Name: protection of h9c2 myocardial cells from oxidative stress by crocetin via pink1/parkin pathway-mediated mitophagy
Uploaded: 2023-05-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy at JoVE.com

Cette étude a été soutenue par la Fondation des sciences naturelles de Beijing (n ° 7202119) et la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n ° 82274380).

Les expériences ont été réalisées au laboratoire de physiologie de l’Université de médecine chinoise de Pékin, en Chine. Toutes les méthodes d’étude ont été réalisées conformément aux directives et règlements pertinents de l’Université de Beijing.
1. Culture cellulaire
<ol><li>Ajouter 10 % de sérum bovin fœtal et 1 % de pénicilline/streptomycine au milieu basique Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco (avec 4,5 g/L de D-glucose, 4,g/L de L-glutamine et 1...

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	<li>Anderson, J. L., Morrow, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myocardial+infarction.">Acute myocardial infarction.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).</li><li>Samsky, M. 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M., Carrabba, N., Migliorini, A., Parodi, G., Valenti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+heart+failure+in+patients+with+acute+myocardial+infarction+treated+with+primary+percutaneous+coronary+intervention.">Acute heart failure in patients with acute myocardial infarction treated with primary percutaneous coronary intervention.</a> European Journal of Heart Failure. 10 (8), 780-785 (2008).</li><li>Dhruva, S. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+pharmacology+analysis+and+experimental+validation+to+investigate+the+mechanism+of+total+flavonoids+of+rhizoma+drynariae+in+treating+rheumatoid+arthritis.">Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of rhizoma drynariae in treating rheumatoid arthritis.</a> Drug Design, Development, and Therapy. 16, 1743-1766 (2022).</li><li>Wei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+Chinese+medicine+has+great+potential+as+candidate+drugs+for+lung+cancer:+A+review.">Traditional Chinese medicine has great potential as candidate drugs for lung cancer: A review.</a> Journal of Ethnopharmacology. 300, 115748 (2023).</li><li>Zhi, W., Liu, Y., Wang, X., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+of+traditional+Chinese+medicine+for+the+prevention+and+treatment+of+atherosclerosis.">Recent advances of traditional Chinese medicine for the prevention and treatment of atherosclerosis.</a> Journal of Ethnopharmacology. 301, 115749 (2023).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertensive+heart+disease+and+myocardial+fibrosis:+How+traditional+Chinese+medicine+can+help+addressing+unmet+therapeutical+needs.">Hypertensive heart disease and myocardial fibrosis: How traditional Chinese medicine can help addressing unmet therapeutical needs.</a> Pharmacological Research. 185, 106515 (2022).</li><li>Zhang, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+Chinese+medicine+intervenes+ventricular+remodeling+following+acute+myocardial+infarction:+evidence+from+40+random+controlled+trials+with+3,659+subjects.">Traditional Chinese medicine intervenes ventricular remodeling following acute myocardial infarction: evidence from 40 random controlled trials with 3,659 subjects.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 707394 (2021).</li><li>Hao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+Chinese+medicine+for+cardiovascular+disease:+evidence+and+potential+mechanisms.">Traditional Chinese medicine for cardiovascular disease: evidence and potential mechanisms.</a> Journal of the American College of Cardiology. 69 (24), 2952-2966 (2017).</li><li>Delgado-Montero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+stasis+imaging+predicts+cerebral+microembolism+during+acute+myocardial+infarction.">Blood stasis imaging predicts cerebral microembolism during acute myocardial infarction.</a> Journal of the American Society of Echocardiography. 33 (3), 389-398 (2020).</li><li>Lu, C. 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T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting.">Western blotting.</a> Methods. 38 (4), 283-293 (2006).</li><li>Chen, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+flavonoids+of+rhizoma+drynariae+restore+the+MMP/TIMP+balance+in+models+of+osteoarthritis+by+inhibiting+the+activation+of+the+NF-&#954;B+and+PI3K/AKT+pathways.">Total flavonoids of rhizoma drynariae restore the MMP/TIMP balance in models of osteoarthritis by inhibiting the activation of the NF-&#954;B and PI3K/AKT pathways.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 6634837 (2021).</li><li>Amin, A., Hamza, A. A., Bajbouj, K., Ashraf, S. S., Daoud, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saffron:+a+potential+candidate+for+a+novel+anticancer+drug+against+hepatocellular+carcinoma.">Saffron: a potential candidate for a novel anticancer drug against hepatocellular carcinoma.</a> Hepatology. 54 (3), 857-867 (2011).</li><li>Kamalipour, M., Akhondzadeh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+effects+of+saffron:+an+evidence-based+review.">Cardiovascular effects of saffron: an evidence-based review.</a> The Journal of Tehran Heart Center. 6 (2), 59-61 (2011).</li><li>Mani, V., Lee, S. K., Yeo, Y., Hahn, B. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+mechanism+of+PINK1.">Activation mechanism of PINK1.</a> Nature. 602 (7896), 328-335 (2022).</li><li>Nguyen, T. N., Padman, B. S., Lazarou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+molecular+signals+of+PINK1/Parkin+mitophagy.">Deciphering the molecular signals of PINK1/Parkin mitophagy.</a> Trends in Cell Biology. 26 (10), 733-744 (2016).</li><li>Yamada, T., Dawson, T. M., Yanagawa, T., Iijima, M., Sesaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SQSTM1/p62+promotes+mitochondrial+ubiquitination+independently+of+PINK1+and+PRKN/parkin+in+mitophagy.">SQSTM1/p62 promotes mitochondrial ubiquitination independently of PINK1 and PRKN/parkin in mitophagy.</a> Autophagy. 15 (11), 2012-2018 (2019).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(4th+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition).</a> Autophagy. 17 (1), 1 (2021).</li></ol>

