adipose-derived stem cells (ADSC) in plastic and reconstructive surgery.</a> International Wound Journal. 14 (1), 112-124 (2017).</li><li>Guiotto, M., Riehle, M. O., Raffoul, W., Hart, A., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+human+platelet+lysate+(hPL)+the+ideal+candidate+to+substitute+the+foetal+bovine+serum+for+cell-therapy+translational+research.">Is human platelet lysate (hPL) the ideal candidate to substitute the foetal bovine serum for cell-therapy translational research.</a> Journal of Translational Medicine. 19 (1), 426 (2021).</li><li>Cond&#233;-Green, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shift+toward+mechanical+isolation+of+adipose-derived+stromal+vascular+fraction:+Review+of+upcoming+techniques.">Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: Review of upcoming techniques.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 4 (9), 1017 (2016).</li><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+Implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+adipose-derived+stem+cells+and+collagenase+in+fat+tissue+preparation.">Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation.</a> Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).</li><li>Spees, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalized+antigens+must+be+removed+to+prepare+hypoimmunogenic+mesenchymal+stem+cells+for+cell+and+gene+therapy.">Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy.</a> Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).</li><li>Fadel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+obtainment+and+isolation+of+two+mesenchymal+stem+cell+sources+in+sheep.">Protocols for obtainment and isolation of two mesenchymal stem cell sources in sheep.</a> Acta Cirurgica Brasileria. 26 (4), 267-273 (2011).</li><li>Markarian, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adipose-derived+stem+cells:+A+comparison+among+different+methods.">Isolation of adipose-derived stem cells: A comparison among different methods.</a> Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).</li><li>Sherman, L. S., Cond&#233;-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-free+method+for+isolation+and+expansion+of+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells.">An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).</li><li>Lalu, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+cell+therapy+with+mesenchymal+stromal+cells+(SafeCell):+A+systematic+review+and+meta-analysis+of+clinical+trials.">Safety of cell therapy with mesenchymal stromal cells (SafeCell): A systematic review and meta-analysis of clinical trials.</a> PLoS One. 7 (10), 47559 (2012).</li><li>Escobar, C. H., Chaparro, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xeno-free+extraction,+culture,+and+cryopreservation+of+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells.">Xeno-free extraction, culture, and cryopreservation of human adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 5 (3), 358-365 (2016).</li><li>Vaidya, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet-C+irradiation+for+inactivation+of+viruses+in+foetal+bovine+serum.">Ultraviolet-C irradiation for inactivation of viruses in foetal bovine serum.</a> Vaccine. 36 (29), 4215-4221 (2018).</li><li>Kyll&#246;nen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+serum+conditions+on+osteogenic+differentiation+of+human+adipose+stem+cells+in+vitro.">Effects of different serum conditions on osteogenic differentiation of human adipose stem cells in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (1), 17 (2013).</li><li>Schallmoser, K., Henschler, R., Gabriel, C., Koh, M. B. C., Burnouf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+quality+requirements+of+human+platelet+lysate:+A+position+statement+from+the+Working+Party+on+Cellular+Therapies+of+the+International+Society+of+Blood+Transfusion.">Production and quality requirements of human platelet lysate: A position statement from the Working Party on Cellular Therapies of the International Society of Blood Transfusion.</a> Trends in Biotechnology. 38 (1), 13-23 (2020).</li><li>Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+to+substitute+fetal+bovine+serum+in+hMSC+expansion+for+translational+applications:+A+systematic+review.">Human platelet lysate to substitute fetal bovine serum in hMSC expansion for translational applications: A systematic review.</a> Journal of Translational Medicine. 18 (1), 351 (2020).</li><li>Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+acts+synergistically+with+laminin+to+improve+the+neurotrophic+effect+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+primary+neurons.">Human platelet lysate acts synergistically with laminin to improve the neurotrophic effect of human adipose-derived stem cells on primary neurons.