Name: isolation and culture of human adipose-derived stem cells with an innovative xenogeneic-free method for human therapy
Uploaded: 2023-02-03T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Human Adipose-Derived Stem Cells With an Innovative Xenogeneic-Free Method for Human Therapy at JoVE.com

Yazarların herhangi bir kabulü yoktur.

hASK'ler, Lozan Üniversitesi Hastanesi, CHUV, Lozan, İsviçre'de abdominal otolog flepler (derin inferior epigastrik perforatör flepler, [DIEP]) kullanılarak meme rekonstrüksiyonu yapılan sağlıklı bir kadının abdominal yağ dokusundan izole edildi. Flebin atılan kısmı ve yağ dokusu hasta bilgilendirilmiş onam imzaladıktan sonra elde edildi. Tüm protokoller, Helsinki Deklarasyonu'na uygun olarak hastanenin Biobank Departmanı DAL (sayı 314 GGC) ve etik komiteler tarafından gözden geçirilmiş ve onayl...

<ol>
	<li>Naderi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regenerative+role+of+adipose-derived+stem+cells+(ADSC)+in+plastic+and+reconstructive+surgery.">The regenerative role of adipose-derived stem cells (ADSC) in plastic and reconstructive surgery.</a> International Wound Journal. 14 (1), 112-124 (2017).</li><li>Guiotto, M., Riehle, M. O., Raffoul, W., Hart, A., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+human+platelet+lysate+(hPL)+the+ideal+candidate+to+substitute+the+foetal+bovine+serum+for+cell-therapy+translational+research.">Is human platelet lysate (hPL) the ideal candidate to substitute the foetal bovine serum for cell-therapy translational research.</a> Journal of Translational Medicine. 19 (1), 426 (2021).</li><li>Cond&#233;-Green, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shift+toward+mechanical+isolation+of+adipose-derived+stromal+vascular+fraction:+Review+of+upcoming+techniques.">Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: Review of upcoming techniques.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 4 (9), 1017 (2016).</li><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+Implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+adipose-derived+stem+cells+and+collagenase+in+fat+tissue+preparation.">Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation.</a> Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).</li><li>Spees, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalized+antigens+must+be+removed+to+prepare+hypoimmunogenic+mesenchymal+stem+cells+for+cell+and+gene+therapy.">Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy.</a> Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).</li><li>Fadel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+obtainment+and+isolation+of+two+mesenchymal+stem+cell+sources+in+sheep.">Protocols for obtainment and isolation of two mesenchymal stem cell sources in sheep.</a> Acta Cirurgica Brasileria. 26 (4), 267-273 (2011).</li><li>Markarian, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adipose-derived+stem+cells:+A+comparison+among+different+methods.">Isolation of adipose-derived stem cells: A comparison among different methods.</a> Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).</li><li>Sherman, L. S., Cond&#233;-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-free+method+for+isolation+and+expansion+of+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells.">An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).</li><li>Lalu, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+cell+therapy+with+mesenchymal+stromal+cells+(SafeCell):+A+systematic+review+and+meta-analysis+of+clinical+trials.">Safety of cell therapy with mesenchymal stromal cells (SafeCell): A systematic review and meta-analysis of clinical trials.</a> PLoS One. 7 (10), 47559 (2012).</li><li>Escobar, C. H., Chaparro, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xeno-free+extraction,+culture,+and+cryopreservation+of+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells.">Xeno-free extraction, culture, and cryopreservation of human adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 5 (3), 358-365 (2016).</li><li>Vaidya, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet-C+irradiation+for+inactivation+of+viruses+in+foetal+bovine+serum.">Ultraviolet-C irradiation for inactivation of viruses in foetal bovine serum.</a> Vaccine. 36 (29), 4215-4221 (2018).</li><li>Kyll&#246;nen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+serum+conditions+on+osteogenic+differentiation+of+human+adipose+stem+cells+in+vitro.">Effects of different serum conditions on osteogenic differentiation of human adipose stem cells in vitro.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (1), 17 (2013).</li><li>Schallmoser, K., Henschler, R., Gabriel, C., Koh, M. B. C., Burnouf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+quality+requirements+of+human+platelet+lysate:+A+position+statement+from+the+Working+Party+on+Cellular+Therapies+of+the+International+Society+of+Blood+Transfusion.">Production and quality requirements of human platelet lysate: A position statement from the Working Party on Cellular Therapies of the International Society of Blood Transfusion.</a> Trends in Biotechnology. 38 (1), 13-23 (2020).</li><li>Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+to+substitute+fetal+bovine+serum+in+hMSC+expansion+for+translational+applications:+A+systematic+review.">Human platelet lysate to substitute fetal bovine serum in hMSC expansion for translational applications: A systematic review.