Name: protection of h9c2 myocardial cells from oxidative stress by crocetin via pink1/parkin pathway-mediated mitophagy
Uploaded: 2023-05-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי הקרן למדעי הטבע של בייג'ינג (מס '7202119) והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '82274380).

הניסויים בוצעו במעבדה לפיזיולוגיה באוניברסיטת בייג'ינג לרפואה סינית, סין. כל שיטות הלימוד בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות של אוניברסיטת בייג'ינג.
1. תרבית תאים
<ol><li>הוסף 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין למדיום הבסיסי Eagle medium (DMEM) של Dulbecco (עם 4.5 גרם/לי...

<ol>
	<li>Anderson, J. L., Morrow, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myocardial+infarction.">Acute myocardial infarction.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).</li><li>Samsky, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiogenic+shock+after+acute+myocardial+infarction:+a+review.">Cardiogenic shock after acute myocardial infarction: a review.</a> JAMA. 326 (18), 1840-1850 (2021).</li><li>Abbate, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+cardiac+remodeling+benefits+in+patients+undergoing+late+percutaneous+coronary+intervention+of+the+infarct-related+artery:+evidence+from+a+meta-analysis+of+randomized+controlled+trials.">Survival and cardiac remodeling benefits in patients undergoing late percutaneous coronary intervention of the infarct-related artery: evidence from a meta-analysis of randomized controlled trials.</a> Journal of the American College of Cardiology. 51 (9), 956-964 (2008).</li><li>Santoro, G. M., Carrabba, N., Migliorini, A., Parodi, G., Valenti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+heart+failure+in+patients+with+acute+myocardial+infarction+treated+with+primary+percutaneous+coronary+intervention.">Acute heart failure in patients with acute myocardial infarction treated with primary percutaneous coronary intervention.</a> European Journal of Heart Failure. 10 (8), 780-785 (2008).</li><li>Dhruva, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+use+of+an+intravascular+microaxial+left+ventricular+assist+device+vs+intra-aortic+balloon+pump+with+in-hospital+mortality+and+major+bleeding+among+patients+with+acute+myocardial+infarction+complicated+by+cardiogenic+shock.">Association of use of an intravascular microaxial left ventricular assist device vs intra-aortic balloon pump with in-hospital mortality and major bleeding among patients with acute myocardial infarction complicated by cardiogenic shock.</a> JAMA. 323 (8), 734-745 (2020).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+associated+with+major+cardiovascular+events+1+year+after+acute+myocardial+infarction.">Risk factors associated with major cardiovascular events 1 year after acute myocardial infarction.</a> JAMA Network Open. 1 (4), e181079 (2018).</li><li>Jou, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+protects+against+common+deletion+of+mitochondrial+DNA-augmented+mitochondrial+oxidative+stress+and+apoptosis.">Melatonin protects against common deletion of mitochondrial DNA-augmented mitochondrial oxidative stress and apoptosis.</a> Journal of Pineal Research. 43 (4), 389-403 (2007).</li><li>La Piana, G., Fransvea, E., Marzulli, D., Lofrumento, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+supported+by+exogenous+cytochrome+c+oxidation+mimics+the+early+stages+of+apoptosis.">Mitochondrial membrane potential supported by exogenous cytochrome c oxidation mimics the early stages of apoptosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 246 (2), 556-561 (1998).</li><li>De Filippo, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+secondary+prevention+medical+therapies+on+outcomes+of+patients+suffering+from+Myocardial+Infarction+with+NonObstructive+Coronary+Artery+disease+(MINOCA):+A+meta-analysis.">Impact of secondary prevention medical therapies on outcomes of patients suffering from Myocardial Infarction with NonObstructive Coronary Artery disease (MINOCA): A meta-analysis.</a> International Journal of Cardiology. 368, 1-9 (2022).</li><li>Davidson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multitarget+strategies+to+reduce+myocardial+ischemia/reperfusion+injury:+JACC+review+topic+of+the+week.">Multitarget strategies to reduce myocardial ischemia/reperfusion injury: JACC review topic of the week.</a> Journal of the American College of Cardiology. 73 (1), 89-99 (2019).