Name: protection of h9c2 myocardial cells from oxidative stress by crocetin via pink1/parkin pathway-mediated mitophagy
Uploaded: 2023-05-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door de Beijing Natural Science Foundation (nr. 7202119) en de National Natural Science Foundation of China (nr. 82274380).

De experimenten werden uitgevoerd in het Laboratorium voor Fysiologie aan de Beijing University of Chinese Medicine, China. Alle studiemethoden werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften van de Universiteit van Beijing.
1. Celkweek
<ol><li>Voeg 10% foetaal runderserum en 1% penicilline/streptomycine toe aan dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) basismedium (met 4,5 g/l D-glucose, 4,g.g/l L-glutamine en 110 mg/l natriumpyruvaat;...

<ol>
	<li>Anderson, J. L., Morrow, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myocardial+infarction.">Acute myocardial infarction.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).</li><li>Samsky, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiogenic+shock+after+acute+myocardial+infarction:+a+review.">Cardiogenic shock after acute myocardial infarction: a review.</a> JAMA. 326 (18), 1840-1850 (2021).</li><li>Abbate, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+cardiac+remodeling+benefits+in+patients+undergoing+late+percutaneous+coronary+intervention+of+the+infarct-related+artery:+evidence+from+a+meta-analysis+of+randomized+controlled+trials.">Survival and cardiac remodeling benefits in patients undergoing late percutaneous coronary intervention of the infarct-related artery: evidence from a meta-analysis of randomized controlled trials.</a> Journal of the American College of Cardiology. 51 (9), 956-964 (2008).</li><li>Santoro, G. M., Carrabba, N., Migliorini, A., Parodi, G., Valenti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+heart+failure+in+patients+with+acute+myocardial+infarction+treated+with+primary+percutaneous+coronary+intervention.">Acute heart failure in patients with acute myocardial infarction treated with primary percutaneous coronary intervention.</a> European Journal of Heart Failure. 10 (8), 780-785 (2008).</li><li>Dhruva, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+use+of+an+intravascular+microaxial+left+ventricular+assist+device+vs+intra-aortic+balloon+pump+with+in-hospital+mortality+and+major+bleeding+among+patients+with+acute+myocardial+infarction+complicated+by+cardiogenic+shock.">Association of use of an intravascular microaxial left ventricular assist device vs intra-aortic balloon pump with in-hospital mortality and major bleeding among patients with acute myocardial infarction complicated by cardiogenic shock.</a> JAMA. 323 (8), 734-745 (2020).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+associated+with+major+cardiovascular+events+1+year+after+acute+myocardial+infarction.">Risk factors associated with major cardiovascular events 1 year after acute myocardial infarction.</a> JAMA Network Open. 1 (4), e181079 (2018).</li><li>Jou, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+protects+against+common+deletion+of+mitochondrial+DNA-augmented+mitochondrial+oxidative+stress+and+apoptosis.">Melatonin protects against common deletion of mitochondrial DNA-augmented mitochondrial oxidative stress and apoptosis.</a> Journal of Pineal Research. 43 (4), 389-403 (2007).</li><li>La Piana, G., Fransvea, E., Marzulli, D., Lofrumento, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+supported+by+exogenous+cytochrome+c+oxidation+mimics+the+early+stages+of+apoptosis.">Mitochondrial membrane potential supported by exogenous cytochrome c oxidation mimics the early stages of apoptosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 246 (2), 556-561 (1998).</li><li>De Filippo, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+secondary+prevention+medical+therapies+on+outcomes+of+patients+suffering+from+Myocardial+Infarction+with+NonObstructive+Coronary+Artery+disease+(MINOCA):+A+meta-analysis.">Impact of secondary prevention medical therapies on outcomes of patients suffering from Myocardial Infarction with NonObstructive Coronary Artery disease (MINOCA): A meta-analysis.</a> International Journal of Cardiology. 368, 1-9 (2022).</li><li>Davidson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multitarget+strategies+to+reduce+myocardial+ischemia/reperfusion+injury:+JACC+review+topic+of+the+week.">Multitarget strategies to reduce myocardial ischemia/reperfusion injury: JACC review topic of the week.</a> Journal of the American College of Cardiology. 73 (1), 89-99 (2019).