</a> Journal of Translational Medicine. 18 (1), 351 (2020).</li><li>Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+acts+synergistically+with+laminin+to+improve+the+neurotrophic+effect+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+primary+neurons.">Human platelet lysate acts synergistically with laminin to improve the neurotrophic effect of human adipose-derived stem cells on primary neurons.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 658176 (2021).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Cowper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+as+a+functional+substitute+for+fetal+bovine+serum+in+the+culture+of+human+adipose+derived+stromal/stem+cells.">Human platelet lysate as a functional substitute for fetal bovine serum in the culture of human adipose derived stromal/stem cells.</a> Cells. 8 (7), 724 (2019).</li><li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+the+treatment+and+prevention+of+graft-versus-host+disease:+Experiments+and+practice.">Mesenchymal stem cells for the treatment and prevention of graft-versus-host disease: Experiments and practice.</a> Annals of Hematology. 92 (10), 1295-1308 (2013).</li><li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+metal+micro+and+nano-particles+on+hASCs:+An+in+vitro+model.">Effects of metal micro and nano-particles on hASCs: An in vitro model.</a> Nanomaterials. 7 (8), 212 (2017).</li><li>Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stromal+vascular+fraction+cells:+Update+on+clinical+utility+and+efficacy.">Adipose-derived stromal vascular fraction cells: Update on clinical utility and efficacy.</a> Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).</li><li>Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+medium+composition+and+translational+adult+bone+marrow-derived+stem+cell+research.">Cell culture medium composition and translational adult bone marrow-derived stem cell research.</a> Stem Cells. 24 (5), 1409-1410 (2006).</li><li>Perez-Ilzarbe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+ex+vivo+expansion+culture+conditions+of+mesenchymal+stem+cells+for+human+cell+therapy.">Comparison of ex vivo expansion culture conditions of mesenchymal stem cells for human cell therapy.</a> Transfusion. 49 (9), 1901-1910 (2009).</li><li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+cell-detaching+methods+on+the+viability+and+cell+surface+antigen+expression+of+synovial+mesenchymal+stem+cells.">Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li><li>Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-enzymatic+method+for+isolating+human+adipose+tissue-derived+stromal+stem+cells.">A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells.</a> Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).</li><li>Becherucci, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+in+mesenchymal+stromal+cell+expansion+according+to+a+GMP+grade+protocol:+A+cell+factory+experience.">Human platelet lysate in mesenchymal stromal cell expansion according to a GMP grade protocol: A cell factory experience.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 124 (2018).</li><li>Blande, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+mesenchymal+stem+cell+expansion+in+animal+serum-free+medium+supplemented+with+autologous+human+platelet+lysate.">Adipose tissue mesenchymal stem cell expansion in animal serum-free medium supplemented with autologous human platelet lysate.</a> Transfusion. 49 (12), 2680-2685 (2009).</li><li>Castegnaro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+platelet+lysate+on+the+functional+and+molecular+characteristics+of+mesenchymal+stem+cells+isolated+from+adipose+tissue.">Effect of platelet lysate on the functional and molecular characteristics of mesenchymal stem cells isolated from adipose tissue.</a> Current Stem Cell Research &amp; Therapy. 6 (2), 105-114 (2011).</li><li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+review+and+meta-analysis+on+the+use+of+human+platelet+lysate+for+mesenchymal+stem+cell+cultures:+Comparison+with+fetal+bovine+serum+and+considerations+on+the+production+protocol.">Systematic review and meta-analysis on the use of human platelet lysate for mesenchymal stem cell cultures: Comparison with fetal bovine serum and considerations on the production protocol.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 13 (1), 142 (2022).</li><li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+as+a+potential+clinical-translatable+supplement+to+support+the+neurotrophic+properties+of+human+adipose-derived+stem+cells.">Human platelet lysate as a potential clinical-translatable supplement to support the neurotrophic properties of human adipose-derived stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 11 (1), 432 (2020).</li><li>Kr&#228;henb&#252;hl, S. M., Grognuz, A., Michetti, M., Raffoul, W., Applegate, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+human+adipose-derived+stem+cell+expansion+and+stability+for+clinical+use.">Enhancement of human adipose-derived stem cell expansion and stability for clinical use.</a> International Journal of Stem Cell Research &amp; Therapy. 2 (1), 007 (2015).</li></ol>