L’exploration d’ingrédients efficaces à partir de composés complexes de médicaments naturels grâce à une technologie de pointe a été un point chaud de la recherche en MTC29 et peut fournir des preuves de laboratoire pour le développement futur de médicaments après vérification. Le carthame est un médicament représentatif dans le traitement de « favoriser la circulation sanguine et de minimiser la stase sanguine » et est largement utilisé dans le traitement de l’infarctus d...

L’infarctus aigu du myocarde (IAM) est une nécrose myocardique potentiellement mortelle causée par une ischémie et une hypoxie sévères et persistantes des artères coronaires 1,2. L’intervention coronarienne percutanée (ICP) est l’une des stratégies thérapeutiques de première intention pour l’IAM et protège généralement les cardiomyocytes contre les lésions ischémiques 3,4. Le myocarde distal manquera d’apport de sang et d’oxygène s’il n’est pas traité rapidement et efficacement après un IAM, ce qui entraîne une nécrose ischémique et d’autres complications cardiovasculaires 5,6. La promotion de la récupération des cardiomyocytes et la minimisation des lésions myocardiques irréversibles après avoir manqué l’opportunité chirurgicale PCI ont été un point chaud de la recherche. Après IAM, les cardiomyocytes sont dans un état d’ischémie et d’hypoxie, ce qui entraîne l’inhibition de la phosphorylation oxydative mitochondriale, la réduction du NAD+ en NADPH et l’augmentation de la réduction d’un seul électron7. En conséquence, la réaction de réduction incomplète de l’oxygène génère un excès d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et conduit finalement à des dommages de stress oxydatif aux cardiomyocytes8. Une accumulation excessive de ROS déclenche une peroxydation lipidique, perturbant davantage la structure et la fonction des membranes mitochondriales. Le résultat est une ouverture continue des pores de transition de perméabilité mitochondriale et une diminution du potentiel de la membrane mitochondriale, induisant l’apoptose et la nécrose.
Les inhibiteurs de l’enzyme de conversion de l’angiotensine (ECA), les antagonistes des récepteurs de l’angiotensine (ARA), les inhibiteurs des récepteurs β-adrénergiques, les antagonistes de l’aldostérone et d’autres médicaments standard dans l’IAM peuvent aider à améliorer la fonction cardiaque après un infarctus du myocarde et prévenir l’apparition d’événements malins, tels que les arythmies et le remodelage ventriculaire gauche9. Cependant, la survie et le pronostic post-infarctus sont grandement affectés par la taille de l’infarctus, et des résultats satisfaisants n’ont pas été obtenus pour réduire l’apoptose des cardiomyocytes10,11. Ainsi, le développement de médicaments pour favoriser la récupération des cardiomyocytes après un infarctus du myocarde est devenu un problème urgent.
La médecine traditionnelle est une source d’inspiration pour la recherche pharmaceutique moderne depuis de nombreuses années12,13,14,15. La médecine traditionnelle chinoise (MTC) a une longue histoire dans le traitement de l’IAM, et une série d’essais contrôlés randomisés au cours des dernières années ont confirmé que la MTC peut effectivement améliorer le pronostic des patients16,17. Selon la théorie de la MTC, l’IAM est causée par la stase sanguine18,19, de sorte que les médicaments pour favoriser la circulation sanguine sont généralement utilisés pour le traitement de l’IAM dans la phase aiguë20. Parmi eux, le safran est censé avoir un effet puissant sur l’activation sanguine et la stase, et est souvent utilisé dans le traitement aigu de l’IAM. La crocétine, un composant majeur du safran, pourrait jouer un rôle clé dans la protection des cardiomyocytes21.
Dans cette étude, les cellules myocardiques H9c2 ont été induitespar H 2 O2 pour simuler l’ischémie / reperfusion myocardique, qui provoque une lésion cardiomyocytaire de l’IAM, et la crocétine a été utilisée comme intervention pour étudier son effet protecteur contre les lésions myocardiques induites par le stress oxydatif. Le mécanisme de la crocétine protégeant les cardiomyocytes a été exploré plus avant par mitophagie. Plus important encore, cet article fournit une référence pour l’approche technique de l’étude de la mitophagie et décrit l’ensemble de la procédure expérimentale en détail.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2323363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V900929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x protein loading buffer</td>