</li><li>Caricati-Neto, A., Errante, P. R., Menezes-Rodrigues, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+pharmacological+and+non-pharmacological+strategies+of+cardioprotection.">Recent advances in pharmacological and non-pharmacological strategies of cardioprotection.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 4002 (2019).</li><li>Chen, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+pharmacology+analysis+and+experimental+validation+to+investigate+the+mechanism+of+total+flavonoids+of+rhizoma+drynariae+in+treating+rheumatoid+arthritis.">Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of rhizoma drynariae in treating rheumatoid arthritis.</a> Drug Design, Development, and Therapy. 16, 1743-1766 (2022).</li><li>Wei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+Chinese+medicine+has+great+potential+as+candidate+drugs+for+lung+cancer:+A+review.">Traditional Chinese medicine has great potential as candidate drugs for lung cancer: A review.</a> Journal of Ethnopharmacology. 300, 115748 (2023).</li><li>Zhi, W., Liu, Y., Wang, X., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+of+traditional+Chinese+medicine+for+the+prevention+and+treatment+of+atherosclerosis.">Recent advances of traditional Chinese medicine for the prevention and treatment of atherosclerosis.</a> Journal of Ethnopharmacology. 301, 115749 (2023).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertensive+heart+disease+and+myocardial+fibrosis:+How+traditional+Chinese+medicine+can+help+addressing+unmet+therapeutical+needs.">Hypertensive heart disease and myocardial fibrosis: How traditional Chinese medicine can help addressing unmet therapeutical needs.</a> Pharmacological Research. 185, 106515 (2022).</li><li>Zhang, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+Chinese+medicine+intervenes+ventricular+remodeling+following+acute+myocardial+infarction:+evidence+from+40+random+controlled+trials+with+3,659+subjects.">Traditional Chinese medicine intervenes ventricular remodeling following acute myocardial infarction: evidence from 40 random controlled trials with 3,659 subjects.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 707394 (2021).</li><li>Hao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+Chinese+medicine+for+cardiovascular+disease:+evidence+and+potential+mechanisms.">Traditional Chinese medicine for cardiovascular disease: evidence and potential mechanisms.</a> Journal of the American College of Cardiology. 69 (24), 2952-2966 (2017).</li><li>Delgado-Montero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+stasis+imaging+predicts+cerebral+microembolism+during+acute+myocardial+infarction.">Blood stasis imaging predicts cerebral microembolism during acute myocardial infarction.</a> Journal of the American Society of Echocardiography. 33 (3), 389-398 (2020).</li><li>Lu, C. Y., Lu, P. C., Chen, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+trends+in+traditional+Chinese+medicine+for+acute+myocardial+infarction.">Utilization trends in traditional Chinese medicine for acute myocardial infarction.</a> Journal of Ethnopharmacology. 241, 112010 (2019).</li><li>Gao, Z. Y., Xu, H., Shi, D. Z., Wen, C., Liu, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+on+outcome+of+5284+patients+with+coronary+artery+disease:+the+role+of+integrative+medicine.">Analysis on outcome of 5284 patients with coronary artery disease: the role of integrative medicine.</a> Journal of Ethnopharmacology. 141 (2), 578-583 (2012).</li><li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crocetin+ester+improves+myocardial+ischemia+via+Rho/ROCK/NF-kappaB+pathway.">Crocetin ester improves myocardial ischemia via Rho/ROCK/NF-kappaB pathway.</a> International Immunopharmacology. 38, 186-193 (2016).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+cell+number+by+hemocytometry+counting.">Estimation of cell number by hemocytometry counting.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (11), (2019).</li><li>Zeng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+potential+value+and+mechanism+of+Kaji-Ichigoside+F1+on+arsenite-induced+skin+cell+senescence.">Assessing the potential value and mechanism of Kaji-Ichigoside F1 on arsenite-induced skin cell senescence.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 9574473 (2022).</li><li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+mitochondria+with+JC-1.">Labeling mitochondria with JC-1.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).</li><li>Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., Kioussi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+apoptosis+by+TUNEL+assay.">Detection of apoptosis by TUNEL assay.