Adipoz türevi kök hücreler, bollukları, hızlı ve uygun fiyatlı izolasyon yöntemleri, yüksek in vitro/in vivo proliferasyon oranları ve köklülük/farklılaşma özellikleri 18,19,20 nedeniyle son on yılda translasyonel araştırmaların ilgisini çekmiştir. Sonuç olarak, hASC'ler rejeneratif tıpta hücre bazlı stratejiler için mükemmel bir aday olarak kabul edilir21. Ya...

Son yıllarda, yenilikçi terapötik tedavilere olan talebin artması, translasyonel tıp alanında önemli çabalara ve kaynak yatırımlarına yol açmıştır1. Hücre bazlı ürünler, hücre kaynağı, üretim süreci (izolasyon, genişleme veya genetik modifikasyon) ve hücresel olmayan takviyeler (enzimler, büyüme faktörleri, kültür takviyeleri ve antibiyotikler) tarafından belirlenen risklerle ilişkilidir ve bu risk faktörleri spesifik terapötik endikasyona bağlıdır. Nihai ürünün kalitesi, güvenliği ve etkinliği, yukarıda belirtilen unsurlardan derinden etkilenebilir2. Kök hücre tedavisi biyogüvenlik ilkelerine bağlı kalmayı gerektirir; Hücre kültüründe hayvansal kaynaklı ürünlerle patojenik bulaşmanın potansiyel riskleri sorunlu olabilir ve üretime dahil edilen herhangi bir ürünün kapsamlı bir şekilde test edilmesi esastır3.
İnsan adipoz türevi kök hücreleri (hASK'ler) izole etmek için kullanılan geleneksel yöntem, kollajenaz ile gerçekleştirilen enzimatik bir sindirimi ve ardından santrifüjleme yoluyla yıkama adımlarını içerir4. Enzimatik izolasyon genellikle hücre verimi ve canlılığı açısından diğer mekanik tekniklerden daha verimli olarak kabul edilirken, kollajenaz gibi kullanılan hayvan kaynaklı bileşenlerin ABD Gıda ve İlaç İdaresi tarafından minimum düzeyde manipüle edilmesinden daha fazlası olduğu düşünülmektedir. Bu, immün reaksiyonlar veya hastalık bulaşma riskinin önemli ölçüde arttığı anlamına gelir, böylece hASC tedavisinin klinik ortamlara çevrilmesi sınırlandırılır 5,6.
Tripsin bazlı sindirim, ASC'leri izole etmek için başka bir enzimatik protokoldür. Tripsin konsantrasyonu, santrifüjleme hızı ve inkübasyon süresi açısından küçük değişikliklerle farklı teknikler tanımlanmıştır. Ne yazık ki, bu yöntem iyi tanımlanmamıştır ve literatürde, özellikle mekanik izolasyon protokolleri7 ile karşılaştırma eksikliği vardır. Bununla birlikte, yaklaşımın çevrilebilirliği açısından, tripsin aynı kollajenaz dezavantajlarına sahiptir.
ASC'leri elde etmek için mekanik kuvvetlere dayanan ve enzim ilavesi olmayan alternatif izolasyon yöntemleri, yağ dokusu parçalarının yüksek hızlı santrifüjlenmesini (800 x g veya 1.280 x g, 15 dakika) içerir. Daha sonra, pelet bir kırmızı kan hücresi lizis tamponu (5 dakika) ile inkübe edilir, ardından kültür ortamında yeniden süspansiyondan önce 600 x g'de başka bir santrifüjleme adımı izlenir. İlk günlerde eksplant yöntemlerine kıyasla daha fazla sayıda hücre izole edilmesine rağmen, önceki bir çalışma, kültür8'in ikinci haftasından sonra daha düşük veya hiç proliferasyon göstermediğini göstermiştir.
Bunun yanı sıra, hücre kültürü için bir büyüme faktörü takviyesi olarak kullanılan fetal sığır serumu (FBS) gibi ksenojenik eklenmiş ortamlarla daha fazla manipülasyon, immün reaktivite riskinin artması ve konakçı hastanın viral, bakteriyel veya prion enfeksiyonlarına maruz kalma riski ile ilişkilidir 9,10. İmmün reaksiyonlar ve ürtiker form döküntü gelişimi, FBS11 ile üretilen birkaç doz mezenkimal kök hücre alan bireylerde zaten tanımlanmıştır. Ayrıca, FBS, nihai ürün kalitesi12 üzerinde bir etkisi olabilecek partiden partiye değişkenliğe tabidir.
İyi üretim uygulamaları (GMP) kılavuzlarına uygun olarak, enzimatik doku ayrışmasından kaçınılmalı ve FBS, ksenojenik içermeyen takviyelerle değiştirilmelidir. Bu adımlar, daha güvenilir ve tekrarlanabilir protokollerle birlikte, hücre tedavisinin uygulanmasını desteklemek için gereklidir 3,13.
Bu bağlamda, insan trombosit lizatı (hPL), hücre içermeyen, protein içeren, büyüme faktörü bakımından zenginleştirilmiş bir takviye olduğu için FBS'nin yerine önerilmiş ve daha önce klinik sınıf hücre bazlı ürünler arasında in vitro hücre kültürü ve genleşme14,15 için bir büyüme ortamı katkısı olarak tanıtılmıştır. hPL, insan kaynaklı bir ürün olduğundan, klinik uygulamalara yönelik hASC'lerin in vitro kültürü sırasında FBS'nin yerine sıklıkla kullanılır, böylece FBS çevrilebilirliği ile ilgili immünolojik reaksiyonlar ve enfeksiyonlarla ilgili sorunları azaltır15,16.
Daha yüksek üretim maliyetlerine rağmen, FBS ile karşılaştırıldığında, hPL'nin birçok hücre tipi için hücre canlılığını desteklediği, proliferasyonu arttırdığı, yaşlanmayı geciktirdiği, genomik stabiliteyi sağladığı ve geç hücre pasajlarında bile hücresel immünofenotipi koruduğu gösterilmiştir; tüm bu unsurlar bu kültüre geçişi desteklemektedir ek11.
Bu çalışmanın amacı, klasik FBS kültürlü hASC'lere kıyasla hücre fizyolojisini ve kök özelliklerini değiştirmeden, hASC'leri tam bir hayvansız yöntemle izole etmek ve kültürlemek için standartlaştırılmış bir protokol geliştirmekti (Şekil 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>euroclone</td>
			<td>et5015b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD105</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD560839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD34</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD555821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD555482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD73</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD561254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer)</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument)</td>
			<td>BD accuri</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burker chamber</td>
			<td>Blaubrand</td>
			<td>717810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell freezing container</td>
			<td>corning</td>
			<td>CLS432002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell Freezing container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS432002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>clearline</td>
			<td>390701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposabile blade scalpel</td>
			<td>paragon</td>
			<td>bs 2982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium - high glucose</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Platelet Lysate FD (GMP grade)</td>
			<td>Stemulate</td>
			<td>PL-NH-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite F50 spectrophotometer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 10 cm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scalpels</td>
			<td>Reda</td>
			<td>07104-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scissors</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>4071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tweezers</td>
			<td>Bochem</td>
			<td>1152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging bucket centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3-16K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flasks</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>6910170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLe (animal free trypsin substitute)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12604-013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of human adipose-derived stem cells with an innovative xenogeneic-free method for human therapy