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 658176 (2021).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Cowper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+as+a+functional+substitute+for+fetal+bovine+serum+in+the+culture+of+human+adipose+derived+stromal/stem+cells.">Human platelet lysate as a functional substitute for fetal bovine serum in the culture of human adipose derived stromal/stem cells.</a> Cells. 8 (7), 724 (2019).</li><li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+the+treatment+and+prevention+of+graft-versus-host+disease:+Experiments+and+practice.">Mesenchymal stem cells for the treatment and prevention of graft-versus-host disease: Experiments and practice.</a> Annals of Hematology. 92 (10), 1295-1308 (2013).</li><li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+metal+micro+and+nano-particles+on+hASCs:+An+in+vitro+model.">Effects of metal micro and nano-particles on hASCs: An in vitro model.</a> Nanomaterials. 7 (8), 212 (2017).</li><li>Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stromal+vascular+fraction+cells:+Update+on+clinical+utility+and+efficacy.">Adipose-derived stromal vascular fraction cells: Update on clinical utility and efficacy.</a> Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).</li><li>Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+medium+composition+and+translational+adult+bone+marrow-derived+stem+cell+research.">Cell culture medium composition and translational adult bone marrow-derived stem cell research.</a> Stem Cells. 24 (5), 1409-1410 (2006).</li><li>Perez-Ilzarbe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+ex+vivo+expansion+culture+conditions+of+mesenchymal+stem+cells+for+human+cell+therapy.">Comparison of ex vivo expansion culture conditions of mesenchymal stem cells for human cell therapy.</a> Transfusion. 49 (9), 1901-1910 (2009).</li><li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+cell-detaching+methods+on+the+viability+and+cell+surface+antigen+expression+of+synovial+mesenchymal+stem+cells.">Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li><li>Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-enzymatic+method+for+isolating+human+adipose+tissue-derived+stromal+stem+cells.">A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells.</a> Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).</li><li>Becherucci, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+in+mesenchymal+stromal+cell+expansion+according+to+a+GMP+grade+protocol:+A+cell+factory+experience.">Human platelet lysate in mesenchymal stromal cell expansion according to a GMP grade protocol: A cell factory experience.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 124 (2018).</li><li>Blande, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+mesenchymal+stem+cell+expansion+in+animal+serum-free+medium+supplemented+with+autologous+human+platelet+lysate.">Adipose tissue mesenchymal stem cell expansion in animal serum-free medium supplemented with autologous human platelet lysate.</a> Transfusion. 49 (12), 2680-2685 (2009).</li><li>Castegnaro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+platelet+lysate+on+the+functional+and+molecular+characteristics+of+mesenchymal+stem+cells+isolated+from+adipose+tissue.">Effect of platelet lysate on the functional and molecular characteristics of mesenchymal stem cells isolated from adipose tissue.</a> Current Stem Cell Research &amp; Therapy. 6 (2), 105-114 (2011).</li><li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+review+and+meta-analysis+on+the+use+of+human+platelet+lysate+for+mesenchymal+stem+cell+cultures:+Comparison+with+fetal+bovine+serum+and+considerations+on+the+production+protocol.">Systematic review and meta-analysis on the use of human platelet lysate for mesenchymal stem cell cultures: Comparison with fetal bovine serum and considerations on the production protocol.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 13 (1), 142 (2022).</li><li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+as+a+potential+clinical-translatable+supplement+to+support+the+neurotrophic+properties+of+human+adipose-derived+stem+cells.">Human platelet lysate as a potential clinical-translatable supplement to support the neurotrophic properties of human adipose-derived stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (1), 432 (2020).</li><li>Kr&#228;henb&#252;hl, S. M., Grognuz, A., Michetti, M., Raffoul, W., Applegate, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+human+adipose-derived+stem+cell+expansion+and+stability+for+clinical+use.">Enhancement of human adipose-derived stem cell expansion and stability for clinical use.</a> International Journal of Stem Cell Research &amp; Therapy. 2 (1), 007 (2015).</li></ol>