</a> Methods in Molecular Biology. 887, 41-47 (2012).</li><li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitate+impairs+the+autophagic+flux+to+induce+p62-dependent+apoptosis+through+the+upregulation+of+CYLD+in+NRCMs.">Palmitate impairs the autophagic flux to induce p62-dependent apoptosis through the upregulation of CYLD in NRCMs.</a> Toxicology. 465, 153032 (2022).</li><li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting.">Western blotting.</a> Methods. 38 (4), 283-293 (2006).</li><li>Chen, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+flavonoids+of+rhizoma+drynariae+restore+the+MMP/TIMP+balance+in+models+of+osteoarthritis+by+inhibiting+the+activation+of+the+NF-&#954;B+and+PI3K/AKT+pathways.">Total flavonoids of rhizoma drynariae restore the MMP/TIMP balance in models of osteoarthritis by inhibiting the activation of the NF-&#954;B and PI3K/AKT pathways.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 6634837 (2021).</li><li>Amin, A., Hamza, A. A., Bajbouj, K., Ashraf, S. S., Daoud, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saffron:+a+potential+candidate+for+a+novel+anticancer+drug+against+hepatocellular+carcinoma.">Saffron: a potential candidate for a novel anticancer drug against hepatocellular carcinoma.</a> Hepatology. 54 (3), 857-867 (2011).</li><li>Kamalipour, M., Akhondzadeh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+effects+of+saffron:+an+evidence-based+review.">Cardiovascular effects of saffron: an evidence-based review.</a> The Journal of Tehran Heart Center. 6 (2), 59-61 (2011).</li><li>Mani, V., Lee, S. K., Yeo, Y., Hahn, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+metabolic+perspective+and+opportunities+in+pharmacologically+important+safflower.">A metabolic perspective and opportunities in pharmacologically important safflower.</a> Metabolites. 10 (6), 253 (2020).</li><li>Broadhead, G. K., Chang, A., Grigg, J., McCluskey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+saffron+supplementation:+current+clinical+findings.">Efficacy and safety of saffron supplementation: current clinical findings.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (16), 2767-2776 (2016).</li><li>Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+protective+effect+of+salidroside+against+H2O2-induced+injury+in+H9C2+cells.">Insight into the protective effect of salidroside against H2O2-induced injury in H9C2 cells.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1060271 (2021).</li><li>Chen, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+rhizoma+drynariae+targets+in+the+treatment+of+osteoarthritis+based+on+network+pharmacology+and+experimental+verification.">Prediction of rhizoma drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 5233462 (2021).</li><li>Reers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+monitored+by+JC-1+dye.">Mitochondrial membrane potential monitored by JC-1 dye.</a> Methods in Enzymology. 260, 406-417 (1995).</li><li>Radovits, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribose)+polymerase+inhibition+improves+endothelial+dysfunction+induced+by+reactive+oxidant+hydrogen+peroxide+in+vitro.">Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves endothelial dysfunction induced by reactive oxidant hydrogen peroxide in vitro.</a> European Journal of Pharmacology. 564 (1-3), 158-166 (2007).</li><li>Song, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdependence+of+parkin-mediated+mitophagy+and+mitochondrial+fission+in+adult+mouse+hearts.">Interdependence of parkin-mediated mitophagy and mitochondrial fission in adult mouse hearts.</a> Circulation Research. 117 (4), 346-351 (2015).</li><li>Gan, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+mechanism+of+PINK1.">Activation mechanism of PINK1.</a> Nature. 602 (7896), 328-335 (2022).</li><li>Nguyen, T. N., Padman, B. S., Lazarou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+molecular+signals+of+PINK1/Parkin+mitophagy.">Deciphering the molecular signals of PINK1/Parkin mitophagy.</a> Trends in Cell Biology. 26 (10), 733-744 (2016).</li><li>Yamada, T., Dawson, T. M., Yanagawa, T., Iijima, M., Sesaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SQSTM1/p62+promotes+mitochondrial+ubiquitination+independently+of+PINK1+and+PRKN/parkin+in+mitophagy.">SQSTM1/p62 promotes mitochondrial ubiquitination independently of PINK1 and PRKN/parkin in mitophagy.</a> Autophagy. 15 (11), 2012-2018 (2019).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(4th+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition).</a> Autophagy. 17 (1), 1 (2021).</li></ol>