Kök hücre tedavisinin artan etkisi göz önüne alındığında, in vitro manipülasyon sırasında hayvansal kaynaklı ürünlerin piyasaya sürülmesi nedeniyle potansiyel kontaminasyon veya enfeksiyon bulaşması ile ilgili biyogüvenlik endişeleri dile getirilmiştir. Hücre izolasyonu ve genişleme adımları sırasında yaygın olarak kullanılan kollajenaz veya fetal sığır serumu gibi ksenojenik bileşenler, alıcı hastalarda immün reaktivite veya viral, bakteriyel ve prion enfeksiyonunun potansiyel riskleri ile ilişkili olabilir. İyi üretim uygulamaları kılavuzlarını takiben, kimyasal doku ayrışmasından kaçınılmalı, fetal sığır serumu (FBS) ksenojenik içermeyen takviyelerle ikame edilebilir. Ayrıca, hücre ürünlerinin güvenliğini sağlamak için, daha güvenilir ve tekrarlanabilir yöntemlerin tanımlanması önemlidir. Kollajenaz FBS kültürlü standart protokollere kıyasla özelliklerini değiştirmeden insan adipoz türevi kök hücrelerin izolasyonu ve in vitro genişlemesi için yenilikçi, tamamen ksenojenik içermeyen bir yöntem geliştirdik. Burada, insan adipoz kaynaklı kök hücreler (hASC'ler) abdominal yağ dokusundan izole edildi. Numune makas / neşter ile mekanik olarak kıyılmış, mikro disseke edilmiş ve mekanik olarak 10 cm'lik bir Petri kabında dağılmış ve doku parçalarının bağlanmasını ve hASC'lerin göçünü kolaylaştırmak için neşter kesileri ile hazırlanmıştır. Yıkama adımlarını takiben, hASC'ler enzimatik sindirim olmadan plastik yapışmaları nedeniyle seçildi. İzole edilmiş hASC'ler,% 5 heparin içermeyen insan trombosit lizatı ile desteklenmiş orta dereceli olarak kültürlendi ve hayvansız tripsin ikamesi ile ayrıldı. İnsan tedavisine yönelik hücre ürünlerinin üretimine ilişkin iyi üretim uygulamaları (GMP) talimatlarını takiben, hiçbir kültür ortamında antibiyotik kullanılmamıştır.

