Name: protection of h9c2 myocardial cells from oxidative stress by crocetin via pink1/parkin pathway-mediated mitophagy
Uploaded: 2023-05-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy at JoVE.com

Diese Studie wurde von der Beijing Natural Science Foundation (Nr. 7202119) und der National Natural Science Foundation of China (Nr. 82274380) unterstützt.

Die Experimente wurden im Labor für Physiologie der Pekinger Universität für Chinesische Medizin, China, durchgeführt. Alle Studienmethoden wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften der Universität Peking durchgeführt.
1. Zellkultur
<ol><li>Fügen Sie 10 % fötales Kälberserum und 1 % Penicillin/Streptomycin dem modifizierten Basismedium Eagle Medium (DMEM) von Dulbecco (mit 4,5 g/l D-Glucose, 4 g/l L-Glutamin und 110 mg/l Natriump...

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	<li>Anderson, J. L., Morrow, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myocardial+infarction.">Acute myocardial infarction.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).</li><li>Samsky, M. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+pharmacology+analysis+and+experimental+validation+to+investigate+the+mechanism+of+total+flavonoids+of+rhizoma+drynariae+in+treating+rheumatoid+arthritis.">Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of rhizoma drynariae in treating rheumatoid arthritis.</a> Drug Design, Development, and Therapy. 16, 1743-1766 (2022).</li><li>Wei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+Chinese+medicine+has+great+potential+as+candidate+drugs+for+lung+cancer:+A+review.">Traditional Chinese medicine has great potential as candidate drugs for lung cancer: A review.</a> Journal of Ethnopharmacology. 300, 115748 (2023).</li><li>Zhi, W., Liu, Y., Wang, X., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+of+traditional+Chinese+medicine+for+the+prevention+and+treatment+of+atherosclerosis.">Recent advances of traditional Chinese medicine for the prevention and treatment of atherosclerosis.</a> Journal of Ethnopharmacology. 301, 115749 (2023).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertensive+heart+disease+and+myocardial+fibrosis:+How+traditional+Chinese+medicine+can+help+addressing+unmet+therapeutical+needs.">Hypertensive heart disease and myocardial fibrosis: How traditional Chinese medicine can help addressing unmet therapeutical needs.</a> Pharmacological Research. 185, 106515 (2022).</li><li>Zhang, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+Chinese+medicine+intervenes+ventricular+remodeling+following+acute+myocardial+infarction:+evidence+from+40+random+controlled+trials+with+3,659+subjects.">Traditional Chinese medicine intervenes ventricular remodeling following acute myocardial infarction: evidence from 40 random controlled trials with 3,659 subjects.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 707394 (2021).</li><li>Hao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+Chinese+medicine+for+cardiovascular+disease:+evidence+and+potential+mechanisms.">Traditional Chinese medicine for cardiovascular disease: evidence and potential mechanisms.</a> Journal of the American College of Cardiology. 69 (24), 2952-2966 (2017).</li><li>Delgado-Montero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+stasis+imaging+predicts+cerebral+microembolism+during+acute+myocardial+infarction.">Blood stasis imaging predicts cerebral microembolism during acute myocardial infarction.</a> Journal of the American Society of Echocardiography. 33 (3), 389-398 (2020).</li><li>Lu, C. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+mechanism+of+PINK1.">Activation mechanism of PINK1.</a> Nature. 602 (7896), 328-335 (2022).</li><li>Nguyen, T. N., Padman, B. S., Lazarou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+molecular+signals+of+PINK1/Parkin+mitophagy.">Deciphering the molecular signals of PINK1/Parkin mitophagy.</a> Trends in Cell Biology. 26 (10), 733-744 (2016).</li><li>Yamada, T., Dawson, T. M., Yanagawa, T., Iijima, M., Sesaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SQSTM1/p62+promotes+mitochondrial+ubiquitination+independently+of+PINK1+and+PRKN/parkin+in+mitophagy.">SQSTM1/p62 promotes mitochondrial ubiquitination independently of PINK1 and PRKN/parkin in mitophagy.</a> Autophagy. 15 (11), 2012-2018 (2019).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(4th+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition).</a> Autophagy. 17 (1), 1 (2021).</li></ol>

Die Erforschung wirksamer Inhaltsstoffe aus komplexen Verbindungen natürlicher Arzneimittel durch fortschrittliche Technologie ist ein Hotspot der TCM-Forschung29 und kann nach der Verifizierung Laborbeweise für die zukünftige Arzneimittelentwicklung liefern. Distel ist ein repräsentatives Medikament bei der Behandlung von "Förderung der Durchblutung und Minimierung von Blutstau" und wird häufig bei der Behandlung von Myokardinfarkt eingesetzt30,31<sup clas...