</li><li>Caricati-Neto, A., Errante, P. R., Menezes-Rodrigues, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+pharmacological+and+non-pharmacological+strategies+of+cardioprotection.">Recent advances in pharmacological and non-pharmacological strategies of cardioprotection.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 4002 (2019).</li><li>Chen, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+pharmacology+analysis+and+experimental+validation+to+investigate+the+mechanism+of+total+flavonoids+of+rhizoma+drynariae+in+treating+rheumatoid+arthritis.">Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of rhizoma drynariae in treating rheumatoid arthritis.</a> Drug Design, Development, and Therapy. 16, 1743-1766 (2022).</li><li>Wei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+Chinese+medicine+has+great+potential+as+candidate+drugs+for+lung+cancer:+A+review.">Traditional Chinese medicine has great potential as candidate drugs for lung cancer: A review.</a> Journal of Ethnopharmacology. 300, 115748 (2023).</li><li>Zhi, W., Liu, Y., Wang, X., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+of+traditional+Chinese+medicine+for+the+prevention+and+treatment+of+atherosclerosis.">Recent advances of traditional Chinese medicine for the prevention and treatment of atherosclerosis.</a> Journal of Ethnopharmacology. 301, 115749 (2023).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertensive+heart+disease+and+myocardial+fibrosis:+How+traditional+Chinese+medicine+can+help+addressing+unmet+therapeutical+needs.">Hypertensive heart disease and myocardial fibrosis: How traditional Chinese medicine can help addressing unmet therapeutical needs.</a> Pharmacological Research. 185, 106515 (2022).</li><li>Zhang, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+Chinese+medicine+intervenes+ventricular+remodeling+following+acute+myocardial+infarction:+evidence+from+40+random+controlled+trials+with+3,659+subjects.">Traditional Chinese medicine intervenes ventricular remodeling following acute myocardial infarction: evidence from 40 random controlled trials with 3,659 subjects.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 707394 (2021).</li><li>Hao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+Chinese+medicine+for+cardiovascular+disease:+evidence+and+potential+mechanisms.">Traditional Chinese medicine for cardiovascular disease: evidence and potential mechanisms.</a> Journal of the American College of Cardiology. 69 (24), 2952-2966 (2017).</li><li>Delgado-Montero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+stasis+imaging+predicts+cerebral+microembolism+during+acute+myocardial+infarction.">Blood stasis imaging predicts cerebral microembolism during acute myocardial infarction.</a> Journal of the American Society of Echocardiography. 33 (3), 389-398 (2020).</li><li>Lu, C. Y., Lu, P. C., Chen, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+trends+in+traditional+Chinese+medicine+for+acute+myocardial+infarction.">Utilization trends in traditional Chinese medicine for acute myocardial infarction.</a> Journal of Ethnopharmacology. 241, 112010 (2019).</li><li>Gao, Z. Y., Xu, H., Shi, D. Z., Wen, C., Liu, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+on+outcome+of+5284+patients+with+coronary+artery+disease:+the+role+of+integrative+medicine.">Analysis on outcome of 5284 patients with coronary artery disease: the role of integrative medicine.</a> Journal of Ethnopharmacology. 141 (2), 578-583 (2012).</li><li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crocetin+ester+improves+myocardial+ischemia+via+Rho/ROCK/NF-kappaB+pathway.">Crocetin ester improves myocardial ischemia via Rho/ROCK/NF-kappaB pathway.</a> International Immunopharmacology. 38, 186-193 (2016).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+cell+number+by+hemocytometry+counting.">Estimation of cell number by hemocytometry counting.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (11), (2019).</li><li>Zeng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+potential+value+and+mechanism+of+Kaji-Ichigoside+F1+on+arsenite-induced+skin+cell+senescence.">Assessing the potential value and mechanism of Kaji-Ichigoside F1 on arsenite-induced skin cell senescence.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 9574473 (2022).</li><li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+mitochondria+with+JC-1.">Labeling mitochondria with JC-1.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).</li><li>Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., Kioussi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+apoptosis+by+TUNEL+assay.">Detection of apoptosis by TUNEL assay.</a> Methods in Molecular Biology. 