De exploratie van effectieve ingrediënten uit complexe verbindingen van natuurlijke geneesmiddelen door middel van geavanceerde technologie is een hotspot geweest van TCM-onderzoek29 en kan laboratoriumbewijs leveren voor toekomstige medicijnontwikkeling na verificatie. Saffloer is een representatief medicijn bij de behandeling van "het bevorderen van de bloedcirculatie en het minimaliseren van bloedstasis" en wordt veel gebruikt bij de behandeling van een hartinfarct30,31...

Acuut myocardinfarct (AMI) is een levensbedreigende myocardiale necrose veroorzaakt door ernstige en aanhoudende ischemie en hypoxie van kransslagaders 1,2. Percutane coronaire interventie (PCI) is een van de eerstelijns therapeutische strategieën voor AMI en beschermt cardiomyocyten meestal tegen ischemische schade 3,4. Het distale myocard zal geen bloed- en zuurstoftoevoer hebben als het niet snel en effectief wordt behandeld na AMI, wat leidt tot ischemische necrose en verdere cardiovasculaire complicaties 5,6. Het bevorderen van cardiomyocytenherstel en het minimaliseren van onomkeerbare myocardiale schade na het missen van de PCI-chirurgische kans is een onderzoekshotspot geweest. Na AMI bevinden cardiomyocyten zich in een toestand van ischemie en hypoxie, wat resulteert in de remming van mitochondriale oxidatieve fosforylering, reductie van NAD + tot NADPH en verhoogde reductie van één elektron7. Als gevolg hiervan genereert de onvolledige reductiereactie van zuurstof een overmaat aan reactieve zuurstofsoorten (ROS) en leidt uiteindelijk tot oxidatieve stressschade aan cardiomyocyten8. Een overmatige accumulatie van ROS veroorzaakt lipideperoxidatie, waardoor de structuur en functie van mitochondriale membranen verder wordt verstoord. Het resultaat is een continue opening van mitochondriale permeabiliteitsovergangsporiën en een afname van het mitochondriale membraanpotentiaal, waardoor apoptose en necrose worden geïnduceerd.
Angiotensine-converting enzyme (ACE) -remmers, angiotensine-receptorblokkers (ARB's), de remmers van β-adrenoceptoren, aldosteronantagonisten en andere standaardgeneesmiddelen in AMI kunnen helpen de hartfunctie na een hartinfarct te verbeteren en het optreden van kwaadaardige gebeurtenissen, zoals aritmieën en linkerventrikelremodellering, te voorkomen9. De overleving en prognose na een infarct worden echter sterk beïnvloed door de grootte van het infarct en er zijn geen bevredigende resultaten bereikt voor het verminderen van cardiomyocytenapoptose10,11. Zo is de ontwikkeling van geneesmiddelen om het herstel van cardiomyocyten na een hartinfarct te bevorderen een urgent probleem geworden.
De traditionele geneeskunde is al vele jaren een inspiratiebron voor het moderne farmaceutische onderzoek12,13,14,15. Traditionele Chinese geneeskunde (TCM) heeft een lange geschiedenis in de behandeling van AMI, en een reeks gerandomiseerde controlestudies in de afgelopen jaren hebben bevestigd dat TCM inderdaad de prognose van patiënten16,17 kan verbeteren. Volgens de TCM-theorie wordt AMI veroorzaakt door bloedstasis18,19, dus geneesmiddelen voor het bevorderen van de bloedcirculatie worden meestal gebruikt voor de behandeling van AMI in de acute fase20. Onder hen wordt aangenomen dat saffraan een krachtig effect heeft op bloedactivering en stasis, en wordt vaak gebruikt bij de acute behandeling van AMI. Crocetine, een belangrijk bestanddeel van saffraan, kan een sleutelrol spelen bij de bescherming van cardiomyocyten21.
In deze studie werden H9c2 myocardiale cellen geïnduceerd door H2 O2 om myocardiale ischemie / reperfusie te simuleren, wat een cardiomyocytenbeschadiging van AMI veroorzaakt, en crocetine werd gebruikt als een interventie om het beschermende effect tegen oxidatieve stress-geïnduceerde myocardiale schade te onderzoeken. Het mechanisme van crocetine dat cardiomyocyten beschermt, werd verder onderzocht door middel van mitofagie. Wat nog belangrijker is, dit artikel biedt een referentie voor de technische benadering van de studie van mitofagie en beschrijft de hele experimentele procedure in detail.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2323363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V900929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x protein loading buffer</td>
			<td>Beijing Pulilai Gene Technology</td>
			<td>B1030-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C3011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZF-0514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZF-0513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-free blocking solution</td>
			<td>CST</td>
			<td>15019s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Parkin antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-32282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PINK1 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A11435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TOM20 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A19403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-actin&#160; antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>AC026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>KeyGEN Biotech</td>
			<td>KGP902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood cell counting plate</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>WG607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAT assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A007-1-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence detection system</td>
			<td>Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory</td>
			<td>ChemiScope 6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A032-1-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme Q10 (CoQ 10)</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>C6129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crocetin</td>
			<td>Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>RFS-Z01802006012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI-containing antifluorescence quenching tablets</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZLI-9557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCFH-DA</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>S0033S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D8371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>8122091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution</td>
			<td>NCM Biotech</td>
			<td>P10100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning-Cellgro</td>
			<td>35-081-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 7.0&#160;</td>
			<td>https://www.graphpad.com/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH-Px assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A005-1-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9c2 myocardial cells</td>
			<td>Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd.</td>
			<td>CS0062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZB-2305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZB-2301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit</td>
			<td>LABLEAD</td>
			<td>J22202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A020-2-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A003-2-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>A2114057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perhydrol</td>
			<td>G-clone</td>
			<td>CS7730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor</td>
			<td>CWBIO</td>
			<td>CW2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>R0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE gels</td>
			<td>Shanghai Epizyme Biomedical Technology</td>
			<td>PG112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE running buffer powder</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G2018-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE transfer buffer powder</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G2017-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOD assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A001-2-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered saline powder</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G0001-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SLCC9172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUNEL apoptosis assay kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8220</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protection of h9c2 myocardial cells from oxidative stress by crocetin via pink1/parkin pathway-mediated mitophagy