			<td>Beijing Pulilai Gene Technology</td>
			<td>B1030-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C3011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZF-0514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZF-0513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-free blocking solution</td>
			<td>CST</td>
			<td>15019s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Parkin antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-32282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PINK1 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A11435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TOM20 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A19403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-actin&#160; antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>AC026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>KeyGEN Biotech</td>
			<td>KGP902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood cell counting plate</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>WG607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAT assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A007-1-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence detection system</td>
			<td>Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory</td>
			<td>ChemiScope 6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A032-1-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme Q10 (CoQ 10)</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>C6129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crocetin</td>
			<td>Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>RFS-Z01802006012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI-containing antifluorescence quenching tablets</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZLI-9557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCFH-DA</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>S0033S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D8371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>8122091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution</td>
			<td>NCM Biotech</td>
			<td>P10100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning-Cellgro</td>
			<td>35-081-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 7.0&#160;</td>
			<td>https://www.graphpad.com/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH-Px assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A005-1-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9c2 myocardial cells</td>
			<td>Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd.</td>
			<td>CS0062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZB-2305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZB-2301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit</td>
			<td>LABLEAD</td>
			<td>J22202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A020-2-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A003-2-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>A2114057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perhydrol</td>
			<td>G-clone</td>
			<td>CS7730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor</td>
			<td>CWBIO</td>
			<td>CW2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>R0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE gels</td>
			<td>Shanghai Epizyme Biomedical Technology</td>
			<td>PG112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE running buffer powder</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G2018-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE transfer buffer powder</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G2017-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOD assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A001-2-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered saline powder</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G0001-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SLCC9172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUNEL apoptosis assay kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8220</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protection of h9c2 myocardial cells from oxidative stress by crocetin via pink1/parkin pathway-mediated mitophagy