887, 41-47 (2012).</li><li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitate+impairs+the+autophagic+flux+to+induce+p62-dependent+apoptosis+through+the+upregulation+of+CYLD+in+NRCMs.">Palmitate impairs the autophagic flux to induce p62-dependent apoptosis through the upregulation of CYLD in NRCMs.</a> Toxicology. 465, 153032 (2022).</li><li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting.">Western blotting.</a> Methods. 38 (4), 283-293 (2006).</li><li>Chen, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+flavonoids+of+rhizoma+drynariae+restore+the+MMP/TIMP+balance+in+models+of+osteoarthritis+by+inhibiting+the+activation+of+the+NF-&#954;B+and+PI3K/AKT+pathways.">Total flavonoids of rhizoma drynariae restore the MMP/TIMP balance in models of osteoarthritis by inhibiting the activation of the NF-&#954;B and PI3K/AKT pathways.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 6634837 (2021).</li><li>Amin, A., Hamza, A. A., Bajbouj, K., Ashraf, S. S., Daoud, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saffron:+a+potential+candidate+for+a+novel+anticancer+drug+against+hepatocellular+carcinoma.">Saffron: a potential candidate for a novel anticancer drug against hepatocellular carcinoma.</a> Hepatology. 54 (3), 857-867 (2011).</li><li>Kamalipour, M., Akhondzadeh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+effects+of+saffron:+an+evidence-based+review.">Cardiovascular effects of saffron: an evidence-based review.</a> The Journal of Tehran Heart Center. 6 (2), 59-61 (2011).</li><li>Mani, V., Lee, S. K., Yeo, Y., Hahn, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+metabolic+perspective+and+opportunities+in+pharmacologically+important+safflower.">A metabolic perspective and opportunities in pharmacologically important safflower.</a> Metabolites. 10 (6), 253 (2020).</li><li>Broadhead, G. K., Chang, A., Grigg, J., McCluskey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+saffron+supplementation:+current+clinical+findings.">Efficacy and safety of saffron supplementation: current clinical findings.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (16), 2767-2776 (2016).</li><li>Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+protective+effect+of+salidroside+against+H2O2-induced+injury+in+H9C2+cells.">Insight into the protective effect of salidroside against H2O2-induced injury in H9C2 cells.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1060271 (2021).</li><li>Chen, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+rhizoma+drynariae+targets+in+the+treatment+of+osteoarthritis+based+on+network+pharmacology+and+experimental+verification.">Prediction of rhizoma drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 5233462 (2021).</li><li>Reers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+monitored+by+JC-1+dye.">Mitochondrial membrane potential monitored by JC-1 dye.</a> Methods in Enzymology. 260, 406-417 (1995).</li><li>Radovits, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribose)+polymerase+inhibition+improves+endothelial+dysfunction+induced+by+reactive+oxidant+hydrogen+peroxide+in+vitro.">Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves endothelial dysfunction induced by reactive oxidant hydrogen peroxide in vitro.</a> European Journal of Pharmacology. 564 (1-3), 158-166 (2007).</li><li>Song, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdependence+of+parkin-mediated+mitophagy+and+mitochondrial+fission+in+adult+mouse+hearts.">Interdependence of parkin-mediated mitophagy and mitochondrial fission in adult mouse hearts.</a> Circulation Research. 117 (4), 346-351 (2015).</li><li>Gan, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+mechanism+of+PINK1.">Activation mechanism of PINK1.</a> Nature. 602 (7896), 328-335 (2022).</li><li>Nguyen, T. N., Padman, B. S., Lazarou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+molecular+signals+of+PINK1/Parkin+mitophagy.">Deciphering the molecular signals of PINK1/Parkin mitophagy.</a> Trends in Cell Biology. 26 (10), 733-744 (2016).</li><li>Yamada, T., Dawson, T. M., Yanagawa, T., Iijima, M., Sesaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SQSTM1/p62+promotes+mitochondrial+ubiquitination+independently+of+PINK1+and+PRKN/parkin+in+mitophagy.">SQSTM1/p62 promotes mitochondrial ubiquitination independently of PINK1 and PRKN/parkin in mitophagy.</a> Autophagy. 15 (11), 2012-2018 (2019).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(4th+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition).</a> Autophagy. 17 (1), 1 (2021).</li></ol>