Deze studie was gericht op het onderzoeken van het oxidatieve stressbeschermende effect van crocetine op H 2 O2-gemedieerdeH9c2 myocardiale cellen door middel van in vitro experimenten, en verder onderzoeken of het mechanisme ervan gerelateerd is aan de impact van mitofagie. Deze studie was ook bedoeld om het therapeutische effect van saffloerzuur op oxidatieve stress in cardiomyocyten aan te tonen en te onderzoeken of het mechanisme ervan verband houdt met het effect van mitofagie. Hier werd een opH 2 O2 gebaseerd oxidatief stressmodel geconstrueerd en de mate van oxidatieve stressschade van cardiomyocyten beoordeeld door de niveaus van lactaatdehydrogenase (LDH), creatinekinase (CK), malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) en glutathionperoxidase (GSH Px) te detecteren. Reactieve zuurstofsoorten (ROS) - detecterende fluorescerende kleurstof DCFH-DA, JC-1-kleurstof en TUNEL-kleurstof werden gebruikt om mitochondriale schade en apoptose te beoordelen. Autofagische flux werd gemeten door transfectie Ad-mCherry-GFP-LC3B adenovirus. Mitofagie-gerelateerde eiwitten werden vervolgens gedetecteerd via western blotting en immunofluorescentie. Crocetine (0,1-10 μM) kan echter de levensvatbaarheid van cellen aanzienlijk verbeteren en apoptose en oxidatieve stressschade veroorzaakt door H 2 O2verminderen. In cellen met overmatige autofagische activering kan crocetine ook de autofagiestroom en de expressie van mitofagie-gerelateerde eiwitten PINK1 en Parkin verminderen en de overdracht van Parkin naar mitochondriën omkeren. Crocetine kon H 2 O2-gemedieerde oxidatieve stressschade en de apoptose van H9c2-cellen verminderen, en het mechanisme was nauw verwant aan mitofagie.