Yukarıda detaylandırılan izolasyon yöntemi uygulanarak kollajenaz kullanılmadan abdominal yağ dokusu örneklerinden hASC'ler başarıyla elde edildi. Dahası, hASC'ler hPL varlığında ve hayvansal kökenli başka herhangi bir bileşen olmadan tamamen ksenojenik içermeyen koşullarda genişletildi. Aşağıdaki sonuçlar protokolü destekler ve hPL ile paralel olarak kültürlenmiş hASC'lerden ve kontrol koşulu olarak FBS ile elde edilir.
İlk küme görünümünden sonra, hASC'ler k...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Human Adipose-Derived Stem Cells With an Innovative Xenogeneic-Free Method for Human Therapy at JoVE.com

Isolation and Culture of Human Adipose-Derived Stem Cells With an Innovative Xenogeneic-Free Method for Human Therapy

Hücre tedavisi hazırlığı/manipülasyon aşamalarında kullanılmaya başlanan ksenojenik (kimyasal veya hayvansal türevli) ürünler, konakçı hastalarda immün reaktivite ve patojenik bulaşma riskinin artmasıyla ilişkilidir. Burada, insan adipoz türevi kök hücrelerin izolasyonu ve in vitro genişlemesi için tam bir ksenojenik içermeyen yöntem açıklanmaktadır.

İnsan Tedavisi için Yenilikçi Bir Ksenojenik İçermeyen Yöntemle İnsan Adipoz Türevi Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Kültürü

Considering the increasing impact of stem cell therapy, biosafety concerns have been raised regarding potential contamination or infection transmission ...