חקר מרכיבים יעילים מתרכובות מורכבות של תרופות טבעיות באמצעות טכנולוגיה מתקדמת היה מוקד חם של מחקר TCM29, והוא יכול לספק ראיות מעבדה לפיתוח תרופות עתידיות לאחר אימות. חריע היא תרופה מייצגת בטיפול ב"קידום זרימת הדם ומזעור קיפאון הדם" והיא נמצאת בשימוש נרחב בטיפול באוטם שריר הלב<sup...

אוטם שריר הלב חריף (AMI) הוא נמק שריר הלב מסכן חיים הנגרם על ידי איסכמיה חמורה ומתמשכת והיפוקסיה לעורקים הכליליים 1,2. התערבות כלילית מלעורית (PCI) היא אחת האסטרטגיות הטיפוליות הקו הראשון עבור AMI, ובדרך כלל מגנה על קרדיומיוציטים מפני נזק איסכמי 3,4. שריר הלב הדיסטלי יהיה חסר אספקת דם וחמצן אם לא יטופל במהירות וביעילות לאחר AMI, מה שמוביל לנמק איסכמי וסיבוכים קרדיווסקולריים נוספים 5,6. קידום התאוששות קרדיומיוציטים ומזעור נזק בלתי הפיך לשריר הלב לאחר החמצת ההזדמנות הניתוחית PCI היה נקודה חמה מחקרית. לאחר AMI, קרדיומיוציטים נמצאים במצב של איסכמיה והיפוקסיה, וכתוצאה מכך עיכוב של זרחן חמצוני מיטוכונדריאלי, הפחתה של NAD+ ל-NADPH, והפחתה מוגברת של אלקטרונים בודדים7. כתוצאה מכך, תגובת ההפחתה החלקית של חמצן יוצרת עודף של מיני חמצן תגובתי (ROS) ובסופו של דבר מובילה לנזק לעקה חמצונית לקרדיומיוציטים8. הצטברות מוגזמת של ROS גורמת לחמצון שומנים, ומשבשת עוד יותר את המבנה והתפקוד של קרומי המיטוכונדריה. התוצאה היא פתיחה מתמשכת של נקבוביות המעבר בחדירות המיטוכונדריה וירידה בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית, מה שגורם לאפופטוזיס ונמק.
מעכבי אנזים ממיר אנגיוטנסין (ACE), חוסמי קולטן אנגיוטנסין (ARBs), מעכבי β-אדרנוצפטורים, אנטגוניסטים לאלדוסטרון ותרופות סטנדרטיות אחרות ב-AMI יכולים לסייע בשיפור תפקוד הלב לאחר אוטם שריר הלב ולמנוע התרחשות של אירועים ממאירים, כגון הפרעות קצב ועיצוב מחדש של החדר השמאלי9. עם זאת, הישרדות לאחר אוטם ופרוגנוזה מושפעים מאוד מגודל האוטם, ולא הושגו תוצאות משביעות רצון להפחתת אפופטוזיסקרדיומיוציטים 10,11. לפיכך, פיתוח תרופות לקידום התאוששות קרדיומיוציטים לאחר אוטם שריר הלב הפך לנושא דחוף.
הרפואה המסורתית מהווה מקור השראה למחקר הפרמצבטי המודרני מזה שניםרבות 12,13,14,15. לרפואה הסינית המסורתית (TCM) יש היסטוריה ארוכה בטיפול ב- AMI, וסדרה של מחקרי בקרה אקראיים בשנים האחרונות אישרו כי TCM אכן יכול לשפר את הפרוגנוזה של חולים16,17. על פי תיאוריית TCM, AMI נגרמת על ידי קיפאון דם18,19, ולכן תרופות לקידום זרימת הדם משמשות בדרך כלל לטיפול ב- AMI בשלב החריף20. ביניהם, זעפרן הוא האמין יש השפעה חזקה על הפעלת הדם קיפאון, והוא משמש לעתים קרובות בטיפול חריף של AMI. Crocetin, מרכיב עיקרי של זעפרן, עשוי לשחק תפקיד מפתח בהגנה cardiomyocytes21.
במחקר זה, תאי שריר הלב H9c2 הושרו על ידי H 2 O2כדי לדמות איסכמיה / רפרפוזיה של שריר הלב, הגורמת לפגיעה קרדיומיוציטים של AMI, וקרוצטין שימש כהתערבות כדי לחקור את השפעתו המגנה מפני פגיעה חמצונית הנגרמת על ידי לחץ שריר הלב. המנגנון של קרוצטין המגן על קרדיומיוציטים נחקר עוד יותר באמצעות מיטופגיה. חשוב מכך, מאמר זה מספק התייחסות לגישה הטכנית לחקר המיטופגיה ומתאר בפירוט את כל הליך הניסוי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2323363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V900929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x protein loading buffer</td>
			<td>Beijing Pulilai Gene Technology</td>
			<td>B1030-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C3011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZF-0514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZF-0513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-free blocking solution</td>
			<td>CST</td>
			<td>15019s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Parkin antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-32282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PINK1 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A11435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TOM20 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A19403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-actin&#160; antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>AC026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>KeyGEN Biotech</td>
			<td>KGP902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood cell counting plate</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>WG607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAT assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A007-1-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence detection system</td>
			<td>Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory</td>
			<td>ChemiScope 6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A032-1-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme Q10 (CoQ 10)</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>C6129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crocetin</td>
			<td>Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>RFS-Z01802006012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI-containing antifluorescence quenching tablets</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZLI-9557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCFH-DA</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>S0033S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D8371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>8122091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution</td>
			<td>NCM Biotech</td>
			<td>P10100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning-Cellgro</td>
			<td>35-081-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 7.0&#160;</td>
			<td>https://www.graphpad.com/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH-Px assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A005-1-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9c2 myocardial cells</td>
			<td>Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd.</td>
			<td>CS0062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZB-2305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZB-2301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit</td>
			<td>LABLEAD</td>
			<td>J22202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A020-2-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A003-2-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>A2114057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perhydrol</td>
			<td>G-clone</td>
			<td>CS7730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor</td>
			<td>CWBIO</td>
			<td>CW2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>R0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE gels</td>
			<td>Shanghai Epizyme Biomedical Technology</td>
			<td>PG112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE running buffer powder</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G2018-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE transfer buffer powder</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G2017-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOD assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A001-2-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered saline powder</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G0001-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SLCC9172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUNEL apoptosis assay kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8220</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protection of h9c2 myocardial cells from oxidative stress by crocetin via pink1/parkin pathway-mediated mitophagy