Fettbaserade stamceller har väckt intresse för translationell forskning under det senaste decenniet på grund av deras överflöd, snabba och prisvärda isoleringsmetoder, hög in vitro / in vivo proliferationshastighet och stamhet / differentieringsegenskaper18,19,20. Som ett resultat anses hASC vara en utmärkt kandidat för cellbaserade strategier inom regenerativ medicin21. Efter i...

Under de senaste decennierna har den ökande efterfrågan på innovativa terapeutiska behandlingar gett upphov till betydande insatser och resursinvesteringar inom det translationella medicinområdet1. Cellbaserade produkter är förknippade med risker som bestäms av cellkällan, tillverkningsprocessen (isolering, expansion eller genetisk modifiering) och de icke-cellulära tillskotten (enzymer, tillväxtfaktorer, odlingstillskott och antibiotika), och dessa riskfaktorer beror på den specifika terapeutiska indikationen. Slutproduktens kvalitet, säkerhet och effektivitet kan påverkas starkt av ovanstående element2. Stamcellsterapi kräver att biosäkerhetsprinciper följs; De potentiella riskerna för patogen överföring med produkter av animaliskt ursprung i cellodlingar kan vara problematiska, och det är viktigt att noggrant testa alla produkter som införs vid tillverkningen3.
Den traditionella metoden att isolera humana fettstamceller (hSAC) innebär en enzymatisk nedbrytning som utförs med kollagenas följt av tvättsteg genom centrifugering4. Medan enzymatisk isolering i allmänhet anses vara effektivare än andra mekaniska tekniker när det gäller cellutbyten och livskraft, anses de animaliska härledda komponenterna som används, såsom kollagenas, mer än minimalt manipulerade av US Food and Drug Administration. Detta innebär att det finns en signifikant ökad risk för immunreaktioner eller sjukdomsöverföring, vilket begränsar översättningen av hASC-behandling till kliniska miljöer 5,6.
Trypsinbaserad matsmältning är ett annat enzymatiskt protokoll för att isolera ASC. Olika tekniker har beskrivits med små modifieringar när det gäller trypsinkoncentration, centrifugeringshastighet och inkubationstid. Tyvärr är denna metod inte väl beskriven, och en brist på jämförelse finns i litteraturen, särskilt med de mekaniska isoleringsprotokollen7. Men när det gäller översättbarheten av tillvägagångssättet har trypsin samma nackdelar med kollagenas.
Alternativa isoleringsmetoder för att erhålla ASC, baserade på mekaniska krafter och utan enzymtillsats, innefattar höghastighetscentrifugering (800 x g eller 1 280 x g, 15 min) av fettvävnadsfragmenten. Därefter inkuberas pelleten med en röd blodkroppslysbuffert (5 min), följt av ytterligare ett centrifugeringssteg vid 600 x g före resuspension i odlingsmedium. Trots att ett större antal celler isolerades under de första dagarna jämfört med explanteringsmetoderna, visade en tidigare studie lägre eller frånvarande proliferation bortom den andra odlingsveckan8.
Dessutom är ytterligare manipulation med xenogent tillsatt medium, såsom fetalt bovint serum (FBS), som används som ett tillväxtfaktortillskott för cellodling, förknippat med en ökad risk för immunreaktivitet och exponering för virus-, bakterie- eller prioninfektioner hos värdpatienten 9,10. Immunreaktioner och utveckling av urtikariforma utslag har redan beskrivits hos individer som fått flera doser mesenkymala stamceller producerade med FBS11. Dessutom utsätts FBS för batch-till-batch-variabilitet, vilket kan påverka slutproduktens kvalitet12.
I enlighet med riktlinjerna för god tillverkningssed (GMP) bör enzymatisk vävnadsdissociation undvikas och FBS bör ersättas med xenogenfria kosttillskott. Dessa steg, tillsammans med mer tillförlitliga och reproducerbara protokoll, är avgörande för att stödja tillämpningen av cellterapi 3,13.
I detta sammanhang har humant trombocytlysat (hPL) föreslagits som ett substitut för FBS eftersom det är ett cellfritt, proteininnehållande, tillväxtfaktorberikat tillskott, och det introducerades tidigare bland cellbaserade produkter av klinisk kvalitet som tillsats till tillväxtmedium för in vitro-cellodling och expansion14,15. Eftersom hPL är en produkt av mänskligt ursprung används den ofta som ersättning för FBS under in vitro-odling av hASC avsedda för kliniska tillämpningar, vilket minskar problem med immunologiska reaktioner och infektioner relaterade till FBS-översättbarhet15,16.
Trots de högre produktionskostnaderna har det redan visats att jämfört med FBS stöder hPL cellviabilitet för många celltyper, ökar proliferationen, fördröjer åldrandet, säkerställer genomisk stabilitet och bevarar den cellulära immunofenotypen även i sena cellpassager; Alla dessa element stöder övergången till detta kulturtillägg11.
Syftet med detta arbete var att utveckla ett standardiserat protokoll för att isolera och odla hASC med en komplett djurfri metod, utan att modifiera cellfysiologin och stamhetsegenskaperna i jämförelse med klassiska FBS-odlade hASC (Figur 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>euroclone</td>
			<td>et5015b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD105</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD560839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD34</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD555821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD555482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD73</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD561254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer)</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument)</td>
			<td>BD accuri</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burker chamber</td>
			<td>Blaubrand</td>
			<td>717810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell freezing container</td>
			<td>corning</td>
			<td>CLS432002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell Freezing container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS432002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>clearline</td>
			<td>390701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposabile blade scalpel</td>
			<td>paragon</td>
			<td>bs 2982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Platelet Lysate FD (GMP grade)</td>
			<td>Stemulate</td>
			<td>PL-NH-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite F50 spectrophotometer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 10 cm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scalpels</td>
			<td>Reda</td>
			<td>07104-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissors</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>4071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tweezers</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>1152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging bucket centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3-16K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flasks</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>6910170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLe (animal free trypsin substitute)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12604-013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of human adipose-derived stem cells with an innovative xenogeneic-free method for human therapy