Der akute Myokardinfarkt (AMI) ist eine lebensbedrohliche Myokardnekrose, die durch eine schwere und anhaltende Ischämie und Hypoxie der Koronararterien verursacht wird 1,2. Die perkutane Koronarintervention (PCI) ist eine der ersten Therapiestrategien bei AMI und schützt die Kardiomyozyten in der Regel vor ischämischen Schäden 3,4. Dem distalen Myokard fehlt es an Blut- und Sauerstoffversorgung, wenn es nicht umgehend und effektiv nach AMI behandelt wird, was zu ischämischen Nekrosen und weiteren kardiovaskulären Komplikationen führt 5,6. Die Förderung der Erholung von Kardiomyozyten und die Minimierung irreversibler Myokardschäden nach verpasster PCI-Chirurgie war ein Forschungsschwerpunkt. Nach AMI befinden sich die Kardiomyozyten in einem Zustand der Ischämie und Hypoxie, was zu einer Hemmung der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung, einer Reduktion von NAD+ zu NADPH und einer verstärkten Einzelelektronenreduktion führt7. Infolgedessen erzeugt die unvollständige Reduktionsreaktion von Sauerstoff einen Überschuss an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und führt schließlich zu einer Schädigung der Kardiomyozyten durch oxidativen Stress8. Eine übermäßige Anhäufung von ROS löst eine Lipidperoxidation aus, die die Struktur und Funktion der mitochondrialen Membranen weiter stört. Das Ergebnis ist eine kontinuierliche Öffnung der Übergangsporen der mitochondrialen Permeabilität und eine Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials, was Apoptose und Nekrose induziert.
ACE-Hemmer (Angiotensin-Converting-Enzyme), Angiotensin-Rezeptor-Blocker (ARBs), die Inhibitoren von β-Adrenozeptoren, Aldosteron-Antagonisten und andere Standardmedikamente bei AMI können dazu beitragen, die Herzfunktion nach einem Myokardinfarkt zu verbessern und das Auftreten bösartiger Ereignisse wie Arrhythmien und linksventrikuläres Remodeling zu verhindern9. Das Überleben und die Prognose nach einem Infarkt werden jedoch stark von der Infarktgröße beeinflusst, und es wurden keine zufriedenstellenden Ergebnisse zur Verringerung der Apoptose von Kardiomyozyten erzielt10,11. Daher ist die Entwicklung von Medikamenten zur Förderung der Erholung von Kardiomyozyten nach einem Myokardinfarkt zu einem dringenden Thema geworden.
Die traditionelle Medizin ist seit vielen Jahren eine Inspirationsquelle für die moderne pharmazeutische Forschung12,13,14,15. Die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) hat eine lange Geschichte in der Behandlung von AMI, und eine Reihe von randomisierten kontrollierten Studien in den letzten Jahren hat bestätigt, dass TCM tatsächlich die Prognose von Patienten verbessern kann16,17. Nach der TCM-Theorie wird AMI durch Blutstauungverursacht 18,19, daher werden zur Behandlung von AMI in der akuten Phase20 in der Regel durchblutungsfördernde Medikamente eingesetzt. Unter ihnen wird angenommen, dass Safran eine starke Wirkung auf die Blutaktivierung und -stase hat und häufig bei der Akutbehandlung von AMI eingesetzt wird. Crocetin, ein Hauptbestandteil von Safran, könnte eine Schlüsselrolle beim Schutz von Kardiomyozyten spielen21.
In dieser Studie wurden H9c2-Myokardzellen durchH2O2induziert, um eine myokardiale Ischämie/Reperfusion zu simulieren, die eine Kardiomyozytenschädigung der AMI verursacht, und Crocetin wurde als Intervention verwendet, um seine schützende Wirkung gegen oxidativen Stress induzierte Myokardschädigung zu untersuchen. Der Mechanismus, den Crocetin vor Kardiomyozyten schützt, wurde durch Mitophagie weiter erforscht. Noch wichtiger ist, dass dieser Artikel eine Referenz für den technischen Ansatz zur Untersuchung der Mitophagie bietet und den gesamten experimentellen Ablauf im Detail beschreibt.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2323363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V900929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x protein loading buffer</td>
			<td>Beijing Pulilai Gene Technology</td>
			<td>B1030-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C3011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZF-0514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZF-0513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-free blocking solution</td>
			<td>CST</td>
			<td>15019s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Parkin antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-32282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PINK1 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A11435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TOM20 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A19403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-actin&#160; antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>AC026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>KeyGEN Biotech</td>
			<td>KGP902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood cell counting plate</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>WG607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAT assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A007-1-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence detection system</td>
			<td>Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory</td>
			<td>ChemiScope 6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A032-1-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme Q10 (CoQ 10)</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>C6129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crocetin</td>
			<td>Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>RFS-Z01802006012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI-containing antifluorescence quenching tablets</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZLI-9557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCFH-DA</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>S0033S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D8371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>8122091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution</td>
			<td>NCM Biotech</td>
			<td>P10100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning-Cellgro</td>
			<td>35-081-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 7.0&#160;</td>
			<td>https://www.graphpad.com/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH-Px assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A005-1-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9c2 myocardial cells</td>
			<td>Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd.</td>
			<td>CS0062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZB-2305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZB-2301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit</td>
			<td>LABLEAD</td>
			<td>J22202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A020-2-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A003-2-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>A2114057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perhydrol</td>
			<td>G-clone</td>
			<td>CS7730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor</td>
			<td>CWBIO</td>
			<td>CW2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>R0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE gels</td>
			<td>Shanghai Epizyme Biomedical Technology</td>
			<td>PG112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE running buffer powder</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G2018-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE transfer buffer powder</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G2017-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOD assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A001-2-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered saline powder</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G0001-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SLCC9172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUNEL apoptosis assay kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8220</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protection of h9c2 myocardial cells from oxidative stress by crocetin via pink1/parkin pathway-mediated mitophagy