מחקר זה נועד לחקור את ההשפעה החמצונית המגנה על עקה של קרוצטין על תאי שריר הלב H9c2 בתיווךH 2 O2באמצעות ניסויים במבחנה, ולחקור עוד יותר אם המנגנון שלו קשור להשפעה של מיטופגיה. מחקר זה נועד גם להדגים את ההשפעה הטיפולית של חומצה חריע על עקה חמצונית בקרדיומיוציטים ולחקור האם המנגנון שלה קשור להשפעת מיטופגיה. כאן, מודל עקה חמצונית מבוסס H 2 O2נבנה והעריך את מידת הפגיעה בעקה חמצונית של קרדיומיוציטים על ידי זיהוי רמות של לקטט דהידרוגנאז (LDH), קריאטין קינאז (CK), מלונדיאלדהיד (MDA), סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD), קטלאז (CAT) וגלוטתיון פרוקסידאז (GSH Px). מיני חמצן תגובתי (ROS) - זיהוי צבע פלואורסצנטי DCFH-DA, JC-1 צבע וצבע טונל שימשו להערכת נזק מיטוכונדריאלי ואפופטוזיס. שטף אוטופגי נמדד על ידי הדבקת אדנווירוס Ad-mCherry-GFP-LC3B. חלבונים הקשורים למיטופגיה זוהו לאחר מכן באמצעות כתמים מערביים ואימונופלואורסנציה. עם זאת, קרוצטין (0.1-10 מיקרומטר) יכול לשפר באופן משמעותי את כדאיות התא ולהפחית אפופטוזיס ונזקי עקה חמצונית הנגרמים על ידי H 2 O2. בתאים עם הפעלה אוטופגית מוגזמת, קרוצטין יכול גם להפחית את זרימת האוטופגיה ואת הביטוי של חלבונים הקשורים למיטופגיה PINK1 ופרקין, ולהפוך את העברת פרקין למיטוכונדריה. קרוצטין יכול להפחית את נזקי העקה החמצונית בתיווך H 2 O2ואת האפופטוזיס של תאי H9c2, והמנגנון שלו היה קשור קשר הדוק למיטופגיה.

השפעות של crocetin על כדאיות התא קרוצטין ב-0.1 מיקרומטר, 0.5 מיקרומטר, 1 מיקרומטר, 5 מיקרומטר, 10 מיקרומטר, 50 מיקרומטר ו-100 מיקרומטר השפיע באופן משמעותי על התאים, בעוד שלקרוצטין בריכוזים מעל 200 מיקרומטר הייתה השפעה משמעותית על השגשוג של תאי H9c2 (איור 1A). לאחר 4 שעות של טיפול עם ...