Med tanke på den ökande effekten av stamcellsterapi har biosäkerhetsproblem tagits upp när det gäller potentiell kontaminering eller infektionsöverföring på grund av införandet av animaliska produkter under in vitro-manipulation . De xenogena komponenterna, såsom kollagenas eller fetalt bovint serum, som vanligen används under cellisolerings- och expansionsstegen kan associeras med de potentiella riskerna för immunreaktivitet eller virus-, bakterie- och prioninfektion hos de mottagande patienterna. Enligt riktlinjer för god tillverkningssed bör kemisk vävnadsdissociation undvikas, medan fetalt bovint serum (FBS) kan ersättas med xenogenfria kosttillskott. För att garantera cellprodukternas säkerhet är det dessutom viktigt att fastställa mer tillförlitliga och reproducerbara metoder. Vi har utvecklat en innovativ, helt xenogenfri metod för isolering och in vitro-expansion av humana fett-härledda stamceller utan att ändra deras egenskaper jämfört med kollagenas FBS-odlade standardprotokoll. Här isolerades humana fett-härledda stamceller (hASCs) från bukfettvävnad. Provet maldes mekaniskt med sax/skalpell, mikrodissekerades och dispergerades mekaniskt i en 10 cm petriskål och bereddes med skalpellsnitt för att underlätta vidhäftningen av vävnadsfragmenten och migrationen av hASCs. Efter tvättstegen valdes hASC på grund av deras plastvidhäftning utan enzymatisk nedbrytning. De isolerade hASC odlades med medium kompletterat med 5% heparinfritt humant trombocytlysat och lossades med ett djurfritt trypsinsubstitut. I enlighet med god tillverkningssed (GMP) riktlinjer för produktion av cellprodukter avsedda för humanterapi användes inga antibiotika i något odlingsmedium.

Genom att tillämpa isoleringsmetoden som beskrivs ovan erhölls hASC framgångsrikt från bukfettvävnadsprover utan användning av kollagenas. Dessutom utvidgades hASC under fullständiga xenogena förhållanden i närvaro av hPL och utan några andra komponenter av animaliskt ursprung. Följande resultat stöder protokollet och erhålls från hASC odlade parallellt med hPL och med FBS som kontrollvillkor.
Efter det initiala klusterutseendet visade hASC den klassiska spindelliknande formen o...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Human Adipose-Derived Stem Cells With an Innovative Xenogeneic-Free Method for Human Therapy at JoVE.com

Isolation and Culture of Human Adipose-Derived Stem Cells With an Innovative Xenogeneic-Free Method for Human Therapy

Xenogena (kemiska eller animaliska produkter) som introduceras i cellterapins berednings-/manipuleringssteg är förknippade med en ökad risk för immunreaktivitet och patogen överföring hos värdpatienter. Här beskrivs en komplett xenogenfri metod för isolering och in vitro-expansion av humana fettderiverade stamceller.

Isolering och odling av humana fettbaserade stamceller med en innovativ xenogenfri metod för human terapi

Considering the increasing impact of stem cell therapy, biosafety concerns have been raised regarding potential contamination or infection transmission ...