Ziel dieser Studie war es, die oxidative stressschützende Wirkung von Crocetin auf H2O2-vermittelte H9c2-Myokardzellen durch in vitro Experimente zu untersuchen und weiter zu untersuchen, ob sein Mechanismus mit dem Einfluss der Mitophagie zusammenhängt. Diese Studie zielte auch darauf ab, die therapeutische Wirkung von Distelsäure auf oxidativen Stress in Kardiomyozyten zu demonstrieren und zu untersuchen, ob ihr Mechanismus mit der Wirkung der Mitophagie zusammenhängt. In dieser Arbeit wurde ein H2O2-basiertes Modell für oxidativen Stress konstruiert und der Grad der oxidativen Stressschädigung von Kardiomyozyten durch Detektion der Konzentrationen von Laktatdehydrogenase (LDH), Kreatinkinase (CK), Malondialdehyd (MDA), Superoxiddismutase (SOD), Katalase (CAT) und Glutathionperoxidase (GSH Px) bewertet. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS)-detektierende Fluoreszenzfarbstoffe DCFH-DA, JC-1 und TUNEL-Farbstoffe wurden verwendet, um mitochondriale Schäden und Apoptose zu beurteilen. Der autophagische Fluss wurde durch Transfizierung des Ad-mCherry-GFP-LC3B-Adenovirus gemessen. Mitophagie-verwandte Proteine wurden dann mittels Western Blot und Immunfluoreszenz nachgewiesen. Crocetin (0,1-10 μM) könnte jedoch die Lebensfähigkeit der Zellen signifikant verbessern und die Apoptose und die durchH2O2verursachten Schäden durch oxidativen Stress reduzieren. In Zellen mit übermäßiger autophagischer Aktivierung könnte Crocetin auch den Autophagiefluss und die Expression der Mitophagie-verwandten Proteine PINK1 und Parkin reduzieren und den Transfer von Parkin in die Mitochondrien umkehren. Crocetin konnte H2O2-vermittelte oxidative Stressschäden und die Apoptose von H9c2-Zellen reduzieren, und sein Mechanismus war eng mit der Mitophagie verbunden.

Auswirkungen von Crocetin auf die Lebensfähigkeit der Zellen Crocetin in 0,1 μM, 0,5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM und 100 μM hatte eine signifikante proliferative Wirkung auf die Zellen, während Crocetin in Konzentrationen über 200 μM die Proliferation von H9c2-Zellen signifikant hemmte (Abbildung 1A). Nach 4 h Behandlung mit 400 μMH2O2war die Zellviabilität deutlich reduziert, und Crocetin konnte diese Veränderung bis zu einem gewissen Grad rück...