Watch this Scientific Journal Video about Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy at JoVE.com

Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy

בהתבסס על ניסויים במבחנה , מחקר זה חשף את המנגנון של קרוצטין בתיקון נזקי עקה חמצונית של קרדיומיוציטים על ידי השפעה על מיטופגיה, שבה מסלול האיתות PINK1/Parkin ממלא תפקיד חשוב.

הגנה על תאי שריר הלב H9c2 מפני עקה חמצונית על ידי קרוצטין באמצעות מיטופגיה בתיווך מסלול PINK1/Parkin

This study aimed to explore the oxidative stress-protective effect of crocetin on H2O2-mediated H9c2 myocardial cells through in vitro experiments, and ...

פרוטוקול זה מספק התייחסות לגישת הטכניקה לחקר אוטופאגים והוא מתאר בפירוט את כל הליכי הניסוי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת תצפית אורך של השינוי בשטף אוטופגי. לפני תחילת הניסוי, לקבוע את ריכוז הזיהום היעיל ונקיטת אמצעי הבטיחות הדרושים.התחילו בצנטריפוגה של תאי שריר הלב H9C2 מנוטרלים במשקל 179G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנאטנט וערבבו את התאים במדיום המלא של DMEM על ידי נשיפה עדינה. חלק את התאים לתשעה פרופורציות שוות.הוסף dimethyl sulfoxide לקבוצת הביקורת. לאחר מכן, להוסיף ריכוזים משתנים של crocetin לקבוצות הנותרות. זרע 100 מיקרוליטר של תאים לכל באר בצלחת 96 באר.לאחר הדגירה במשך 24 שעות, להשליך את supernatant. לאחר מכן, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום בסיסי DMEM לכל באר ודגר על התאים במשך ארבע שעות ב 37 מעלות צלזיוס.עכשיו, להוסיף 20 מיקרוליטר של MTS ולדגור עוד שעתיים כפי שהודגם. לבסוף, למדוד את הספיגה ב 490 ננומטר ולחשב את כדאיות התא. כדי לקבוע ROS, יש לדלל DCFH-DA ביחס של 1:1000 עם התווך נטול הסרום.השליכו את הסופרנאטנט של התא מצלחת בת 48 בארות, שנזרעה בעבר עם תאי H9C2. לאחר מכן, שטפו את התאים פעמיים עם מדיום ללא סרום. מוסיפים 150 מיקרוליטר DCFH-DA מדולל לכל באר ודגרים עליה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.לאחר מכן, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם מדיום ללא סרום. לבסוף, צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כדי לנתח את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית, הוסיפו תמיסת עבודה JC-1 לתאים שגודלו בעבר בתרבית וערבבו היטב.לדגור אותם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. לאחר מכן, שטפו את התאים פעמיים עם חיץ צביעה JC-1. הוסף מדיום שלם לכל באר וצלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.תקן את התאים עם תמיסת קיבוע תאים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף אותם עם PBS פעם אחת. מוסיפים 0.3% טריטון-100 לכל באר ודגרים בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.לאחר שתי שטיפות PBS, הוסף פתרון עבודה לזיהוי TUNEL לכל באר ודגר על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחושך למשך 60 דקות. הוסף DAPI המכיל לוח מרווה נגד פלואורסצנטיות וצלם את התמונות כפי שהודגם . החלף מחצית מהמדיום מהתאים שגודלו בעבר בתרבית בתווך טרי בכל באר של צלחת בת 48 בארות.הוסף את mCherry GFP-LC3B אדנווירוס ואחריו פוליברן כדי לשפר את יעילות הזיהום. החלף את המדיום כל 24 שעות. בו זמנית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, לצפות ביטוי חלבון פלואורסצנטי כדי לאשר זיהום.לאחר ההדבקה, תרבית ותלכוד את התאים כמתואר בכתב היד. התחל על ידי תיקון תאים בתרבית בעבר עם 4% paraformaldehyde במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולהוסיף 0.1% Triton-100. לאחר מכן, חסום את התאים עם פתרון בלוק ללא בעלי חיים למשך שעה אחת.לאחר מכן, לדגור אותם עם נוגדן ראשוני בארבע מעלות צלזיוס במשך הלילה. למחרת, הוסיפו נוגדן משני פלואורסצנטי לתאים ודגרו עליהם בחושך למשך שעה. לבסוף, הוסף את DAPI המכיל טבליות מרווה נגד פלואורסצנטיות לפני לכידת התמונות.במחקר הנוכחי, לקרוצטין הייתה השפעה משמעותית על התאים. בעוד ריכוז מעל 200 מיקרומולר עיכב את התפשטות תאי H9C2. כדאיות התא הופחתה במידה ניכרת לאחר טיפול במי חמצן.עם זאת, קרוצטין הפך את השינוי הזה במידה מסוימת. רמת ה- ROS המשופרת לאחר טיפול במי חמצן התהפכה במידה מסוימת על ידי קרוצטין. תוצאות הפלואורסצנטיות אישרו גם ירידה ב- ROS עם קרוצטין.יתר על כן, תוספת קרוצטין שיקמה את הקריסה הפוטנציאלית של הממברנה המיטוכונדריאלית שנגרמה על ידי טיפול במי חמצן. באופן דומה, אפופטוזיס היה גם הפוך על ידי crocetin. בנוסף, הטיפול המקדים של קרוצטין הפך את זרימת האוטופגיה של קרדיומיוציטים H9C2, המושרה עקב טיפול במי חמצן.טיפול מקדים של קרוצטין גם הפחית את הטרנסלוקציה של מיטוכונדריה פרקין הנגרמת על ידי טיפול במי חמצן. בעקבות הליך זה, מיקרוסקופי אלקטרונים יכול לשמש גם כדי לצפות ישירות במיקרופג, מה שמאפשר מבט אינטואיטיבי יותר על מיטוכונדריה שנבלעים על ידי אוטופגוזומים.