Effecten van crocetine op de levensvatbaarheid van cellen Crocetine bij 0,1 μM, 0,5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM en 100 μM had een significant proliferatief effect op cellen, terwijl crocetine bij concentraties boven 200 μM de proliferatie van H9c2-cellen significant remde (figuur 1A). Na 4 uur behandeling met 400 μM H 2 O2was de levensvatbaarheid van de cel aanzienlijk verminderd en kon crocetine deze verandering tot op zekere hoogte omkere...

Watch this Scientific Journal Video about Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy at JoVE.com

Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy

Op basis van in vitro experimenten onthulde deze studie het mechanisme van crocetine bij het repareren van oxidatieve stressschade van cardiomyocyten door mitofagie te beïnvloeden, waarbij de PINK1 / Parkin-signaleringsroute een belangrijke rol speelt.

Bescherming van H9c2 myocardiale cellen tegen oxidatieve stress door crocetine via PINK1 / Parkin Pathway-gemedieerde mitofagie

This study aimed to explore the oxidative stress-protective effect of crocetin on H2O2-mediated H9c2 myocardial cells through in vitro experiments, and ...

Dit protocol biedt een referentie voor de technische benadering van de studie van autofaag en het beschrijft de volledige experimentele procedures in detail. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de lengtewaarneming van de verandering in autofagische flux mogelijk maakt. Voordat u met het experiment begint, bepaalt u de effectieve infectieconcentratie en neemt u de nodige veiligheidsmaatregelen.Begin met het centrifugeren van geneutraliseerde H9C2 myocardiale cellen bij 179G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg en meng de cellen in DMEM compleet medium door zachtjes te blazen. Verdeel de cellen in negen gelijke verhoudingen.Voeg dimethylsulfoxide toe aan de controlegroep. Voeg vervolgens verschillende concentraties crocetine toe aan de resterende groepen. Zaai 100 microliter cellen per put in een plaat met 96 putten.Eenmaal geïncubeerd gedurende 24 uur, gooi het supernatant weg. Was vervolgens de cellen drie keer met PBS. Voeg 100 microliter DMEM basaal medium toe aan elke put en inccubeer de cellen gedurende vier uur bij 37 graden Celsius.Voeg nu 20 microliter MTS toe en incubeer nog eens twee uur zoals aangetoond. Meet ten slotte de absorptie op 490 nanometer en bereken de levensvatbaarheid van de cel. Om de ROS te bepalen, verdunt u DCFH-DA in een verhouding van 1:1000 met het serumvrije medium.Gooi het supernatant van de cel weg van een 48-putplaat, eerder bezaaid met H9C2-cellen. Was de cellen vervolgens twee keer met een serumvrij medium. Voeg 150 microliter verdund DCFH-DA toe aan elke put en incuber deze gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius.Was vervolgens de cellen drie keer met serumvrij medium. Leg ten slotte beelden vast met een fluorescentiemicroscoop. Om mitochondriale membraanpotentiaal te analyseren, voegt u JC-1-werkoplossing toe aan de eerder gekweekte cellen en mengt u goed.Incubeer ze bij 37 graden Celsius gedurende 20 minuten. Was vervolgens de cellen twee keer met JC-1 kleuringsbuffer. Voeg een compleet medium toe aan elke put en maak foto's met een fluorescentiemicroscoop.Bevestig de cellen met een celfixatieoplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Was ze vervolgens een keer met PBS. Voeg 0,3% Triton-100 toe aan elke put en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Voeg na twee PBS-wasbeurten TUNEL-detectiewerkoplossing toe aan elke put en incuber de cellen bij 37 graden Celsius in het donker gedurende 60 minuten. Voeg DAPI toe met een anti-fluorescentie-dovende tablet en leg de beelden vast zoals gedemonstreerd. Vervang de helft van het medium uit de eerder gekweekte cellen door vers medium in elk putje van een 48-putplaat.Voeg het mCherry GFP-LC3B adenovirus gevolgd door polybreen toe om de infectie-efficiëntie te verbeteren. Vervang het medium elke 24 uur. Observeer tegelijkertijd met behulp van een confocale microscoop fluorescerende eiwitexpressie om de infectie te bevestigen.Eenmaal geïnfecteerd, kweek en vang de cellen zoals beschreven in het manuscript. Begin met het fixeren van eerder gekweekte cellen met 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en voeg 0,1% Triton-100 toe. Blokkeer vervolgens de cellen met een diervrije blokoplossing gedurende een uur.Incubeer ze vervolgens 's nachts met een primair antilichaam bij vier graden Celsius. Voeg de volgende dag een fluorescerend secundair antilichaam toe aan de cellen en incuber ze gedurende een uur in het donker. Voeg ten slotte de DAPI met antifluorescentie-blustabletten toe voordat u de beelden vastlegt.In de huidige studie had crocetine een significant proliferatief effect op cellen. Terwijl een concentratie boven de 200 micromolar de proliferatie van H9C2-cellen remde. De levensvatbaarheid van de cel was aanzienlijk verminderd na behandeling met waterstofperoxide.Crocetine draaide deze verandering echter tot op zekere hoogte om. Het verhoogde ROS-niveau na waterstofperoxidebehandeling werd tot op zekere hoogte omgekeerd door crocetine. De fluorescentieresultaten bevestigden ook een verminderde ROS met crocetine.Verder herstelde crocetine-toevoeging de mitochondriale membraanpotentiaal instortingen veroorzaakt door waterstofperoxidebehandeling. Op dezelfde manier werd apoptose ook omgekeerd door crocetine. Bovendien keerde de crocetinevoorbehandeling de autofagiestroom van H9C2-cardiomyocyten om, geïnduceerd als gevolg van waterstofperoxidebehandeling.Crocetine voorbehandeling verminderde ook de translocatie van Parkin mitochondriën geïnduceerd door waterstofperoxide behandeling. Na deze procedure kan elektronenmicroscopisch klein ook worden gebruikt om een microfaag direct te observeren, waardoor een intuïtiever beeld ontstaat van mitochondriën die worden overspoeld door autofagosomen.