Cette étude visait à explorer l’effet protecteur contre le stress oxydatif de la crocétine sur les cellules myocardiques H9c2 médiéespar H2O2 par le biais d’expériences in vitro, et à explorer davantage si son mécanisme est lié à l’impact de la mitophagie. Cette étude visait également à démontrer l’effet thérapeutique de l’acide carthame sur le stress oxydatif dans les cardiomyocytes et à explorer si son mécanisme est lié à l’effet de la mitophagie. Ici, un modèlede stress oxydatif basé sur H 2 O2 a été construit et a évalué le degré de lésion de stress oxydatif des cardiomyocytes en détectant les niveaux de lactate déshydrogénase (LDH), de créatine kinase (CK), de malondialdéhyde (MDA), de superoxyde dismutase (SOD), de catalase (CAT) et de glutathion peroxydase (GSH Px). Le colorant fluorescent DCFH-DA, JC-1 et TUNEL ont été utilisés pour évaluer les dommages mitochondriaux et l’apoptose. Le flux autophagique a été mesuré par transfectation de l’adénovirus Ad-mCherry-GFP-LC3B. Des protéines liées à la mitophagie ont ensuite été détectées par transfert Western et immunofluorescence. Cependant, la crocétine (0,1-10 μM) pourrait améliorer considérablement la viabilité cellulaire et réduire l’apoptose et les dommages causés par le stress oxydatif causés par H2O2. Dans les cellules à activation autophagique excessive, la crocétine pourrait également réduire le flux d’autophagie et l’expression des protéines liées à la mitophagie PINK1 et Parkin, et inverser le transfert de Parkin aux mitochondries. La crocétine pouvait réduire les dommages causés par le stress oxydatif médié par H2O2 et l’apoptose des cellules H9c2, et son mécanisme était étroitement lié à la mitophagie.

Effets de la crocétine sur la viabilité cellulaire La crocétine à 0,1 μM, 0,5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM et 100 μM avait un effet prolifératif significatif sur les cellules, tandis que la crocétine à des concentrations supérieures à 200 μM inhibait significativement la prolifération des cellules H9c2 (Figure 1A). Après 4 h de traitement avec 400 μMH2O2, la viabilité cellulaire a été considérablement réduite, et la crocétin...

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Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy

Basée sur des expériences in vitro , cette étude a révélé le mécanisme de la crocétine dans la réparation des dommages causés par le stress oxydatif des cardiomyocytes en influençant la mitophagie, dans laquelle la voie de signalisation PINK1 / Parkin joue un rôle important.

Protection des cellules myocardiques H9c2 contre le stress oxydatif par la crocétine via la mitophagie médiée par la voie PINK1/Parkin

This study aimed to explore the oxidative stress-protective effect of crocetin on H2O2-mediated H9c2 myocardial cells through in vitro experiments, and ...