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Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy

Basierend auf in vitro Experimenten enthüllte diese Studie den Mechanismus von Crocetin bei der Reparatur von oxidativen Stressschäden von Kardiomyozyten durch Beeinflussung der Mitophagie, bei der der PINK1/Parkin-Signalweg eine wichtige Rolle spielt.

Schutz von H9c2-Myokardzellen vor oxidativem Stress durch Crocetin über den PINK1/Parkin-Signalweg vermittelte Mitophagie

This study aimed to explore the oxidative stress-protective effect of crocetin on H2O2-mediated H9c2 myocardial cells through in vitro experiments, and ...

Dieses Protokoll bietet eine Referenz für den technischen Ansatz zur Untersuchung von Autophagen und beschreibt die gesamten experimentellen Abläufe im Detail. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Längenbeobachtung der Änderung des autophagischen Flusses ermöglicht. Bestimmen Sie vor Beginn des Experiments die effektive Infektionskonzentration und ergreifen Sie die erforderlichen Sicherheitsmaßnahmen.Beginnen Sie mit der Zentrifugation neutralisierter H9C2-Myokardzellen bei 179 G für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand und mischen Sie die Zellen durch leichtes Blasen in DMEM-Komplettmedium. Teilen Sie die Zellen in neun gleiche Proportionen.Fügen Sie der Kontrollgruppe Dimethylsulfoxid hinzu. Fügen Sie dann den verbleibenden Gruppen unterschiedliche Konzentrationen von Crocetin hinzu. Säen Sie 100 Mikroliter Zellen pro Well in einer 96-Well-Platte.Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden wird der Überstand entsorgt. Waschen Sie die Zellen dann dreimal mit PBS. Geben Sie 100 Mikroliter DMEM-Basalmedium in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Zellen vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius.Fügen Sie nun 20 Mikroliter MTS hinzu und inkubieren Sie weitere zwei Stunden wie gezeigt. Messen Sie schließlich die Absorption bei 490 Nanometern und berechnen Sie die Zellviabilität. Um die ROS zu bestimmen, wird DCFH-DA im Verhältnis 1:1000 mit dem serumfreien Medium verdünnt.Verwerfen Sie den Überstand der Zelle von einer 48-Well-Platte, die zuvor mit H9C2-Zellen besiedelt wurde. Waschen Sie die Zellen dann zweimal mit einem serumfreien Medium. In jede Vertiefung werden 150 Mikroliter verdünntes DCFH-DA gegeben und 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert.Waschen Sie die Zellen anschließend dreimal mit serumfreiem Medium. Nehmen Sie schließlich Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop auf. Um das Potenzial der mitochondrialen Membran zu analysieren, fügen Sie den zuvor kultivierten Zellen JC-1-Arbeitslösung hinzu und mischen Sie sie gut.Inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten. Waschen Sie die Zellen dann zweimal mit JC-1 Färbepuffer. Fügen Sie jedem Well ein komplettes Medium hinzu und nehmen Sie Fotos mit einem Fluoreszenzmikroskop auf.Fixieren Sie die Zellen mit Zellfixierlösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie sie dann einmal mit PBS. Geben Sie 0,3 % Triton-100 in jede Vertiefung und inkubieren Sie es fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.Geben Sie nach zwei PBS-Waschungen die TUNEL-Detektionsarbeitslösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Zellen 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius im Dunkeln. Fügen Sie DAPI hinzu, das eine Anti-Fluoreszenz-Löschtablette enthält, und nehmen Sie die Bilder wie gezeigt auf. Ersetzen Sie die Hälfte des Mediums aus den zuvor kultivierten Zellen durch frisches Medium in jeder Vertiefung einer 48-Well-Platte.Fügen Sie das mCherry GFP-LC3B-Adenovirus gefolgt von Polybren hinzu, um die Infektionseffizienz zu verbessern. Tauschen Sie das Medium alle 24 Stunden aus. Beobachten Sie gleichzeitig mit einem konfokalen Mikroskop die fluoreszierende Proteinexpression, um die Infektion zu bestätigen.Nach der Infektion kultivieren und fangen Sie die Zellen wie im Manuskript beschrieben ein. Beginnen Sie mit der Fixierung zuvor kultivierter Zellen mit 4%Paraformaldehyd für 10 Minuten bei Raumtemperatur und fügen Sie 0,1%Triton-100 hinzu. Als nächstes blockieren Sie die Zellen für eine Stunde mit einer tierfreien Blocklösung.Inkubieren Sie sie dann über Nacht mit einem Primärantikörper bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag geben Sie einen fluoreszierenden Sekundärantikörper in die Zellen und inkubieren sie eine Stunde lang im Dunkeln. Fügen Sie schließlich die DAPI hinzu, die Anti-Fluoreszenz-Löschtabletten enthält, bevor Sie die Bilder aufnehmen.In der vorliegenden Studie hatte Crocetin eine signifikante proliferative Wirkung auf die Zellen. Eine Konzentration von über 200 Mikromolar hemmte die Proliferation von H9C2-Zellen. Die Zellviabilität war nach der Wasserstoffperoxid-Behandlung deutlich reduziert.Crocetin machte diese Veränderung jedoch bis zu einem gewissen Grad rückgängig. Der erhöhte ROS-Spiegel nach der Wasserstoffperoxidbehandlung wurde durch Crocetin bis zu einem gewissen Grad rückgängig gemacht. Die Fluoreszenzergebnisse bestätigten auch eine reduzierte ROS mit Crocetin.Darüber hinaus stellte Crocetin zusätzlich die kollabierenden Mitochondrienmembran-Potentialkollapse wieder her, die durch die Wasserstoffperoxid-Behandlung verursacht wurden. In ähnlicher Weise wurde die Apoptose auch durch Crocetin rückgängig gemacht. Darüber hinaus kehrte die Crocetin-Vorbehandlung den Autophagiefluss von H9C2-Kardiomyozyten um, der durch die Wasserstoffperoxid-Behandlung induziert wurde.Die Crocetin-Vorbehandlung reduzierte auch die Translokation von Parkin-Mitochondrien, die durch die Wasserstoffperoxid-Behandlung induziert wurde. Nach diesem Verfahren kann die Elektronenmikroskopie auch zur direkten Beobachtung eines Mikrophagen verwendet werden, was eine intuitivere Sicht auf Mitochondrien ermöglicht, die von Autophagosomen verschlungen werden.