Research

JoVE Journal

Medicine

Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy

Acute Myocardial Infarction in Rats

באוטם שריר הלב אצל חולדות

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular ...

Development of a Unilaterally-lesioned 6-OHDA Mouse Model of Parkinson's Disease

פיתוח מודל חד צדדי, lesioned מאוס 6-OHDA של מחלת פרקינסון

The unilaterally lesioned 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned rat model of Parkinson's disease (PD) has proved to be invaluable in advancing our ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

בידוד, אפיון והשוואתי התמיינות של תאי גזע אנושיים שיניים זולות נגזרה שיניים קבועות על ידי שימוש בשתי שיטות שונות

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Cardiac Stress Test Induced by Dobutamine and Monitored by Cardiac Catheterization in Mice

בדיקת מאמץ לב הנגרמת על ידי Dobutamine ופיקוח על ידי צנתור בעכברים

Dobutamine is a &beta;-adrenergic agonist with an affinity higher for receptor expressed in the heart (&beta;1) than for receptors expressed in the ...

Ultrasonic Assessment of Myocardial Microstructure

הערכה אולטרה סאונד של מיקרו-מבנה שריר הלב

Echocardiography is a widely accessible imaging modality that is commonly used to noninvasively characterize and quantify changes in cardiac structure and ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

במבחנה and In Vivo זיהוי של Mitophagy ב תאים אנושיים, C. Elegansועכברים

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

ויזואליזציה של מתחמי מיטוגניים אנדוגני באתרו בתאי בטא הלבלב האנושי ניצול שיטת סמיכות הקירבה

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

In vitro Assessment of Myocardial Protection following Hypothermia-Preconditioning in a Human Cardiac Myocytes Model

אין ויטרו הערכה של הגנה שריר הלב בעקבות היפותרמיה-תנאים מקדים במודל מיוציטים לב אנושי

Ischemia/reperfusion-derived myocardial dysfunction is a common clinical scenario in patients after cardiac surgery. In particular, the sensitivity of ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

אינדוקציה וניתוח של עקה חמצונית ב היפהפייה הנרדמת טרנספוסון-transposon-transfected תאי אפיתל פיגמנט רשתית אנושית

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...

Utilizing Percutaneous Ventricular Assist Devices in Acute Myocardial Infarction Complicated by Cardiogenic Shock

שימוש במכשירי סיוע חדרית עורית באוטם שריר הלב חריף מסובך על ידי הלם קרדיוגני

Cardiogenic shock is defined as persistent hypotension, accompanied by evidence of end organ hypo-perfusion. Percutaneous ventricular assist devices ...