Vår exogenfria metod för isolering och in vitro-expansion av humana fett-härledda stamceller är svaret på biosäkerhetsproblemen kring cellterapi när det övervägs för translationell tillämpning. Våra isolerings- och expansionsmetoder är enkla att replikera, snabba och låga tekniska krav, vilket gör dem användbara för alla. Vi undersöker humana fettstamcellsbaserade terapistrategier för reparation av perifera nerver.Vår teknik kan dock tillämpas i stor utsträckning när nya fettstamceller behövs i olika kliniska forskningsinställningar. Vi höll det enkelt för att spara enklare producerbarhet. Sterilitet bör observeras noggrant från operationssal till cellodling.För provmanipulation och fragment riskerar mikrodissektion kontaminering. Efter att ha erhållit fettvävnadsprovet från bukplastikkirurgi, skär det i bitar på cirka en kvadratcentimeter med steril sax. Med en skalpell dissekerar du varje bit i mindre fragment och sprider fem fragment i en 10 centimeter petriskål.För fragmentfästning, använd en skalpell för att skapa snitt på plastytan och dra varje fragment. Tillsätt försiktigt 10 ml komplett odlingsmedium för att täcka alla fragment utan att lossa dem och inkubera petriskålen vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. Övervaka den mänskliga fett-härledda stamcellen, eller HASC, expansion dagligen under ett optiskt mikroskop tills celler blir sammanflytande.Byt ut mediet mot ett nytt komplett medium var 72: e timme för att ta bort cellskräp och låt dem växa tills den första passagen. När HASC-kulturen når 70 till 80% sammanflöde, ta bort och kassera alla vävnadsbitar med steril pincett. Kassera också det uttömda mediet och undvik HASC: s lossning från petriskålen.Tvätta försiktigt cellerna med 10 ml PBS. Efter avlägsnande av PBS, tillsätt en milliliter djurfritt trypsin och inkubera vid 37 grader Celsius i fem minuter. Kontrollera om cellen lossnar under ett optiskt mikroskop och inkubera i ytterligare två minuter, om det behövs.För att stödja cellavlossningen, knacka försiktigt på plastytan. Stoppa trypsinverkan genom att tillsätta två milliliter komplett medium och samla alla celler i ett 15 ml rör. Ta bort det återstående trypsinet genom centrifugering.Efter kassering av supernatanten, suspendera cellerna i fem milliliter komplett medium och överför cellsuspensionen till en ny T25-kolv. För kryokonservering, räkna en alikvot av lossna fristående celler med hjälp av cellräknaren under ett optiskt mikroskop. Centrifugera cellerna vid 300 G i fem minuter.Efter kassering av supernatanten, suspendera cellerna i frysblandningen med en densitet av en gånger 10 till de sjätte cellerna per milliliter och överför en milliliter av cellsuspensionen till en kryoflaska. Sätt kryoflaskorna på minus 80 grader Celsius i en frysbehållare som sänker temperaturen med en grad Celsius per minut och flytta sedan kryoflaskorna till flytande kväve för långvarig lagring. I det ursprungliga klusterutseendet visade HASC: erna en klassisk spindelliknande form och var mindre, liksom mer långsträckta jämfört med kontrollcellerna i närvaro av FBS.Cellimmunofenotypen tycktes vara likartad mellan HASCs odlade med de två tillskotten. Mer än 80–90 % av HASC:erna var positiva för CD73 och CD105 och mindre än 5 % för CD34 och CD45. Slutligen avslöjade proliferationsanalysen en signifikant ökning av celltillväxt när humant trombocytlysat tillsattes till mediet jämfört med FBS-kontrollen.Det viktigaste steget är mikrodissektion av fettfragment och deras fastsättning med skalpellsnitt på petriskål. En stamcellspopulation som är färdig att använda från människa erhålls med avseende på GMP:s biosäkerhetskriterier, bibehåller terapeutiska cellegenskaper och förbättrar cellproliferationen.

Research

JoVE Journal

Medicine

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stamcellstransplantation i en In vitro Simulerad ischemi / Reperfusion Modell

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Isolering av kardiomyocetisk Kärnor från Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

Subretinal Injektion av genterapivektorer och stamceller i musen ögat

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolering, karakterisering och jämförande differentiering av mänskliga Dental celler Pulp Stem Härstammar från permanenta tänder med hjälp av två olika metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture och isolering av CD133<sup&gt; +</sup&gt; Förmodade Cancer stamceller från melanom

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Isolering, kultur, och avbildning av Human Fetal Pankreas cell kluster

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

Isolering av cancer stamceller från mänskliga Prostate Cancer Prov

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Anrikning för kemoterapiresistent Ovarian cancerstamceller från humana cellinjer

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolering, Frysförvaring och kultur för mänskliga amnion epitelceller för kliniska tillämpningar

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

Tredimensionell alginat-pärla Culture of Human hypofysadenom Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...