Research

JoVE Journal

Medicine

Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy

Acute Myocardial Infarction in Rats

Acuut myocardinfarct in ratten

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular ...

Development of a Unilaterally-lesioned 6-OHDA Mouse Model of Parkinson's Disease

Ontwikkeling van een eenzijdig-gelaedeerde 6-OHDA muismodel van de ziekte van Parkinson

The unilaterally lesioned 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned rat model of Parkinson's disease (PD) has proved to be invaluable in advancing our ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolatie, karakterisering en vergelijkende differentiatie van humane Dental Pulp stamcellen uit permanente tanden met behulp van twee verschillende methoden

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Cardiac Stress Test Induced by Dobutamine and Monitored by Cardiac Catheterization in Mice

Cardiac Stress Test geïnduceerd door dobutamine en bewaakt door hartkatheterisatie in Muizen

Dobutamine is a &beta;-adrenergic agonist with an affinity higher for receptor expressed in the heart (&beta;1) than for receptors expressed in the ...

Ultrasonic Assessment of Myocardial Microstructure

Ultrasone beoordeling van myocard microstructuur

Echocardiography is a widely accessible imaging modality that is commonly used to noninvasively characterize and quantify changes in cardiac structure and ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro en In Vivo opsporing van Mitophagy in menselijke cellen, C. Elegansen muizen

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Visualisatie van endogene Mitophagie complexen in situ in humane pancreas Bètacellen met behulp van proximity Ligatie test

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

In vitro Assessment of Myocardial Protection following Hypothermia-Preconditioning in a Human Cardiac Myocytes Model

In vitro beoordeling van myocardbescherming na hypothermie-conditionering in een humaan cardiale myocytenmodel

Ischemia/reperfusion-derived myocardial dysfunction is a common clinical scenario in patients after cardiac surgery. In particular, the sensitivity of ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Inductie en analyse van oxidatieve stress in doornroosje Transposon-getransfecteerde menselijke retinale pigmentepitheelcellen

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...

Utilizing Percutaneous Ventricular Assist Devices in Acute Myocardial Infarction Complicated by Cardiogenic Shock

Gebruik van percutane ventriculaire hulpmiddelen bij acuut myocardinfarct gecompliceerd door cardiogene shock

Cardiogenic shock is defined as persistent hypotension, accompanied by evidence of end organ hypo-perfusion. Percutaneous ventricular assist devices ...