Ce protocole fournit une référence pour l’approche technique de l’étude des autophages et décrit en détail l’ensemble des procédures expérimentales. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’observation en longueur du changement de flux autophagique. Avant de commencer l’expérience, déterminez la concentration effective de l’infection et prenez les mesures de sécurité nécessaires.Commencez par centrifuger les cellules myocardiques H9C2 neutralisées à 179G pendant cinq minutes à température ambiante. Jeter le surnageant et mélanger les cellules dans le milieu complet DMEM en soufflant doucement. Divisez les cellules en neuf proportions égales.Ajouter le sulfoxyde de diméthyle au groupe témoin. Ensuite, ajoutez des concentrations variables de crocétine aux groupes restants. Ensemencez 100 microlitres de cellules par puits dans une plaque de 96 puits.Une fois incubé pendant 24 heures, jetez le surnageant. Ensuite, lavez les cellules trois fois avec du PBS. Ajouter 100 microlitres de milieu basal DMEM à chaque puits et incuber les cellules pendant quatre heures à 37 degrés Celsius.Maintenant, ajoutez 20 microlitres de MTS et incuber pendant deux heures supplémentaires comme démontré. Enfin, mesurez l’absorbance à 490 nanomètres et calculez la viabilité cellulaire. Pour déterminer les ROS, diluer le DCFH-DA dans un rapport de 1:1000 avec le milieu sans sérum.Jetez le surnageant de la cellule d’une plaque de 48 puits, préalablement ensemencée avec des cellules H9C2. Ensuite, lavez les cellules deux fois avec un milieu sans sérum. Ajoutez 150 microlitres de DCFH-DA dilué à chaque puits et incuberez-le à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes.Ensuite, lavez les cellules trois fois avec un milieu sans sérum. Enfin, capturez des images à l’aide d’un microscope à fluorescence. Pour analyser le potentiel de la membrane mitochondriale, ajoutez la solution de travail JC-1 aux cellules précédemment cultivées et mélangez bien.Incuber à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ensuite, lavez les cellules deux fois avec un tampon de coloration JC-1. Ajoutez un support complet à chaque puits et capturez des photographies à l’aide d’un microscope à fluorescence.Fixez les cellules avec une solution de fixation cellulaire pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, lavez-les avec PBS une fois. Ajouter 0,3% Triton-100 à chaque puits et incuber à température ambiante pendant cinq minutes.Après deux lavages PBS, ajoutez la solution de détection TUNEL à chaque puits et incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans l’obscurité pendant 60 minutes. Ajoutez un DAPI contenant un comprimé de trempe anti-fluorescence et capturez les images comme démontré. Remplacer la moitié du milieu des cellules précédemment cultivées par un milieu frais dans chaque puits d’une plaque de 48 puits.Ajouter l’adénovirus mCherry GFP-LC3B suivi de polybrène pour améliorer l’efficacité de l’infection. Remplacez le milieu toutes les 24 heures. À l’aide simultanée d’un microscope confocal, observer l’expression des protéines fluorescentes pour confirmer l’infection.Une fois infectées, cultivez et capturez les cellules comme décrit dans le manuscrit. Commencez par fixer les cellules préalablement cultivées avec 4% de paraformaldéhyde pendant 10 minutes à température ambiante et ajoutez 0,1% Triton-100. Ensuite, bloquez les cellules avec une solution de bloc sans animaux pendant une heure.Ensuite, incuber avec un anticorps primaire à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, ajoutez un anticorps secondaire fluorescent aux cellules et incuberez-les dans l’obscurité pendant une heure. Enfin, ajoutez le DAPI contenant des comprimés de trempe anti-fluorescence avant de capturer les images.Dans la présente étude, la crocétine a eu un effet prolifératif significatif sur les cellules. Alors qu’une concentration supérieure à 200 micromolaires inhibait la prolifération des cellules H9C2. La viabilité cellulaire a été considérablement réduite après un traitement au peroxyde d’hydrogène.Cependant, la crocétine a inversé ce changement dans une certaine mesure. Le niveau accru de ROS après traitement au peroxyde d’hydrogène a été inversé par la crocétine dans une certaine mesure. Les résultats de fluorescence ont également confirmé une réduction des ROS avec la crocétine.En outre, l’ajout de crocétine a restauré les effondrements potentiels de la membrane mitochondriale causés par le traitement au peroxyde d’hydrogène. De même, l’apoptose a également été inversée par la crocétine. De plus, le prétraitement à la crocétine a inversé le flux d’autophagie des cardiomyocytes H9C2, induit par le traitement au peroxyde d’hydrogène.Le prétraitement à la crocétine a également réduit la translocation des mitochondries Parkin induite par le traitement au peroxyde d’hydrogène. Suite à cette procédure, le microscopie électronique peut également être utilisé pour observer directement un microphage, permettant une vue plus intuitive des mitochondries englouties par les autophagosomes.

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