Research

JoVE Journal

Medicine

Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy

Acute Myocardial Infarction in Rats

Akuter Myokardinfarkt bei Ratten

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular ...

Forschung

Medizin

Development of a Unilaterally-lesioned 6-OHDA Mouse Model of Parkinson's Disease

Entwicklung eines Einseitig-läsionierten 6-OHDA Mausmodell der Parkinson-Krankheit

The unilaterally lesioned 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned rat model of Parkinson's disease (PD) has proved to be invaluable in advancing our ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolation, Charakterisierung und vergleichende Differenzierung humaner Dental Pulp Stammzellen aus bleibenden Zähne mit zwei verschiedenen Methoden abgeleitet

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Cardiac Stress Test Induced by Dobutamine and Monitored by Cardiac Catheterization in Mice

Cardiac Stress Test durch Dobutamin induziert und Überwacht durch Herzkatheter in Mäuse

Dobutamine is a &beta;-adrenergic agonist with an affinity higher for receptor expressed in the heart (&beta;1) than for receptors expressed in the ...

Ultrasonic Assessment of Myocardial Microstructure

Ultraschall-Bewertung der myokarddialen Mikrostruktur

Echocardiography is a widely accessible imaging modality that is commonly used to noninvasively characterize and quantify changes in cardiac structure and ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro und In Vivo Nachweis von Mitophagy in menschlichen Zellen, C. Elegansund Mäuse

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Visualisierung von endogenen Mitophagie-Komplexen in Situ in menschlichen Pankreas-Betazellen unter Verwendung von Proximity Ligation Assay

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In vitro Assessment of Myocardial Protection following Hypothermia-Preconditioning in a Human Cardiac Myocytes Model

In-vitro-Bewertung des Myokardschutzes nach Hypothermie-Vorkonditionierung in einem Human-Herz-Myozyten-Modell

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Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induktion und Analyse von oxidativem Stress in Dornröschen-Transposon-transfizierten menschlichen retinalen Pigmentepithelzellen

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...

Utilizing Percutaneous Ventricular Assist Devices in Acute Myocardial Infarction Complicated by Cardiogenic Shock

Verwendung von perkutanen ventrikulären Unterstützungsgeräten bei akutem Myokardinfarkt, der durch kardiogenen Schock kompliziert ist

Cardiogenic shock is defined as persistent hypotension, accompanied by evidence of end organ hypo-perfusion. Percutaneous ventricular assist devices ...