İnsan adipoz türevi kök hücrelerin izolasyonu ve in vitro genişlemesi için ekzojenik içermeyen yöntemimiz, translasyonel uygulama için düşünüldüğünde hücre tedavisi ile ilgili biyogüvenlik endişelerine cevaptır. Yalıtım ve genişletme yöntemlerimizin çoğaltılması kolay, hızlı ve teknik gereksinimleri düşüktür, bu da onları herkes için yararlı kılar. Periferik sinir onarımı için insan yağ kök hücre bazlı tedavi stratejisini araştırıyoruz.Bununla birlikte, tekniğimiz farklı klinik araştırma kurulumlarında yeni yağ kök hücrelerine ihtiyaç duyulduğunda yaygın olarak uygulanabilir. Daha kolay üretilebilirliği korumak için bunu basit tuttuk. Sterilite, ameliyathaneden hücre kültürüne kadar dikkatlice gözlemlenmelidir.Numune manipülasyonu ve fragmanlar için mikro diseksiyon kontaminasyon riski altındadır. Karın plastik cerrahisinden yağ dokusu örneği alındıktan sonra, steril makas kullanarak, yaklaşık bir santimetrekarelik parçalara bölün. Bir neşter ile, mikro her parçayı daha küçük parçalara ayırır ve 10 santimetrelik bir Petri kabında beş parça dağıtır.Parça tutturmak için, plastik yüzeyde kesikler oluşturmak için bir neşter kullanın ve her parçayı sürükleyin. Nazikçe, tüm parçaları ayırmadan örtmek için 10 mililitre tam kültür ortamı ekleyin ve Petri kabını 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. İnsan adipoz türevi kök hücreyi veya HASC'ı, hücreler birleşene kadar optik mikroskop altında günlük olarak genişletin.Hücre kalıntılarını çıkarmak ve ilk geçişe kadar büyümelerini sağlamak için ortamı her 72 saatte bir taze bir tam ortamla değiştirin. HASC kültürü% 70 ila% 80 akıcılığa ulaştığında, steril cımbız kullanarak tüm doku parçalarını çıkarın ve atın. Ayrıca, HASC'ın Petri kabından ayrılmasından kaçınarak yorgun ortamı atın.Hücreleri 10 mililitre PBS ile dikkatlice yıkayın. PBS'yi çıkardıktan sonra, bir mililitre hayvansız tripsin ekleyin ve beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Optik mikroskop altında hücre ayrılmasını kontrol edin ve gerekirse iki dakika daha inkübe edin.Hücre ayrılmasını desteklemek için, plastik yüzeye hafifçe dokunun. İki mililitre tam ortam ekleyerek tripsin hareketini durdurun ve tüm hücreleri 15 mililitrelik bir tüpte toplayın. Kalan tripsi santrifüjleme ile çıkarın.Süper nantantı attıktan sonra, hücreleri beş mililitre tam ortamda askıya alın ve hücre süspansiyonunu yeni bir T25 şişesine aktarın. Kriyografyanın korunması için, optik mikroskop altında hücre sayacını kullanarak ayrılan müstakil hücrelerin bir aliquotunu sayın. Hücreleri beş dakika boyunca 300 G'de santrifüj edin.Süpernatanı attıktan sonra, dondurucu karışımdaki hücreleri, mililitre başına altıncı hücrelere bir kez 10 kat daha fazla yoğunlukta askıya alın ve hücre süspansiyonunun bir mililitresini bir kriyo şişesine aktarın. Kriyo şişelerini eksi 80 santigrat dereceye kadar sıcaklığı dakikada bir santigrat derece düşüren dondurucu bir kaba koyun ve ardından kriyo şişelerini uzun süreli depolama için sıvı nitrojene taşıyın. İlk küme görünümünde, HASC'ler klasik iğ benzeri bir şekil gösterdi ve FBS varlığında kontrol hücrelerine kıyasla daha küçük ve daha uzundu.Hücre immünofenotipinin, iki takviye ile kültürlenen HASC'ler arasında benzer olduğu görülmüştür. HASC'lerin %80-90'ından fazlası CD73 ve CD105 için pozitif, %5'inden azı CD34 ve CD45 için eksprese edildi. Son olarak, proliferasyon testi, FBS kontrolüne kıyasla ortama insan trombosit lizatı eklendiğinde hücre büyümesinde önemli bir artış olduğunu ortaya koymuştur.En önemli adım yağ parçalarının mikro diseksiyonu ve Petri kabında neşter kesisi ile bağlanmalarıdır. GMP biyogüvenlik kriterlerine göre kullanıma hazır insan adipoz kaynaklı kök hücre popülasyonu elde edilir, terapötik hücre özellikleri korunur ve hücre proliferasyonunu arttırır.

Research

JoVE Journal

Medicine

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Bir Kök Hücre Nakli In vitro Simüle İskemi / Reperfüzyon Modeli

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Post-mortem Doku gelen kardiyomiyosit Çekirdeklerin İzolasyonu

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

Fare Göz içine Gen Terapisi Vektörler ve Kök Hücre Subretinal Enjeksiyon

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

İnsan Diş Pulp Kök Hücre İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Karşılaştırmalı Farklılaşma İki Farklı Yöntemler Kullanılarak Daimi Dişler türetilen

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Hasta Türetilen Hücre Kültürü ve CD133 İzolasyonu<sup&gt; +</supMelanom dan&gt; sağlayan olası Kanser Kök Hücreleri

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

İnsan Fetal Pankreas Hücre Kümeleri İzolasyon, Kültür ve Görüntüleme

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

İnsan Prostat Kanseri Örneklerinden Kanser Kök Hücreleri İzolasyon

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

İnsan Hücre Lines Kemorezistans Yumurtalık Kanser Kök Hücreleri Zenginleştirme

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

İzolasyon, Kriyoprezervasyon ve Kültür Klinik Uygulamaları İnsan Amniyon Epitel Hücreleri

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

İnsan Hipofiz Adenom Hücreleri üç boyutlu Aljinat-boncuk Kültür

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...